ABA Uygulaması Altında Hsp Gen Ailesi Üyelerinin

Hsp ailelerine ait genlerin ABA uygulaması karşısında ifade seviyelerindeki değişim gerçek zamanlı-PZR analizleri ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar Şekil 4.11’ de gösterilmiştir.

Şekil 4.15. ABA uygulaması karşısında CssHsp, CsHsp40 ve CsHsp60 genlerinin ifade seviyelerinin değişimleri

123

Şekil 4.16. Şekil 4.15. ABA uygulaması karşısında CsHsp70, CsHsp90 ve CsHsp100 genlerinin ifade seviyelerinin değişimleri

124

Isı şoku proteini ailesi üyelerinin absisik asit uygulaması sonucunda ifade seviyelerindeki değişimler aşağıda anlatıldığı gibidir. CssHsp-08 geninin ifadesi 12. saate kadar başlangıç seviyesinin 3-4 kat üzerinde seyretmiştir ve 12. saatte başlangıç seviyesine gerilemiştir. Kökteyse 1. saatte 5 katlık bir artış gösteren gen ifadesi daha sonra kademeli olarak azalarak 12. saatte yok denecek kadar az bir seviyeye gelmiştir. CssHsp-09 geninin yapraktaki ifadesi 1. saatte 6,5 katlık bir artış gösteren gen ifadesi daha sonra kademeli olarak azalarak 12. saatte yok denecek kadar az bir seviyeye gelmiştir. Genin kökteki ifadesindeyse kayda değer bir değişiklik görülmemiştir. CsHsp40-19 geninin yapraktaki ifadesi 1. saate 12 kat artmıştır ve bu artış 3. saatte de devam etmiştir, 6. saatteyse 4 kata düşerek 12. saatte başlangıç seviyesine gerilemiştir. Kökteyse 1. saatte 15 katına çıkan gen ifadesi 3. ve 6. saatlerde 4 kat civarına gerilemişlerdir ancak 12. saatte başlangıç seviyesinin 12 katına yükselmiştir. CsHsp40-70 geninin ifadesi 12. saate kadar başlangıç seviyesinin 8-10 katı kadar bir seviyede gözlenmiştir ancak 12. saatte başlangıç seviyesinin altına düşmüştür. Kökteyse gen ifadesinin 1. saatte 3 kat yükselmesi dışında kayda değer bir değişiklik gözlenmemiştir. CsHsp60-05 geninin yapraktaki ifadesi 1. ve 3. saatlerde başlangıç seviyesinin 3-4 katına kadar yükselmiştir, ardından azalarak 12. saatte başlangıç seviyesine düşmüştür. Kökteyse 6. saatte başlangıç seviyesinin 2 katına çıkan gen ifadesi dışında kayda değer bir değişim gözlenmemiştir. CsHsp60-23 geninin yapraktaki ifadesi 1. ve 3. saatlerde başlangıç seviyesinin 3-4 kat fazlası olarak gözlenmiştir, 6. saat ile birlikte azalarak 12. saatte başlangıç seviyesine gerilemiştir. Kökteyse 6. saatte başlangıç seviyesinin 2 katına kadar yükselen bir gen ifadesi dışında kayda değer bir değişim gözlenmemiştir. CsHsp70-06 geninin yapraktaki ifadesi ilk saatte yaklaşık 6 kat artmıştır, ardından 3. ve 6. saatlerde başlangıç seviyesinin yaklaşık 3 katı olacak bir gen ifadesi gözlenmiştir ve 12. saatte başlangıç seviyesine gerilemiştir. Kökteyse gen ifadesi kademeli olarak artarak 6. saatte başlangıç seviyesinin 14 katına ulaşmıştır ve 12. saatte başlangıç seviyesinin 2 katına kadar gerilemiştir. CsHsp70-10 geninin yapraktaki ifadesi kademeli bir artış ve azalış göstermiştir, 3. saatte başlangıç seviyesinin yaklaşık 2,5 katına ulaşmıştır. Kökteyse bu genin ifadesinde kayda değer bir değişim gözlenmemiştir. CsHsp90-02 geninin yapraktaki ifadesi 1. saatte 3 kat artmıştır, 3. ve 6. saatlerde başlangıç seviyesinin 2- 2,5 katı kadar gözlenen gen ifadesi 12. saatte başlangıç seviyesinin altına düşmüştür. Kökteyse 6. saatte başlangıç seviyesinin 2 katına çıkan bir gen ifadesi dışında kayda

125

değer bir değişiklik gözlenmemiştir. CsHsp90-03 geninin yapraktaki ifadesi ilk saatte yaklaşık 6 kat artmıştır, daha sonraysa başlangıç seviyesine yakın seyretmiştir. Kökteyse 3. ve 6. saatlerde başlangıç seviyesinin 3 katına kadar yükselen gen ifadesi 12. saatte başlangıç seviyesinin yaklaşık 2 katına kadar azalmıştır. CsHsp100-01 geninin yapraktaki ifadesi ilk saatte yaklaşık 7 kat artmıştır, 3. saatte başlangıç seviyesine gerilemiş ardından 6. saatte başlangıç seviyesinin 16 katına kadar yükselmiş ve 12. saatte başlangıç seviyesine gerilemiştir. Kökteyse 1. saatte yaklaşık 8 katlık bir artış gösteren gen ifadesi, 3. saatte başlangıç seviyesinin 25 katına 6. saatteyse 23 katına çıkmıştır ve 12. saatte başlangıç seviyesinin yaklaşık 16 katı kadar bir gen ifadesi gözlenmiştir. CsHsp100-04 geninin yapraktaki ifadesi kademeli olarak artarak 6. saatte başlangıç seviyesinin 11 katına ulaşmıştır, 12. saatteyse başlangıç seviyesine gerilemiştir. Kökteyse 6. saatte başlangıç seviyesinin 11 katına kadar artan bir gen ifadesi gözlenmiştir.

4.3. Tartışma ve Sonuç

Transkriptom verilerinin analizinden elde edilen ısı haritalarından gerçek zamanlı- PZR analizi ile çalışılmak üzere en yüksek ifade seviyesine sahip genler seçilmiştir. Elde edilen trankriptom verileri farklı dokularda salatalıkta bulunan genlerin ifadelerini içermektedir, bu dokular; döllenmiş ovaryum, döllenmemiş ovaryum, kök, gövde, yaprak, erkek çiçek, filiz, bazal filiz ve dişi çiçektir. Gerçek zamanlı-PZR ile ifadesi çalışılacak genler seçilirken kök ve yaprak başta olmak üzere tüm dokularda yüksek gen ifadesine sahip olan CsHsp genleri seçilmiştir. Her CsHsp ailesinden iki gen olacak şekilde seçilen genlerin ifadesi daha sonra gerçek zamanlı-PZR ile farklı stres koşullarında belli periyotlarla kök ve yaprak dokularında analiz edilmiştir. Genomik ölçekte bir gen ifadesi profillemesinin ana amaçlarından biri, incelenen organizma içinde farklı şekilde ifade edilen genlerin belirlenmesi ve farklı koşullar ya da durumlarla ilgili olabilecek muhtemel genlerin belirlenmesidir.

Cin darı bitkisinde yapılan bir çalışmada; araştırmacılar sHsp genlerinin özellikle yaprak dokusunda kuraklık stresine geç cevap mekanizmasında rol aldıklarını, gen ifadesinin artışının 24. saatte gerçekleştiğini gözlemlemişlerdir [103]. Bizim çalışmamızdaysa CssHsp-08 geninin en yüksek gen ifade seviyesinin 24. saatte olduğu

126

görülmüştür. Öyleyse sHsp genlerinin kuraklık karşısında stres faktörünün şiddetinin arttığı ya da stres sebepli hasar arttıktan sonra görev aldığı önerilebilir ve farklı fonksiyonel analizler ile doğrulanabilir. Aynı çalışmada araştırmacılar gen ifadesinin kök ve yaprak dokusunda farklı şekilde değişime uğradığını da gözlemlemişlerdir [103]. Patateste yapılan bir çalışmada araştırmacılar, StHsp genlerinin kuraklık stresi karşısında ifade seviyelerinin arttığını belirlemişlerdir [122]. Dallı darı bitkisinde yapılan bir çalışmadaysa araştırmacılar belirlemiş oldukları PvHsp20 genlerinin bir kısmının ifadesinin kuraklık stresi karşısında arttığını belirlemişlerdir ve bu genlerin kuraklık stresi ile ilişkili olabileceklerini önermişlerdir [132]. Bu bilgiler dahilinde, CssHsp-08 geninin kuraklık stresi ile ilgili olabileceği önerilebilir ve daha ileri fonksiyonel analizler ile doğrulanabilir.

Cindarı bitkisinde yapılmış olan bir çalışmada; tuzluluk stresine yanıt olarak SiHSP genlerinin ifade miktarlarının, duyarlı tür ile karşılaştırıldığında, genlerin çoğunun, toleranslı türlerin hem yaprak hem de gövdesinde eşit şekilde arttığını göstermişlerdir. Ayrıca tüm ısı şoku proteini ailelerinin bazı üyelerinin stres sonrası ölçüm yapılan üç zaman periyodunda da yüksek miktarda (380 kat,164 kat, 102 kat vb.) ifade artışı gösterdiğini belirlemişlerdir [103]. Patates bitkisinde yapılmış bir çalışmadaysa, patates bitkisinin genomunda belirlenen StHsp20 genlerinin bir kısmının ifadesinin tuzluluk stresi karşısında arttığını göstermişlerdir [122]. Dallı darı bitkisinde yapılmış bir çalışmada, araştırmacılar PvHsp20 genlerinin bir kısmının ifadesinin tuzluluk stresi karşısında arttığını belirlemişlerdir [132]. Çalışmamızda yüksek tuzluluk stresi karşısında ifadesi en çok dikkat çeken genler; CssHsp-08, CsHsp40-70, CsHsp60-05, CsHsp70-06, CsHsp90-02, CsHsp100-04 genleri olmuştur. Bizim çalışmamızda da cindarı bitkisinde [103] olduğu gibi CsHsp genleri farklı dokularda benzer artışlar göstermişlerdir. Ancak bu benzerlik Hsp60 ve Hsp90 ailesi için geçerli değildir. Buna ek olarak çalışılan CsHsp genlerinin küçük bir kısmı dışındakiler cindarı bitkisinde olduğu gibi tüm zaman periyotlarında yüksek ifade göstermişlerdir. Aynı durum 3. ve 24. saat örnekleri ile çalışılan dallı darı bitkisinde [132] de gözlenmiştir.

Çalışmamızda yüksek sıcaklık stresi karşısında ifadesi en çok dikkat çeken genler; CssHsp-09, CsHsp60-23, CsHsp70-10 genleri olmuştur. sHsp, Hsp60 ve Hsp70 ailesine üye genlerin, sıcaklık stresi karşısında ifadelerinin arttığını gösteren farklı

127

bitkilerde yapılmış çalışmalar literatürde mevcuttur [98, 103, 106, 122, 153]. Cin darı bitkisinde yapılmış olan çalışmada SiHsp70 genlerinden yüksek sıcaklık karşısında ifadesi büyük oranda değişen genlerin bir kısmının yalnızca yaprak dokusunda ifadelerinin olduğu araştırmacılar tarafından belirlenmiştir [103]. Çalışmamızda CsHsp70-10 geninin de aynı şekilde yalnızca yaprakta ifadesinin yüksek miktarda arttığı görülmüştür.

Çalışmamızda düşük sıcaklık stresi karşısında ifadesindeki değişiklikler en çok dikkat çeken genler; CssHsp-08, CsHsp40-70, CsHsp70-06 genleridir. Bitkilerde, membranın korunması ve protein agregasyonunun önlenmesi fonksiyonlarından dolayı ısı şoku proteinlerini soğuk stresi karşısında indüklendiğini belirten çalışmalar mevcuttur [154, 155]. Cin darı bitkisinde yapılmış bir çalışmada, araştırmacılar SiHsp genlerinin bir kısmının düşük sıcaklık stresi karşısında ifadelerinin yüksek miktarda arttığını göstermişlerdir. Dallı darı bitkisinde yapılmış bir başka çalışmada da PvHsp20 genlerinin bir kısmının düşük sıcaklık karşısında ifadelerinde büyük bir artış olduğu araştırmacılar tarafından belirlenmiştir [132]. Soya bitkisinde yapılmış bir çalışmada, araştırmacılar soya genomunda belirlemiş oldukları GmHsp20 genlerinin düşük sıcaklık stresi karşısındaki ifade artışının yüksek sıcaklık stresi karşısındaki ifade artışından daha zayıf olduğunu belirlemişlerdir [98]. Bizim çalışmamızda da CssHsp genlerinin yüksek sıcaklık karşısında daha yüksek bir ifade artışı gösterdikleri belirlenmiştir.

Çalışmamızda absisik asit karşısında ifade seviyesindeki değişimler en çok dikkat çeken genler; CssHsp-08, CsHsp40-19, CsHsp60-23, CsHsp70-06, CsHsp90-03, CsHsp100-01 genleridir. Kamışsı yumak (Festuca arundinacea) bitkisinde yapılan bir çalışmada araştırmacılar bazı FaHsp genlerinin ifadesinin ABA ile muamele karşısında arttığını belirlemişlerdir. Aynı genlerin sıcaklık stresi karşısında da ifadelerinin arttığını belirleyen araştırmacılar, absisik asitin bu bitkinin sıcaklık direnç mekanizmasında yer aldığını önermişlerdir [156]. Diğer yandan dallı darı bitkisinde yapılan bir çalışmadaysa, PvHsp20 genlerinin büyük bölümünün ABA muamelesi sonrası ifade seviyelerinin azaldığı belirlenmiştir ve bu genlerin farklı stres koşullarında ifade seviyelerindeki artışın ABA bağımlı olmadığını önerilmiştir [132]. Bu bilgiler ışığında absisik asitin salatalık bitkisinde belirli stres direnç

128

mekanizmalarında rol aldığı ve bazı CsHsp genlerinin ABA bağımlı olarak fonksiyon gösterdikleri önerilebilir.

Tüm bu gerçek zamanlı-PZR analizi sonuçarı değerlendirildiğinde; CsHsp40-70 geninin kuraklık, tuzluluk ve düşük sıcaklık karşısında, CsHsp70-06 geninin tuzluluk, düşük sıcaklık ve ABA karşısında, CssHsp-08 genininse kuraklık, tuzluluk, düşük sıcaklık ve ABA karşısında ifadesinin yüksek miktarda arttığı görülmüştür. Bu genler arasında hem 4 farklı stres koşulunda ifadesininin artması hem de ifadedeki artış miktarları değerlendirildiğinde strese karşı direnç açısından en büyük potansiyele sahip genin CssHsp-08 geni olduğu görülmektedir.

129 BÖLÜM III