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ativação celular por citometria de fluxo

Várias são as metodologias atualmente empregadas para quantificar a ativação e a proliferação celulares in vitro. Dentre elas, algumas utilizam componentes radioativos, os quais requerem precauções especiais de segurança, além de envolver várias etapas com grandes chances de erro. A redução de sais de tetrazólio, como o MTT constitui-se de metodologia alternativa, porém não permite estudos posteriores com as células, uma vez que compromete sua viabilidade. A citometria de fluxo surge como uma metodologia atraente, pois permite a manutenção das condições vitais das células, favorecendo investigações mais aprofundadas (JUNIOR et al, 2006). Devido a essa versatilidade, os marcadores de ativação foram investigados através dessa metodologia.

Marcadores de ativação são moléculas celulares cuja expressão pode ser induzida em células T, B e NK, dentre outras, através de estímulo provocado por patógenos durante a infecção ou por mitógenos (REA, MCNERLAN, ALEXANDER, 1999).

O CD69 é um dos marcadores de superfície celular expressos mais precocemente, o qual pode ser detectado em uma ou duas horas e sua expressão pode persistir por pelo menos três dias. A expressão do CD69 pode ser induzida na maioria das células hematopoéticas (ZIEGLER; RAMSDELL; ALDERSON, 1994). O CD25, a cadeia  do receptor de IL-2, é um marcador de ativação tardio, induzido durante a ativação da célula linfóide, alcançando pico de 96 horas após estímulo com PHA. É expresso em células T, B e monócitos ativados (DONG et al. 2010). O HLA-DR, antígeno do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) humano de

classe II, é expresso em células B, monócitos, macrófagos e aparece durante a fase tardia de ativação de células T e NK ativadas (TOMKINSON, 1987).

No presente estudo, foi analisado o efeito dos venenos brutos de B.

jararacussu, B. pirajai e suas respectivas toxinas serinoprotease e LAAO nos

linfócitos T, B e NK, onde foi verificada a capacidade destes de induzir ativação destas células através da quantificação dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR. Como controle de ativação foi utilizado o PHA, um mitógeno comumente utilizado, o qual é uma lectina de planta capaz de ativar células T e que quando ativa células T CD4+ _{é também capaz de induzir ativação de células B (CLEMENT, et al.,}

1983; LICASTRO, DAVIS, MORINI, 1993).

Através do presente estudo foi possível verificar que os venenos de serpentes e suas toxinas, promovem ativação de células T, como evidenciado pelo aumento da porcentagem de células T expressando CD25, CD69 e HLA-DR. Observou-se ativação preferencial das células CD4+.

O veneno bruto de B. jararacussu induziu aumento na porcentagem de células T CD4+ expressando CD25, CD69 e HLA-DR em quase todas as concentrações, enquanto que o mesmo não induziu aumento da porcentagem de células expressando HLA-DR nas concentrações de 6,25 e 12,5g/mL. Considerando que algumas concentrações deste veneno induziram aumentos na porcentagem de viabilidade nos ensaios do MTT, pode-se sugerir, novamente, provável indução de proliferação celular e subsequente ativação das células T CD4+.

São poucos os estudos sobre o efeito de venenos de serpentes e suas toxinas na imunidade celular. Estudo com três desintegrinas, isoladas de venenos de serpentes, flavovidin, isolada de Trimesurus flavoridis, kristin, isolada de

Agkistrondon rhodostome e echistatin, purificada de Echis carinatus, mostrou que

estas foram capazes de ativar células T humanas in vitro, aumentando a expressão do marcador de ativação precoce, CD69, na superfície da célula (NETO et al., 2007). Outro trabalho utilizando análise por citometria de fluxo mostrou que a cardiotoxina III, a principal cardiotoxina isolada do veneno da cobra Taiwan (Naja naja atra), aumenta significativamente a expressão de células CD4 e diminui a expressão de células CD8 e CD25 em linfócitos ativados com PHA, mas isso não ocorre em linfócitos não tratados (SU et al, 2003).

Como observado nos resultados deste trabalho, a expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando

incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, refletem ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai.

Através dos resultados é possível concluir que:

 As toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano enquanto que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. Os resultados obtidos estimulam investigações mais detalhadas para o esclarecimento dos mecanismos de ação e para o isolamento e identificação dos componentes responsáveis pelos efeitos observados.

 Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de

B. jararacussu foi citotóxico para PBMC, nas concentrações de 50 e

100µg/mL e que a serinoprotease apresenta baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto de B. pirajai e com LAAO exige ensaios adicionais que possam confirmar se esse veneno e sua toxina estão realmente provocando proliferação dessas células.

 A expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ _e

CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, refletem ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai.

ALMEIDA, J.O.; FIFE JR., E.H. Quantitatively standardized complement fixation methods for critical evaluation of antigens prepared from Trypanosoma cruzi. Pan

Am. Health Org. Science. Public. , v 319, 92p., 1976.

ALVES, R.M.; ANTONUCCI, G.A.; PAIVA, H.H.; CINTRA, A.C.; FRANCO, J.J.; MENDONÇA-FRANQUEIRO, E.P.; DORTA, D.J.; GIGLIO, J.R.; ROSA, J.C.; FULY, A.L.; DIAS-BARUFFI, M.; SOARES, A.M.; SAMPAIO, S.V. Evidence of caspase- mediated apoptosis induced by l-amino acid oxidase isolated from Bothrops atrox snake venom. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol., New York, v.151, p. 542-550, 2008.

ANDE, S.R.; KOMMOJU, P.R.; DRAXL, S.; MURKOVIC, M.; MACHEROUX, P.; GHISLA, S.; FERRANDO-MAY, E. Mechanisms of cell death by L-amino oxidase, a major component of ophidian venom. Apoptosis, London, v.11, p.1439-1451, 2006.

ARVÅ, E.; ANDERSSON, B. Kinetics of cytokine release and expression of lymphocyte cell-surface activation markers after in vitro stimulation of human peripheral blood mononuclear cells with Streptococcus pneumoniae. Scand. J.

Immunol., Oslo, v.49, p.237-243, 1999.

BERTAZZI, D.T.; DE ASSIS-PANDOCHI, A.I., TALHAFERRO, V.L.; CALEIRO SEIXAS AZZOLINI, A.E.; PEREIRA CROTT, L.S.; ARANTES, E.C. Activation of the complement system and leukocyte recruitment by Tityus serrulatus scorpion venom.

Int. Immunopharmacol., Amsterdam, v.5, p.1077-1084, 2005.

BOYDEN, S. The chemotatic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med., New York, v.115, p. 453-466, 1962.

BITENCOURT, C.S. Sistema complemento e resposta de produção de

anticorpos em ratos hipertireoideos. 2006. Tese (Doutorado em Ciências

Farmacêuticas) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. 111p.

BRAGA, M.D.; MARTINS, A.M.; AMORA, D.N.; DE MENEZES, D.B.; TOYAMA, M.H.; TOYAMA, D.O.; MARANGONI, S.; ALVES, C.D.; BARBOSA, P.S.; DE SOUSA ALVES, R.; FONTELES, M.C.; MONTEIRO, H.S. Purification and biological effects of L-amino acid oxidase isolated from Bothrops insularis venom. Toxicon, Oxford, v.51, p.199-207, 2008.

BURCHIEL, S.W.; LAUER, F.T.; GURULÉ, D.; MOUNHO, B.J.; SALAS, V.M. Uses and future applications of flow cytometry in immunotoxicity testing. Methods, v.19, p.28-35, 1999.

CARROLL, M.C. The complement system in regulation of adaptive immunity. Nat.

Immunol., New York, v.5, p.981-986, 2004.

CLEMENT, L.T.; DAGG, M.K.; LEHMEYER, J.E.; KIYOTAKI. Two phenotypically distinct suppressor T cell subpopulations inhibit the induction of B cell differentiation by phytohemagglutinin. J. Immunol. Baltimore, v. 131, p. 1214-1217, 1983

COLE, D.S., MORGAN, B.P. Beyond lysis: how complement influences cell fate.

Clin. Sci., London, v.104, p.455-466, 2003.

COLIGAN, J.E.; KRUISBEEK, A.M.; MARGULIES, D.H.; SHEVACH, E.M.; STROBER, W. Current Protocol in Immunology., New York, John Wiley & Sons, Inc., 1991.

COLLINS, D.P. Cytokine and cytokine receptor expression as a biological indicator of immune activation: important considerations in the development of in vitro model systems. J. Immunol. Methods, Amsterdam, v.243, p.125-145, 2000.

CORREA-NETTO, C.; TEIXEIRA-ARAUJO, R.; AGUIAR, A.S.; MELGAREJO, A.R.; DE-SIMONE, S.G.; SOARES, M.R.; FOGUEL, D.; ZINGALI, R.B. Immunome and venome of Bothrops jararacussu: A proteomic approach to study the molecular immunology of snake toxins. Toxicon. Oxford, v.55, p. 1222-1235, 2010.

COSTA, P.D.; TOYAMA, M.H.; MARANGONI, S.; RODRIGUES-SIMIONI, L., DA CRUZ-HÖFLING, M.A. Effects of Bothrops pirajai venom on the mouse extensor digitorum longus (EDL) muscle preparation. Toxicon, Oxford, v.37, p.1143-1153, 1999.

CROTT, L.S.P.; LUCIANO-VALIM, Y.M.; SILVA, C.L.; BARBOSA, J.E. Interactions of F1 fracions from diferent strains of Paracoccidioides brasiliensis with human complement and with human neutrophils. Mycopathologia, The Hague, v.140(1), p.19-27, 1997.

DIAS DA SILVA, W.; TAMBOURGI, D.V.; CAMPOS, A.C.M.R.; MAGNOLI, F.; PETRICEVICHl, V.L.; KIPNIS, T.L. Complement activation by animal venoms. J.

Toxicol. Toxin. Rev., New York, v.14, p.375-400, 1995.

DÍAZ, C.; VALVERDE, L.; BRENES, O.; RUCAVADO, A.; GUTIÉRREZ, J.M. Characterization of events associated with apoptosis/anoikis induced by snake venom metalloproteinase BaP1 on human endothelial cells. J. Cell. Biochem., New York, v.94, p.520-528, 2005.

DONG, H.; ROWLAND, I.; TUOHY, K.M.; THOMAS, L.V.; YAQOOB, P. Selective effects of lactobacillus casei Shirota on T cell activation, natural killer cell activity and cytokine production. Clin. Exp. Immunol. doi:10.1111/j.1365.2249.2010.04173.x , 2010.

DO BRASIL MINISTÉRIO DA SAÚDE, Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos, Fundação Nacional de Saúde, 2001.

DU, X.Y.; CLEMETSON, K.J. Snake venom L-amino acid oxidases. Toxicon, Oxford, v.40, p.659-665, 2002.

DU, X.Y.; SIM, D.S.; LEE, W.H.; ZHANG, Y. Blood cells as targets of snake toxins.

Blood Cells Mol. Dis., La Jolla, v.36, p.414-421, 2006.

EBLE, J.A. Matrix meets toxinology. Matrix Biol. Amsterdam, v. 29, p.239-247, 2010.

EGGERSTSEN, G.; FOHLMAN, J.; SJOQUIST, J. In vitro studies on complement inactivation by snake venoms. Toxicon, Oxford, v.18, p.87-96, 1980.

FARSKY, S.H.; GONÇALVES, L.R.; GUTIÉRREZ, J.M.; CORREA, A.P.; RUCAVADO, A.; GASQUE, P.; TAMBOURGI, D.V. Bothrops asper snake venom and its metalloproteinase BaP-1 activate the complement system. Role in leucocyte recruitment. Mediators Inflamm., Oxford, v.9, p.213-221, 2000.

FERNANDES, C.M.; ZAMUNER, S.R.; ZULIANI, J.P.; RUCAVADO, A.; GUTIÉRREZ, J.M.; TEIXEIRA, C. de F. Inflammatory effects of BaP-1 a metalloproteinase isolated from Bothrops asper snake venom: Leukocyte recruitment and release of cytokines. Toxicon, Oxford, v.47, p.549-559, 2006.

FOX, J.W.; MA, L.; NELSON, K.; SHERMAN, N.E.; SERRANO, S.M. Comparison of indirect and direct approaches using ion-trap and Fourier transform ion cyclotron resonante mass spectrometry for exploring viperid venoms proteomes. Toxicon, Oxford, v.47, p.969-985, 2006.

GARCIA, F.; TOYAMA, M.H.; CASTRO, F.R.; PROENÇA, P.L.; MARANGONI, S.; SANTOS, L.M. Crotapotin induced modification of T lymphocyte proliferative response through interference with PGE2 synthesis. Toxicon, Oxford, v.42, p.433-

437, 2003.

GASMI, A.; LOUZIR, H.; KAROUI, H.; EL AYEB, M.; DELLAGI K. Purification from

Vipera lebetina (desert adder) venom of a protein that depletes human complement.

Nat. Toxins, New York, v.2, p. 44-48, 1994.

GOMES, A.; CHOUDHURY, S.R.; SAHA, A.; MISHRA, R.; GIRI, B.; BISWAS, A.K.; DEBNATH, A.; GOMES, A. A heat stable protein toxin (drCT-I) from the Indian Viper (Daboia russelli russelli) venom having antiproliferative, cytotoxic and apoptotic activities. Toxicon, Oxford, v. 49, p. 46-56, 2007.

HAAS, P-J.; STRIJP, J.V. Anaphylatoxins - Their role in bacterial infection and inflammation. Immunol. Res., Basel, v.37, p.161-175, 2007.

ISHIKAWA, T.; VUCENIK, I.; SHAMSUDDIN, A.; NICULESCU, F.; BURNETT, J.W. Two new actions of sea nettle (Chrisaora quinquecirrha) nematocyst venom: studies on the mechanism of actions on complement activation and on the central nervous system. Toxicon, Oxford, v.44, p.895-899, 2004.

IZIDORO, L.F.; RIBEIRO, M.C.; SOUZA, G.R.; SANT'ANA, C.D.; HAMAGUCHI, A.; HOMSI-BRANDEBURGO, M.I.; GOULART, L.R.; BELEBONI, R.O.; NOMIZO, A.; SAMPAIO, S.V.; SOARES, A.M.; RODRIGUES, V.M. Biochemical and functional characterization of an L-amino acid oxidase isolated from Bothrops pirajai snake venom. Bioorg. Med. Chem., Oxford, v.14, p.7034-7043, 2006.

JANEWAY, C.A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M.; SCHLOMCHIK, M.J.

Imunobiologia: O sistema imune na saúde e na doença. 6ª Ed. Porto Alegre:

Artmed, 2006.

JUNIOR, J.C.M.; FLORÃO, A.; MATTANA, F.V.R.; ROCHA, F.H.; SANTOS, C.A.M.; WEFFORT-SANTOS, A.M. A citometria de fluxo como instrument de avaliação de atividade imunomodulatória de extratos e substâncias isoladas de plantas medicinais. Rev. Bras. Farmacog.,Curitiba, v. 16, p. 645-655, 2006.

KINI, R.M. Serine proteases affecting blood coagulation and fibrinolylis from snake venoms. Pathophysiol. Haemost. Thromb., Basel, v.34, p. 200-204, 2005.

KIRSCHFINK, M. Targeting complement in therapy. Immunol. Rev., Copenhagen, v.180, p.177-189, 2001.

KOH, D.C.I.; ARMUGAN, A.; JEYASEELAN, K. Snake venom components and their application in biomedicine. Cell. Mol. Life Sci., Basel, v.63, p.3030-3041, 2006.

LICASTRO, F.; DAVIS, L.J.; MORINI, M.C. Lectins and superantigens: membrane interactions of these compouds with T-lymphocytes affect immune response. Int. J.

Biochem. Bristol, v. 25, p. 845-852, 1993.

MANIATI, E.; POTTER, P.; ROGERS, N.J.; MORLEY. B.J. Control of apoptosis in autoimmunity. J. Pathol. London, v. 214, p. 190-198, 2008.

MARTIKAINEN P.; MARTIKAINEN, K.; NYMAN, NEVALAINEN, T.J., Toxic effects of human pancreatic and snake and bee venom phospholipases A2 on MCF-7 cells in

culture. Toxicon, Oxford, v.31, p. 835–843, 1993.

MASTELLOS, D.; ANDRONIS, C.; PERSIDIS, A.; LAMBRIS, J.D. Novel biological networks modulated by complement. Clin. Immunol., Orlando, v.115, p.225-235, 2005.

MORA, R.; VALVERDE, B.; DÍAZ, C; LOMONTE, B.; GUTIÉRREZ, J.M. A Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops asper snake venom induces

proliferation, apoptosis and necrosis in lymphoblastoid cell line. Toxicon, Oxford, v.45, p.651-660, 2005.

MORGAN, B.P.; HARRIS, C.L. Complement therapeutics; history and recent progress. Mol. Immunol., Oxford, v.40, p.159-170, 2003.

MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, Amsterdam, v.65, p.55-63, 1983.

MÜLLER-EBERHARD, H.J.; FJELLSTROM, K.E. Isolation of the anticomplementary protein from cobra venom and its mode of action on C3. J. Immunol., Baltimore, v.107, p.1666-1672, 1971.

NASCIMENTO, J.M.; FRANCHI, G.C.JR.; NOWILL, A.E.; COLLARES-BUZATO, C.B.; HYSLOP, S. Cytoeskeletal rearrangement and cell death induced by Bothrops

alternatus snake venom in cultured Madin-Darby canine kidney cells. Biochem. Cell

Biol., Ottawa, v.85, p.591-605, 2007.

NETO, E.H.; COELHO, A.L.J; SAMPAIO, A.L.F.; HENRIQUES, M.G.M.O.; MARCINKIEWICZ, C.; DE FREITAS, M.S.; BARJA-FIDALGO, C. Activation of human T lymphocytes via integrin signaling induced by RGD-disintegrins. Biochim

Biophys Acta. Amsterdam. v.2 , p. 176-184, 2007.

OLIVEIRA, G.H.; BRANN, C.N.; BECKER, K.; THOHAN, V.; KOERNER, M.M.; LOEBE, M.; NOON, G.P.; TORRE-AMIONE, G. Dynamic expression of the membrane attack complex (MAC) of the complement system in failing human myocardium. Am. J. Cardiol., New York, v.97, p.1626-1629, 2006.

OLIVEIRA, J.C.; DE OCA, H.M.; DUARTE, M.M.; DINIZ, C.R.; FORTES-DIAS, C.L. Toxicity of South American snake venoms measured by an in vitro cell culture assay.

Toxicon, Oxford, v.40, p.321-325, 2002.

PÉREZ, A.V.; SARAVIA, P.; RUCAVADO, A.; SANT'ANA, C.D.; SOARES, A.M.; GUTIÉRREZ, J.M. Local and systemic pathophysiological alterations induced by a

serine proteinase from the venom of the snake Bothrops jararacussu. Toxicon, Oxford, v.49, p.1063-1069, 2007.

QUEIROZ, G.P.; PESSOA, L.A.; PORTARO F.C.; FURTADO M.F.; TAMBOURGI, D.V. Interspecific variation in venom composition and toxicity of Brazilian snakes from Bothrops genus. Toxicon, Oxford, v.52, p. 842-851, 2008.

QUEIRÓZ, L.S.; MARQUES, M.J.; NETO, H.S. Acute local nerve lesions induced by

Bothrops jararacussu snake venom. Toxicon, Oxford, v.40, p.1483-1486, 2002.

REA, I.M.; MCNERLAN, S.E.; ALEXANDER, H.D. CD69, CD25, and HLA-DR activation antigen expression on cd31 lymphocytes and relationship to serum TNF-, IFN-, and sIL-2R levels in aging. Exp. Gerontol. Oxford, v. 4, p. 79-93, 1999.

RICKLIN, D.; LAMBRIS, J.D. Complement-target therapeutics. Nat. Biotechnol., New York, v.25, p.1265-1275, 2007.

RODRIGUES, F.G.; Petretski, J.H.; KANASHIRO, M.M.; LEMOS, L.; SILVA, W.D.; KIPNIS, T.L. The complement system is involved in acute inflammation but not in the hemorrhage produced by a Bothrops atrox snake venom low mass proteinase. Mol.

Immunol., Oxford, v.40, p. 1149-1156, 2004.

SAKAGUCHI, S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+ CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat. Immunol., New York, v.6, p.345-352, 2005.

SELISTRE-DE-ARAUJO, H.S.; COMINETTI, M.R.; TERRUGGI, C.H.; MARIANO- OLIVEIRA, A.; DE FREITAS, M.S.; CREPIN, M.; FIGUEIREDO, C.C.; MORANDI, V. Alternagin-C, a disintegrin-like protein from the venom of Bothrops alternatus, modulates alpha2beta1 integrin-mediated cell adhesion, migration and proliferation.

Braz. J. Med. Biol. Res., Ribeirão Preto, v.38, p.1505-1511, 2005.

SELISTRE-DE-ARAÚJO, H.S.; MORAES, C.K. Effect of rACLF, a recombinant snake venom metallopeptidase on cell viability, chemokine expression and degradation of extracelular matrix proteins. Toxicon, Oxford, v.48, p.641-648, 2006.

SERRANO, S.M.T.; MAROURI, R.C. Snake venom serine proteinases: sequence homology vs. substrate specific, a paradox to be solved. Toxicon, Oxford, v.45, p.1115-1132, 2005.

SHOIBONOV, B.B.; OSIPOV, A.V; KRYUKOVA, E.V.; ZINCHENKO, A.A.; LAKHTIN, V.M.; TSETLIN, V.I.; UTKIN, Y.N. Oxiagin from the Naja oxiana cobra venom is the first reprolysin inhibiting the classical pathway of complement. Mol. Immunol., Oxford, v.42, p.1141-1153, 2005.

SILVA, R.J.; SILVA, M.G.; VILELA, L.C.; FECCHIO, D. Antitumor effect of Bothrops

jararaca venom. Mediators Inflamm., Oxford, v. 11 p. 99-104, 2002.

SOUZA e SILVA, M.C.C.; GONÇALVES, L.R.C.; MARIANO, M. The venom of South American rasttlesnake inhibits macrophage functions and endowed with anti- inflammatory properties. Mediators Inflamm., Oxford, v.5, p.18-23, 1996.

STÁBELI, R.G.; MARCUSSI, S.; CARLOS, G.B.; PIETRO, R.C.; SELISTRE-DE- ARAÚJO, H.S.; GIGLIO, J.R.; OLIVEIRA, E.B.; SOARES, A.M. Platelet aggregation and antibacterial effects of an L-amino acid oxidase purified from Bothrops alternatus snake venom. Bioorg. Med. Chem., Oxford, v.12, p.2881–2886, 2004.

SU, SHU-HUI; SU SHU-JEM; LIN SHINE-REN; CHANG, KEE-LUNG. Cardiotoxin-III selectively enhances activation-induced apoptosis of human CD8+ _{T lymphocytes.} Toxicol Appl Pharmacol. New York. v. 193, p. 97-105, 2003.

TAMBOURGI, D.V.; DOS SANTOS, M.C.; FURTADO, M. DE F.; DE FREITAS, M.C.; DA SILVA, W.D.; KIPNIS, T.L. Pro-inflammatory activities in elapid snake venoms. Br

J Pharmacol., London, v.112, p.723-727, 1994.

TANJONI, I.; WEINLICH, R.; DELLA-CASA, M.S.; CLISSA, P.B.; SALDANHA-GAMA R.F.; DE FREITAS, M.S.; BARJA-FIDALGO, C.; AMARANTE-MENDES, G.P.; MOURA-DA-SILVA, A.M. Jararhagin, a snake venom metalloproteinase, induces a specialized form of apoptosis (anoikis) selective to endothelial cells. Apoptosis, London, v.10, p. 851-861, 2005.

TOHYAMA, Y.; YAMAMURA. H. Complement-mediated phagocytosis--the role of Syk. IUBMB Life, London, v.58, p.304-308, 2006.

TOMKINSON, C.B.; WAGNER, D.K.; NELSON, D.L.; SULLIVAN, J.L. Activated lymphocytes during acute Epstein-Barr virus infection. J. Immunol. Baltimore. v. 139, p. 3802-3807, 1987.

TURNER, M.W. Mannose-binding lectin: the pluripotent molecular of the innate immune system. Immunol. Today, Amsterdam, v. 17, p. 532-540, 1996.

UNDERHILL, D.M.; OZINSKY, A. Phagocytosis of microbes: Complexity in action.

Annu. Rev. Immunol., Palo Alto, v.20, p.825-852, 1999.

WAGNER, E.; FRANK; M.M. Therapeutic potential of complement modulation.

Nature Reviews. v. 9, p. 43-56, 2010.

WALPORT, M. J. Complement: First of two parts. N. Engl. J. Med., Boston, v.344, n.14, 2001.

WARRELL, D. A. Snake bite. Lancet, London, v. 375, p. 77-88, 2010.

YAMAMOTO, C.; TSURU, D.; ODA-UEDA, N.; OHNO, M.; HATTORI, S.; KIM, S. Flavoxobin, a serine protease from Trimeresurus flavoviridis (habu snake) venom, independently cleaves Arg726-Ser727 of human C3 and acts as a novel, heterologous C3 convertase. Immunobiology, London, v.107, p. 111-117, 2002.

ZAMUNER, S.R.; GUTIÉRREZ, J.M.; MUSCARÁ, M.N.; TEIXEIRA, S.A.; TEIXEIRA, C.F. Bothrops asper and Bothrops jararaca snake venom trigger microbicidal functions of peritoneal leukocytes in vivo. Toxicon, Oxford, v.39, p.1505-1513, 2001.

ZIEGLER, S.F.; RAMSDELL, F.; ALDERSON, M.R. The activation antigen CD69.

ZIGMOND, S.H.; HIRSCH, J.G. Leukocyte locomotion and chemotaxis. New methods for evaluation, and demonstration of a cell-derived chemotactic factor. J.

ANEXO C