fluorescens
Uma vez que somente as estirpes A. tumefaciens A136, WCF47, KYC55 e C. violaceum CV026 foram capazes de detectar as moléculas sinalizadoras produzidas pelas 12 estirpes de P. fluorescens (item 3.3), selecionaram-se duas dessas monitoras para o ensaio de detecção de AHL diretamente nos biofilmes. Dentre as estirpes de A. tumefaciens, escolheu-se a WCF47 por apresentar grau médio de sensibilidade e por ser menos susceptível à ativação dos genes que sintetizam a enzima ß-gal por substâncias diferentes das moléculas sinalizadoras.
Os resultados obtidos no teste de inibição da produção de pigmento por C. violaceum CV026 indicaram que biofilme de P. fluorescens 097 produz substância capaz de inibir parcialmente parte da produção de violaceína. Essa constatação é baseada na redução da pigmentação violeta produzida por C. violaceum na presença de biofilme de P. fluorescens 097 (Figura 10). A estirpe monitora A. tumefaciens WCF47 também apresentou resposta positiva para a presença outra molécula sinalizadora de QS na presença de biofilme de P. fluorescens 097 formado em cupom de aço inoxidável (Figura 10).
A técnica de detecção de AHL in situ, desenvolvida neste estudo, mostrou ser uma ferramenta prática, simples e eficiente e representa um método alternativo de estudo para relacionar o QS com a formação de biofilmes. Utilizou-se a exposição dos cupons à radiação ultravioleta como forma de eliminar parte da população de células sésseis, sem destruir as moléculas sinalizadoras. A imersão de um cupom de aço inoxidável contendo biofilme em meio de cultura não resultou em turvação detectável até 24 h de incubação, período suficiente para observar os resultados do ensaio de detecção in situ. Esse controle assegurou que a ativação dos monitores no ensaio de detecção in situ ocorreu por moléculas sinalizadoras previamente presentes nos biolfilmes, e não por aquelas produzidas durante crescimento bacteriano durante o ensaio. Entretanto, outras metodologias que impeçam a transferência das células sésseis para o ágar devem ser avaliadas.
A presença de substâncias ativadoras dos monitores nos biofilmes de P. fluorescens 097 indica que o sistema QS pode estar envolvido na regulação da formação de biofilmes. A regulação da formação de biofilmes pelo sistema QS já foi observada em estudos com outras bactérias como P. aeruginosa (De KIEVIT et al.,
2001), Burkholderia cepacia (HUBER et al., 2001), A. hydrophila (LYNCH et al., 2002) e A. tumefaciens (AN et al., 2006).
Controles positivos Controles negativos Biofilmes submetidos à luz UV Biofilmes não-submetidos à luz UV A B C D E F G H
Figura 10 – Detecção de N-acil-homoserinas lactonas por estirpes monitoras em biofilmes formados por P. fluorescens 097 durante 48 h em MMS e submetidos ou não à luz ultravioleta por 30 min. A a D referem-se ao ensaio realizado com a estirpe monitora C. violaceum CV026; E a H referem-se ao ensaio com a estirpe monitora A. tumefaciens WCF47.
2.3.8. Detecção de homoserinas lactonas aciladas nos extratos de células sésseis e planctônicas
Extratos de células sésseis e planctônicas de P. fluorescens 097, obtidos após 24 e 48 h de incubação adicionados ao meio de cultivo de C. violaceum CV026, resultaram na formação de dois halos de inibição: um do crescimento e outro de formação de pigmento pela estirpe monitora (Figura 11). A inibição do crescimento ocorreu provavelmente em razão da extração de antibióticos produzidos pela estirpe- teste. Muitas espécies do gênero Pseudomonas, incluindo P. aeruginosa e P. fluorescens isoladas do solo, produzem antibióticos como fenazina-1-ácido carboxílico e derivados. Esses metabólitos secundários exibem atividade
antimicrobiana contra muitos organismos procariotos e eucariotos e, por isso, a síntese desses compostos confere vantagem adaptativa, quando em competição com outros microrganismos do solo (KHAN et al., 2005). Outro exemplo de antibiótico produzido por P. fluorescens NCIMB 10586 é o ácido pseudomônico ou mupirocina (El-Sayed et al., 2001). A regulação de ambos os antibióticos mencionados ocorre por meio do sistema QS. Segundo McClean et al. (1997), o ensaio de inibição de C. violaceum CV026 deve ser interpretado com cuidado, visto que muitas bactérias produzem substâncias antimicrobianas. Os autores afirmaram que a região despigmentada deve ser opaca, e não transparente, significando que não houve inibição do crescimento da biosensora.
Controle positivo Controle negativo Extrato de células planctônicas
Extrato de células sésseis
Figura 11 – Detecção de AHLs produzidas pelas células sésseis e planctônicas de P. fluorescens 097 após 48 h de incubação, utilizando-se a estirpe monitora C. violaceum CV026.
O resultado apresentado na Figura 12 evidenciou que P. fluorescens 097, tanto na forma livre quanto na planctônica, produz molécula sinalizadora capaz de ativar o sistema QS de A. tumefaciens WCF47, o que confirmou mais uma vez os resultados apresentados no item 3.3. Segundo Zhu (2003), as estirpes A. tumefaciens WCF47 e KYC55 são biosensores que apresentam maior sensibilidade em relação às demais e ampla especificidade aos substratos, conseguindo detectar AHLs com cadeia acil de diversos comprimentos. As proteínas TraI e TraR de A. tumefaciens são homólogas das proteínas LuxI e LuxR de Vibrio fisheri. TraI sintetiza o autoindutor N-3-oxooctanoil-HSL (OOHL), enquanto TraR é uma ativadora dos genes tra, trb e rep do plasmídeo Ti dependente de OOHL (PIPPER et al., 1993; FUQUA e WINANS, 1994; PAPPAS e WINANS, 2003). Tem sido reportado que TraR também detecta várias dicetopiperazinas (Holdem et al., 1999).
Controle positivo Controle negativo Extrato de células planctônicas
Extrato de células sésseis
Figura 12 – Detecção de AHLs produzidas pelas células sésseis e planctônicas de P.
fluorescens 097 após 48 h de incubação utilizando-se a estirpe monitora A. tumefaciens WCF47.
2.3.9. Caracterização das AHLs
Embora os extratos das células sésseis e planctônicas da estirpe P. fluorescens 097 tenham induzido a produção de ß-gal pela estirpe monitora A. tumefaciens WCF47, o mesmo não foi observado quando se aplicaram os mesmos extratos na placa de cromatografia em camada delgada (Figura 13). Provavelmente, ocorreu algum fenômeno que degradou a molécula sinalizadora durante o processo de separação das amostras ou uma difusão excessiva no suporte sólido que promoveu sua diluição, tornando-a concentração insuficiente para estimular o monitor. Resultado contrário ocorreu quando Laue et al. (2000) realizaram um estudo com a estirpe P. fluorescens F113. Essa estirpe não induziu resposta nas monitoras C. violaceum CV026, capaz de detectar AHLs de quatro a oito carbonos e em E. coli (pSB401), capaz de detectar AHLs de 10 a 14 carbonos de comprimento de cadeia acil. Entretanto, ao realizar a extração do sobrenadante da cultura com diclorometano, seguido de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), três das frações obtidas foram capazes de ativar as estirpes monitoras. Por meio da espectrometria de massa, as AHLs foram subseqüentemente caracterizadas como N- (3-hidroxi-7-cistetradecanoil) homoserina lactona, N-decanoil homoserina lactona e N-hexanoil homoserina lactona.
Os resultados obtidos indicam a necessidade de mais estudos a fim de se investigar a causa da ausência de resposta na estirpe monitora utilizada na biorevelação da CCD e para a identificação das moléculas indutoras dos monitores usados. A realização da espectrometria de massa seria uma alternativa adequada para elucidar o problema em questão.
Figura 13 – Cromatografia em camada delgada do extrato de AHLs obtido das células sésseis e planctônicas de P. fluorescens 097 cultivadas em MMS por 48 h. Padrões: (ABL) α-amino- -butirolactona hidrobrometo; (HHL) N-hexanoil-DL-homoserina lactona; (DHL) N- decanoil-DL-homoserina lactona; (DDHL) N-dodecanoil-DL- homoserina lactona; (TDHL) N-tetradecanoil-DL-homoserina lactona;
(S) células sésseis; (P) células planctônicas.
2.3.10. Efeito da adição de inibidores e de ativadores de quorum sensing no