bcsE Mutantlarının Fenotipik Değerlendirilmesi

4.2.1 Kongo kırmızısı içeren LB agar besiyerlerinde bcsE mutant suĢlarının biyofilm morfotiplerinin belirlenmesi

SuĢların ürettiği biyofilmlerin morfotipleri; biyofilmin matriksinde kıvrımlı fimbriya ve selüloz bulunduran “rdar” (kırmızı, kuru ve pürüzlü), yalnızca kıvrımlı fimbriya bulunduran “bdar” (kahverengi, kuru ve pürüzlü), yalnızca selüloz bulunduran “pdar”

(pembe, kuru ve pürüzlü) ve her ikisini de bulundurmayan “saw” (düz ve ıslak) olmak üzere kategorize edilmiĢtir. Doğal tip S. Typhimurium DMC4, S. Grup C1 DMC2 suĢlarının oluĢturduğu biyofilmlerin “rdar” morfotipinde olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 4.6). Denemeden elde edilen sonuçlara göre bcsE geni bakımından mutant olan Salmonella suĢlarının oluĢturdukları biyofilm yapılarının dağılma eğiliminde olduğu saptanmıĢtır. Bu yapı “bdar” biyofilm morfotipine benzemektedir (ġekil 4.6).

ġekil 4.6 S. Grup C1 DMC2 ve S. Typhimurium DMC4 doğal tip suĢlarının ve bcsE mutantlarının biyofilm yapılarının stereo mikroskop görüntüleri

4.2.2 Kalkoflor bağlanma uygulaması

Salmonella suĢlarının selüloz üretiminin belirlenmesi amacı ile kalkoflor denemesi gerçekleĢtirilmiĢtir. 366 nm UV ıĢık altında incelenen Petri plaklarında üreyen doğal tip Salmonella suĢları selüloz üretimlerinden dolayı kuvvetli florasan ıĢıma vermiĢlerdir (ġekil 4.7). bcsE mutant fenotipini doğrulamak için gerçekleĢtirilen denemede; β-1,4 glikozidlerine bağlanan floresans boyanın bcsE mutantlarında doğal tip suĢlara kıyasla büyük ölçüde azaldığı saptanmıĢtır. Bu durum selüloz üretiminin mutantlarda büyük ölçüde düĢtüğüne iĢaret etmektedir (ġekil 4.7).

62

ġekil 4.7 Doğal tip ve mutant DMC2 ve DMC4 suĢlarının kalkoflor bağlanma denemeleri

4.2.3 Polistiren yüzeylerde biyofilm oluĢum miktarlarının belirlenmesi

Salmonella izolatlarının polistiren yüzey üzerinde biyofilm oluĢturma özelliklerinin incelenmesi için Woodward vd. (2000) tarafından önerilen yöntem modifiye edilmiĢtir.

Yöntemde negatif kontrol üzerinden „cut-off OD‟ (OD_c) hesaplandıktan sonra, suĢlar biyofilm üretimi bakımından değerlendirmeye tabi tutulmuĢtur.

S. Grup C1 DMC2 ve S. Typhimurium DMC4 doğal tip suĢlarının ve bcsE mutantlarının mikrotitre plaklarda farklı günlerde oluĢturdukları biyofilm miktarları ġekil 4.8'de verilmiĢtir. Elde edilen verilere ve hesaplanan eĢik değerlerine göre;

maksimum biyofilm üretimi her iki serotip için de 120 saat olarak belirlenmiĢtir. 120 saat sonunda S. Grup C1 DMC2 suĢunun OD595=2,797 ve S. Typhimurium DMC4

DMC2 Doğal Tip ∆DMC2 CHL ⁺

∆DMC2 Chl¯

DMC4 Doğal Tip ∆DMC4 CHL ⁺

∆DMC4 Chl¯

63

suĢunun ise OD595=3,198 değerleri ile güçlü biyofilm üreticileri oldukları saptanmıĢtır.

Ġnkübasyon süresi uzadıkça biyofilm üretim miktarlarında azalma meydana gelmiĢtir.

Bunun yanı sıra, bcsE bakımından mutant olan her iki serotipin de denenen tüm inkübasyon periyotlarında biyofilm üretmedikleri belirlenmiĢtir. Mutant ve doğal tip suĢlar arasındaki farklar tek yönlü ANOVA ve Tukey testi kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirilmiĢtir. (P<0,05).

ġekil 4.8 Doğal tip ve mutant Salmonella suĢlarının biyofilm üretim kapasiteleri

4.2.4 Pelikül oluĢturma özelliklerinin değerlendirilmesi

ÇalıĢmamız kapsamında denemeye alınan Salmonella suĢlarının 37 C'de sıvı-hava ara fazında pelikül oluĢturmadığı gözlemlenmiĢtir. Ancak 20 C'de pelikül oluĢturma özellikleri incelenen bcsE mutant ve doğal tip Salmonella suĢlarının pelikül oluĢturma kabiliyetlerinde farklanmalar meydana gelmiĢtir. Doğal tip suĢlarda 20 C'de oldukça dayanıklı (rigid) yapıda biyofilm ve halka yapısı tanımlanmıĢtır. Mutant suĢların ise aynı sıcaklıkta pelikül oluĢturmadığı saptanmıĢtır (ġekil 4.9-4.12).

24 SAAT 48 SAAT 72 SAAT 96 SAAT 120 SAAT 144 SAAT

DMC2 0,103 1,155 1,054 1,848 2,797 2,707

∆DMC2 0,001 0,004 0,012 0,032 0,037 0,003

DMC4 0,234 2,403 2,777 2,967 3,198 2,783

∆DMC4 0,002 0,009 0,023 0,041 0,079 0,001

0

Doğal Tip ve Mutant SuĢların Biyofilm Üretim Kapasiteleri

64

ġekil 4.9 S. Group C1 DMC2 doğal tip ve DMC2 ∆bcsE suĢlarının 20 C'de oluĢturduğu pelikül yapısı

ġekil 4.10 S. Typhimurium DMC4 doğal tip ve DMC4 ∆bcsE suĢlarının 20 C'de oluĢturduğu pelikül yapısı

ġekil 4.11 S. Group C1 DMC2 doğal tip ve DMC2 ∆bcsE suĢlarının 37 C'de oluĢturduğu pelikül yapısı

65

ġekil 4.12 S. Typhimurium DMC4 doğal tip ve DMC4 ∆bcsE suĢlarının 37 C'de oluĢturduğu pelikül yapısı

4.2.5 Selülaz aktivitesinin değerlendirilmesi

Selülaz aktivitesinin değerlendirilmesinde, mutant ve doğal tip Salmonella kültürleri % 5 oranında karboksimetil selüloz içeren besiyerinde inkübe edilerek, agar kuyu difüzyon testi uygulanmıĢtır. Kongo kırmızısı ile boyanan agar plaklarında kuyu etrafında oluĢan halkanın varlığı veya yokluğuna göre selülaz etkinliği değerlendirilmiĢtir. DMC2 ve DMC4 doğal tip suĢlarının kuyu etrafında oluĢturdukları sarı halkalar karboksi metil selülazın parçalanmasının, yani selülaz aktivitesinin varlığını kanıtlamıĢtır. ∆DMC2 ve

∆DMC4 suĢlarda ise agar yüzeyinde selülaz aktivitesi tespit edilmemiĢtir (ġekil 4.13).

∆DMC2 ∆DMC4 DMC2 DMC4

ġekil 4.13 Doğal suĢ ve mutantların selülaz aktiviteleri

66

4.2.6 Bakteriyel “Swimming” ve “Swarming” hareketlerinin belirlenmesi

Flagellaya bağlı “Swarming” (bakteriyel popülasyonun katı veya yarı katı ortamlarda koordineli bir Ģekilde translokasyonu, çok hücreli hareket) ve “Swimming” (sıvı ortamlarda ya da yarı katı yüzeylerde bakterilerin flagella aracılığı ile gerçekleĢtirdiği ve aynı popülasyonun diğer bireyleri ile koordine edilmemiĢ hareket, bireysel hareket) motilitelerinin belirlenmesi amacıyla gerçekleĢtirilen denemede sonuçlar; agar plakalarındaki inokülasyon bölgesinden yüzme ve toplanma bölgesinin kenarına kadar oluĢan yarıçap ölçülerek değerlendirilmiĢtir. Elde edilen verilere göre, her iki bcsE mutantının da doğal tip suĢlara kıyasla “Swimming” ve “Swarming” hareketlerini daha yoğun olarak gerçekleĢtirdiği belirlenmiĢtir. ÇalıĢmada kullanılan her iki doğal suĢ içinde belirgin bir “swarming” ve “swimming” hareketi tanımlanamamıĢtır (ġekil 4.14, 4.15) (Çizelge 4.1).

DMC2 ∆DMC2 DMC4 ∆DMC4

ġekil 4.14 Denemede kullanılan doğal suĢ ve mutantlarda “Swimming” hareketi

DMC2 ∆DMC2 DMC4 ∆DMC4

ġekil 4.15 Denemede kullanılan doğal suĢ ve mutantlarda “Swarming” hareketi

67

Çizelge 4.1 “Swimming” ve “Swarming” hareket zon çapı ortalamaları

ΔDMC2 ΔDMC4

“Swimming” motilite 17,5 mm 11,75 mm

“Swarming” motilite 19,25 mm 13 mm