bcsE gen bölgesini içeren rekombinant plazmid eldesi

3.2.3.1.1 Genomik DNA izolasyonu

18 saat boyunca 37 °C'de geliĢtirilen aktif Salmonella kültürlerinden 1,5 mL hacim mikrosantrifüj tüplerine alınarak, 12000 rpm'de 2 dk süresince santrifüj edilmiĢtir. Üst sıvı ortamdan uzaklaĢtırılmıĢ ve bakteri çökeltisi 567µL Tris-EDTA tamponu içerisinde çözülmüĢtür. Süspansiyon üzerine 30 µL % 10'luk SDS ve 3 µL proteinaz K (20mg/mL) aktarılıp 37 C'de 1 saat tutulmuĢtur. Ġnkübasyon bitiminde ortama 100 µL 5M NaCl ilave edilmiĢtir. 80 µL CTAB/NaCl çözeltisinin ilavesinden sonra beyaz partikül yapısı oluĢturuncaya kadar iyice karıĢtırılmıĢ ve 65 °C'de 10 dakika tutulmuĢtur. Bu ortam üzerine 750 µL kloroform/izoamil alkol (24:1) ilave edilerek 1200 rpm'de 5 dakika santrifüj edilmiĢtir. Kesik pipet uçlarıyla yeni mikrosantrifüj tüplerine alınan üst faz üzerine 750 µL fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ilave edilerek 12000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilmiĢtir. Burada oluĢan üst faz üzerine 350 µL izopropanol eklenerek 12000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilmiĢtir. Son aĢamada süpernatant atılmıĢ ve pelet üzerine 350 µL % 70'lik etanol ilave edilerek, 12000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilmiĢtir. Çökelti 50 µL TE içerisinde çözülmüĢ ve nanodropta (NanoDrop 2000, Thermo, USA) genomik DNA saflığı ve konsantrasyonu belirlenmiĢtir.

3.2.3.1.2 bcsE geninin PZR ile çoğaltılması

bcsE geni 1,5 kb büyüklüğünde olup 523 amino asitten oluĢan BcsE proteinini kodlamaktadır. bcsE genine spesifik bölgenin çoğaltılması için tasarlanan primer

48

dizilerine restriksiyon endonükleaz tanıma dizileri eklenmiĢ (Çizelge 3.10) ve PZR amplifikasyonları gerçekleĢtirilmiĢtir (Çizelge 3.11, 3.12). PZR sonrasında, elde edilen ürünlerden 5 µL alınarak 1µL 6x yükleme boyası ile karıĢtırılmıĢ ve % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 V elektrik akımı altında koĢturulmuĢtur. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı ile 1 kb DNA Marker'dan (Fermentas, Finland) yararlanılmıĢtır.

Elektroforez sonrası jeller, 0,2 µg/mL etidyum bromit (BioShop, Canada) çözeltisinde 20 dk süre ile boyama iĢlemine tabi tutularak ve 366 nm dalga boyunda UV ıĢık altında translüminatör kullanılarak görüntülenmiĢ ve fotoğrafları çekilmiĢtir (Kodak Gel Logic 200 Imaging System). PZR ürünleri “Roche High Pure PCR Product” pürifikasyon kit protokolü uygulanarak saflaĢtırılmıĢtır.

Çizelge 3.10 Primer dizileri

bcsE-N-ter-klon ileri primer 5'- ctcgaattctcggcatctcatcattatgg -3' bcsE-N-ter-klon geri primer 5'- gaggtcgaccaatcgcaggggttcaggaa -3'

Çizelge 3.11 PZR içeriği

Nükleaz içermeyen su 36,75µL

Tampon (10X) 5 µL

dNTP (10 mM) 1 µL

Ġleri Primer (10 pmol) 1 µL Geri Primer (10 pmol) 1 µL

MgCl2 3 µL

Taq DNA polimeraz 0,25 µL

DNA (40ng/µL) 2 µL

49 Çizelge 3.12 PZR koĢulları

Basamak Sıcaklık Süre Döngü Sayısı

Ön Denatürasyon 95 °C 2 dk 1

Denatürasyon 94 °C 1 dk

Bağlanma 62 °C 1 dk 30

Uzama 72 °C 90 sn

Son Uzama 72 °C 1 dk 1

3.2.3.1.3 Restriksiyon endonükleaz enzim kesimi

bcsE geninin aktarılacağı rekombinant vektörün hazırlanması için pET28a vektörünü içeren E. coli Dh5α hücreleri 25 µg/mL kanamisin içeren LB sıvı besiyerinde 37 °C'de 18 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Aktif kültürlerden plazmid izolasyonu Qiagen Spin Miniprep (#27106) kiti kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. Elde edilen plazmid DNA % 0,7 agaroz jelde 80 V sabit elektrik akımı ile elektroforez iĢlemine tabi tutulmuĢtur.

Molekül büyüklükleri, süper sarmal moleküler standartı (Sigma D5292) kullanılarak hesaplanmıĢtır.

ÇalıĢmada kullanılan restriksiyon endonükleaz enzimleri ve bu enzimlere ait tampon çözeltiler Sigma-Aldrich firmasından sağlanmıĢtır. Halkasal yapıda pET28a vektörü ve bcsE gen ürünlerinde yapıĢkan uç oluĢturmak amacıyla, SalI ve EcoRI enzim kesimine tabi tutulmuĢtur. SalI ve EcoRI ezim kesim bölgeleri arasındaki uzaklık 13 baz çiftidir.

PZR ürünü ve pET28a vektörü için restriksiyon endonükleaz enzim kesimleri için Çizelge 3.13'te belirtilen reaksiyon karıĢımları kullanılmıĢtır. Enzim kesim reaksiyonları 37 °C'de 4 saat süreyle gerçekleĢtirlmiĢtir. Reaksiyon bitiminde 65 °C'de 10 dakika inkübasyonla enzim inaktivasyonu sağlanmıĢtır. DNA saflaĢtırması High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Chem. Co., USA) kullanılarak yapılmıĢtır.

50 Çizelge 3.13 Reaksiyon karıĢımı

Distile Su 14 µL Distile Su 6 µL

RE Tamponu 2 µL RE Tamponu 2 µL

Pürifiye bcsE ürünü 10 µL pET28a 10 µL

EcoRI RE enzimi 2 µL EcoRI RE enzimi 1 µL SalI RE enzimi 2 µL SalI RE enzimi 1 µL

3.2.3.1.4 DNA bağlanma reaksiyonu (Ligasyon)

Enzim kesimi yapılan PZR ürününün lineer hale getirilen pET28a ile rekombinasyonu ligasyon reaksiyonu ile gerçekleĢtirilmiĢtir. T4 ligaz enziminin kullanıldığı reaksiyonda toplam tampon çözeltisi 20 µL olacak Ģekilde hazırlanmıĢtır. Ligasyon reaksiyonunda vektör/insert oranı 3/1 olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır (Çizelge 3.14).

Çizelge 3.14 DNA bağlanma reaksiyonu karıĢımı

DMC2 DMC4 Kontrol Grubu*

Distile Su 14,16 µL 14,21 µL 17 µL

T4 DNA ligaz Tamponu 2 µL 2 µL 2,5 µL

bscE 0,34 µL 0,29 µL -

pET28a 3 µL 1 µL 5 µL

T4 DNA Ligaz 0,5 µL 0,5 µL 0,5 µL

*Kontrol grubu yanlızca vektör içermektedir.

51

3.2.3.1.5 E. coli BL21 suĢuna rekombinant plazmid transformasyonu

Bu aĢamada, pET28a vektörüne bcsE geni klonlananarak elde edilen rekombinant vektör E. coli BL21 suĢuna transforme edilmiĢtir. 18 saat süre ile LB broth ortamında aktifleĢtirilen E. coli BL21 kültürleri 1/10 oranında dilue edildikten sonra OD600=0,4 olana kadar inkübasyona tabi tutulmuĢtur. Ġnkübasyon bitiminde kültürler 2 mL mikrosantrifüj tüplerine alınarak, 10000 rpm'de ve +4°C‟de 20 dk santrifüj edilmiĢtir.

Üst faz uzaklaĢtırılarak pelet üzerine 1 mL soğuk dH2O (+4°C) eklenmiĢ ve bu ortam 10000 rpm‟de +4°C'de 20 dk santrifüj iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Bu iĢlem 3 kez tekrar edilmiĢtir. Daha sonra üst faz uzaklaĢtırılmıĢ ve pelet 50 µL soğuk dH₂O ile çözülerek kompotent hücreler elde edilmiĢtir. bcsE genini içeren rekombinant pET28a vektörü son konsantrasyonu 40 ng/µL olacak Ģekilde kompotent hücrelerin bulunduğu elektoporasyon küvetine (0,2 cm) aktarılmıĢtır. Elektroporasyon (1800 V) iĢleminden sonra bu ortamın üzerine 1 mL LB sıvı besiyeri eklenerek 37 °C'de 1 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Ġnkübasyon bitiminde 25 µg/mL kanamisin içeren LB agar besiyerine yayma ekim yapılmıĢtır. 37°C'de 18 saat inkübe edildikten sonra transformantlar katı besiyeri ortamından rastgele seçilmiĢ ve “High Pure Plazmid DNA Purification” (Roche Chem. Co., USA) kiti kullanılarak üretici firmanın önerdiği yönteme göre plazmid DNA izolasyonu gerçekleĢtirilmiĢtir. Seçilen transformantlardaki rekombinant plazmidlerin insert geni içerip içermediğini kontrol etmek amacıyla PZR analizi gerçekleĢtirilmiĢtir (Çizelge 3.10-3.12). bcsE genini taĢıyan plazmidlerin moleküler büyüklükleri % 1 agaroz jel sistemlerinde doğrulanmıĢtır.