Bakteriyel Selüloz Fermantasyonunda Melas Kullanımı

Çalı manın bu bölümünün amacı, kompleks besi yeri olan melasın bakteriyel selüloz sentezinde alternatif besin kayna ı olarak kullanılabilirli ini ara tırmaktır. Bunun için öncelikle melasta eker tayini yapılmı , daha sonra safsızlık ve a ır metallerden arındırmak için ısıl-H2SO4 i lemleri yapılmı ve farklı eker konsantrasyonlarında

melas çözeltileri hazırlanmı tır. 3.2.3.1 Melasta eker Tayini

Melas, sakkaroz ve indirgen ekerler içermektedir. Sakkaroz bir disakkarittir ve hidrolize edildi inde 2 monosakkarite dönü mektedir, bunlar glikoz ve fruktozdur. Sakarozun kimyasal yapısı ekil 3.9’da görülmektedir.

ekil 3.9 Sakkarozun açık formülü [31]

Melastaki eker miktarını tayin etmek için titrasyon, gravimetrik ve kolorimetrik yöntemler kullanılmaktadır. Bu çalı mada, bir titrasyon yöntemi olan Lane-Eynon

metodu kullanılmı tır. Metodun temeli, bürette bulunan eker çözeltisinin, erlende bulunan kaynayan bakır sülfat çözeltisi ve indikatör olan metilen mavisiyle titre edilerek, fruktoz, glikoz gibi indirgen ekerlerin bakır sülfatla reaksiyona girmesini sa lamaktır. Ortamdaki bakır sülfat tükendikten sonra eklenen ilk eker damlası rengi maviden beyaza döndürecektir. Eklenen eker miktarı kaydedilerek, indirgen eker miktarı hesaplanır. Ancak bu yöntemin en büyük dezavantajı, indirgen ekerlerin türünün hesaplanamamasıdır [32].

Çalı maya ba larken, 5 gr melas tartılmı , saf su ile 250 mL’ ye seyreltilerek %2’ lik eker çözeltisi elde edilmi tir. Daha sonra bu eker çözeltisinden 25 mL örnek alınarak tekrar saf su ile 100 mL’ ye seyreltilmi %0.5’ lik eker çözeltisi elde edilmi ve bu elde edilen çözelti bürete alınmı tır. Erlene ise, 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltisi alınıp, üzerine büretteki çözeltiden 10 mL ilave edilerek ısıtılmaya ba lanmı tır.

Fehling A çözeltisi hazırlanırken, 69.28 gr CuSO4.5H2O 1 lt. distile suda çözülür,

Fehling B çözeltisi hazırlanırken ise, 346 gr ‘Rochelle’ tuzu (KNaC4H4O6.4H2O) ve

120 gr NaOH 1 L distile suyla tamamlanır.

Erlendeki çözelti kaynamaya ba ladı ında 3-4 damla metilen mavisi ilave edilerek, titrasyon ba latılmı tır. Mavi renkte bir de i im gözlenmedi inden, kullanılan melasta indirgen eker bulunmadı ı tespit edilmi tir.

Bu çalı manın kontrolünü yapabilmek için, aynı i lemler %2’ lik çözelti ile de tekrarlanmı tır. Erlene 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltileri koyulmu , üzerine büretteki %2’ lik eker çözeltisinden 10 mL ilave edilerek ısıtılmaya ba lanmı tır, kaynama ba layınca da metilen mavisi eklenerek titrasyon yapılmı tır. Çalı ma sonunda daha deri ik bir çözelti ile çalı ılmasına ra men renk de i imi gözlenemedi inden, melasın içinde indirgen eker bulunmadı ı kesinle tirilmi tir.

Bu çalı madan sonra sakkaroz miktarının tayini için inversiyon yapılmı tır. Erlene 25 ml %2’ lik eker çözeltisi koyulup, üzerine 1 N HCl çözeltisinden 15 mL ilave edilmi ve kaynatılmı tır. Daha sonra çözelti so utulmu ve bazik hale getirebilmek için renk pembeye dönene kadar %10’ luk NaOH ilave edilmi , hazırlanan bu çözelti bürete alınmı tır. Erlene ise, 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltileri koyulmu ve ısıtılmaya ba lanmı tır. Kaynama ba layınca 3-4 damla

metilen mavisi eklenerek mavi renk kaybolup, effafla ıp, alt tabakada çökelti olu ana kadar titrasyon yapılmı tır. Renk döndü ünde, büretteki çözelti sarfiyatı 41.6 mL olarak kaydedilmi tir. Standart tablodan bu miktara kar ılık gelen invert eker de eri 124.85 olarak okunmu tur. Buradan toplam eker miktarı hesaplanmı tır. Toplam eker miktarı = (invert eker de eri *100) / çözelti sarfiyatı (3.1) e itli i ile hesaplanır. Buna göre,

Toplam eker miktarı = (124.85*100) / 41.6 = 0.3 mg’ dır.

Melastaki toplam eker konsantrasyonu = (0.3 / 0.5) * 100 (3.2) = % 60

Melastaki gerçek eker konsantrasyonu, hesaplanan toplam eker konsantrasyonunun %95’ i olarak kabul edilmektedir. Bu durumda;

Gerçek eker konsantrasyonu = 60*0.95

= %57 olarak hesaplanır.

Çalı mada kullanılan melas indirgen eker içermedi inden, bu %57’ lik ekerin tamamı sakkarozdan olu maktadır.

3.2.3.2 Melasa Uygulanan Ön lemler

Melas, fermantasyon prosesinde kullanılmadan önce içindeki safsızlıklardan arındırmak için ön i leme tabi tutuldu. Öncelikle 50 g melas tartıldı ve distile su ile 250 ml’ ye tamamlandı. Çözelti homojen olana kadar karı tırıldı ve katı partiküllerin ayrılması için 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edildi. Daha sonra çöken kısım süzülerek ayrılmı , kalan sıvı kısım ise, öncelikle ısı daha sonra ısı-H2SO4 muamelesi ile

fermantasyonda kullanılacak hale getirilmi tir.

Isıl i lemde, çözelti 120 0_{C’ de 20 dk ısıtılmı ve daha sonra oda sıcaklı ında bir}

gece bekletilmi tir. Ertesi gün çözelti 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülmü tür.

Daha sonra 4 N H2SO4 ile pH 3.0’ e ayarlandı ve oda sıcaklı ında bir gece

bekletilmi tir. Ertesi gün 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülerek sıvı kısım ayrılmı tır. Bu sıvı kısım, 120 0C’ de 20 dk ısıtılmı ve oda sıcaklı ında bir gece bekletilmi tir. Ertesi gün tekrar 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülerek safsızlıklardan arındırılmı tır. Fermantasyon süresince bu safla tırılan

3.2.3.3 Farklı Konsantrasyonlarda Melas Çözeltilerinin Hazırlanması

Deney süresince 4 farklı konsantrasyonda melas çözeltisi hazırlanarak fermantasyon gerçekle tirildi ve konsantrasyonun selüloz verimine etkisi incelendi. Bu nedenle çalı maya ba lamadan önce melastaki eker konsantrasyonu belirlendi.

Melas ön i leme tabii tutulurken, 50 g melas alınıp, 250 ml’ ye tamamlanmı tı. Bu durumda melas konsantrasyonu;

d = m/V (3.3) e itli inden

d = (50g*0,57)/0,25L

= 114 g/L olarak hesaplanır.

Ön i lem sırasında 12,5 mL 4N H2SO4 ile muamele yapıldı ından ba langıçtaki eker

konsantrasyonu de i mi tir. Bu de i im;

d = (d1V1 + d2V2)/ (V1 + V2) (3.4)

e itli i ile hesaplanır.

d = (114*0,25 + 0*0,0125)/ (0,25 + 0,0125) d = 108,6 g/L olarak belirlenir.

eker konsantrasyonu 108,6 g/L olarak belirlenen bu çözeltiden, 50’ er mL’ lik sırasıyla 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L ve 80 g/L olmak üzere 4 farklı çözelti hazırlandı. Bu konsantrasyonları elde edebilmek için;

20 g/L = (108,6* V1) + (0*VSU) / 50 (3.5)

e itli inden yararlanıldı.

Bu durumda; 20 g/L’ lik melas çözeltisi hazırlayabilmek için 9.2 mL melas alınıp distile suyla 50 mL’ ye tamamlanmı tır. Aynı ekilde, 40 g/L’ lik çözelti için 18.4 mL melas, 60 g/L’ lik çözelti için 27.6 mL, 80 g/L’ lik çözelti için 36.8 mL melas alınarak 50 mL’ ye tamamlanmı tır.

Daha sonra 250 mL’ lik erlenlere bu çözeltilerden 1/5 oranını sa layabilmek için 45 mL melas çözeltisi, 5 mL A.xylinum kültürü koyularak 10 gün süreyle fermantasyon gerçekle tirilmi tir. Fermantasyon sonunda elde edilen selüloz safla tırılarak, tartım alınmı tır.