• Sonuç bulunamadı

Bakteriyel Selüloz Üretiminde Farklı Karbon Kaynaklarının Değerlendirilmesi

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Bakteriyel Selüloz Üretiminde Farklı Karbon Kaynaklarının Değerlendirilmesi"

Copied!
51
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

STANBUL TEKN K ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ

BAKTER YEL SELÜLOZ ÜRET M NDE FARKLI KARBON KAYNAKLARININ DE ERLEND R LMES

YÜKSEK L SANS TEZ Kimya Müh. Tuba KARAALP

OCAK 2007

Anabilim Dalı : MÜHEND SL KLE LER TEKNOLOJ LER Programı : MOLEKÜLER B YOLOJ – GENET K VE

(2)

STANBUL TEKN K ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ

ALTERNAT F BES N YAN ÜRÜNLER NDEN BAKTER YEL SELÜLOZ ÜRET M

YÜKSEK L SANS TEZ Kimya Müh. Sezin YILMAZ

(521041213)

OCAK 2007

Tezin Enstitüye Verildi i Tarih : 25 Aralık 2006 Tezin Savunuldu u Tarih : 30 Ocak 2007

Tez Danı manı : Prof.Dr. Melek TÜTER Di er Jüri Üyeleri Prof.Dr. Seniha GÜNER

(3)

ÖNSÖZ

Çalı malarım sırasında bilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sn. Prof. Dr. Melek TÜTER’ e, yanımda oldu unu her zaman hissetti im çalı ma arkada ım Kimya Mühendisi Sezin YILMAZ’ a ve verdikleri destek ile her zaman yanımda olduklarını bildi im aileme te ekkürü bir borç bilirim.

(4)

Ç NDEK LER

KISALTMALAR vi

TABLO L STES vii

EK L L STES viii

ÖZET ix

SUMMARY x

1. G R VE AMAÇ 1

2. TEOR K BÖLÜM 4

2.1. Bakteriyel Selüloz Biyosentezi 4

2.2. Bakteriyel Selüloz Fermantasyonu 8

2.3. Bakteriyel Selülozun Kullanım Alanları 12

2.4. Literatür Çalı maları 15

3. DENEYSEL ÇALI MALAR 21

3.1. Kullanılan Hammaddeler 21

3.1.1. Mikroorganizma 21

3.1.2. Melas 22

3.1.2.1 eker Kamı ından Melas Eldesi 22 3.1.2.2 eker Pancarından Melas Eldesi 23

3.1.3. Besi Yeri 24

3.2. Fermantasyon 25

3.2.1. Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi 26

3.2.2. Uygun Karbon Kayna ı Seçimi 27

3.2.3. Bakteriyel Selüloz Fermantasyonunda Melas Kullanımı 27

3.2.3.1 Melasta eker Tayini 27

3.1.3.2 Melasa Uygulanan Ön lemler 29

(5)

4. SONUÇLAR VE TARTI MA 31

4.1. Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi 31

4.2. Farklı Karbon Kaynaklarının Bakteriyel Selüloz Üretimine Etkisi 33 4.3. Farklı Ba langıç Konsantrasyonlarına Sahip Melas Çözeltilerinin

Bakteriyel Selüloz Verimine Etkisi 34

5. VARGILAR VE ÖNER LER 37

KAYNAKLAR 38

(6)

KISALTMALAR

1PFK : Fructose-1-phosphate kinase ATP : Adenosine triphosphate CS : Cellulose Synthase d : Yo unluk FBP : Fructose-1,6-biphosphate phosphatase FK : Fructokinase G6PDH : Glucose-6-phosphate dehydrogenase GK : Glikokinaz

HPLC : High Pressure Liquid Chromatography HS : Hestrin Schramm

m : A ırlık

OD : Optical Density PGA : Phosphogluconic acid PGI : Phosphoglucoisomerase

PGM : Phosphoglucomutase

PTS : System of phosphotransferases rpm : Rotate per minute

UDPGlc : Uridine diphosphoglucose

UGP : Uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase V : Hacim

(7)

TABLO L STES

Sayfa No

Tablo 2.1 Selüloz Üreten Mikroorganizmalar…………. ……… 4 Tablo 2.2 Besi Yeri Kompozisyonuna Göre Bakteriyel Selüloz

Verimi………... 19

Tablo 3.1 Melastaki Mineraller………….……… ………. 23 Tablo 3.2 Melastaki Vitaminler………….……… ………. 23 Tablo 4.1 Bakteriyel Selüloz Üretimine Karbon Kayna ının

(8)

EK L L STES Sayfa No ekil 1.1 ekil 1.2 ekil 2.1 ekil 2.2 ekil 2.3 ekil 2.4 ekil 2.5 ekil 2.6 ekil 2.7 ekil 2.8 ekil 2.9 ekil 2.10 ekil 2.11 ekil 2.12 ekil 2.13 ekil 2.14 ekil 3.1 ekil 3.2 ekil 3.3 ekil 3.4 ekil 3.5 ekil 3.6 ekil 3.7 ekil 3.8 ekil 3.9 ekil 4.1 ekil 4.2 ekil 4.3 ekil 4.4 ekil 4.5 ekil 4.6 ekil 4.7

: Selülozun kimyasal yapısı... : Selüloz elde etme yöntemleri... : Bakteriyel selüloz olu umunun ematik gösterimi………... : A. Xylinum’ da selüloz olu um mekanizması……… : A.xylinum’ da selüloz sentezinin biyokimyasal mekanizması….. : A.xylinum’ un karbon metabolizması……… : Statik kültürde elde edilen bakteriyel selüloz………... : Karı tırmalı kültürde elde edilen bakteriyel selüloz………. : Statik (A) ve karı tırmalı (B) ko ullarda el edilen bakteriyel

selülozun SEM görüntüleri……… : Karı tırıcı tipleri (A) ve Maxblend karı tırıcılı reaktör (B)…….. : Mekanik karı tırıcılı (A) ve Hava kaldırmalı (B) reaktörlerde

üretilen selülozun yapısı………. : Bakteriyel selüloz ile kaplanmı yara……… : Elektronik ka ıt………. : De i ik ba langıç glikoz konsantrasyonlarının selüloz verimine

etkisi……… : A.xylinum’ da de i ik karbon ve azot kaynaklarının bakteriyel

selüloz verimine etkisi………. : Fermantörün ematik gösterimi……….. : Liyofilize A.xylinum………..………. : Ampulün açılı ı……….. : eker kamı ı………... : eker pancarı……….. : A.xylinum ile hazırlanan stoklar………. : Bakteriyel selüloz olu umu……….. : Safla tırma i leminden sonra elde edilen bakteriyel selüloz (A), kurutulmu bakteriyel selüloz (B)………... : A.xylinum kolonileri……… : Sakkarozun açık formülü……… : Bakteriyel selüloz veriminin zamana göre de i imi……….. : Besi yerindeki glikoz miktarının zamana göre de i imi………… : Bakteriyel selüloz üretiminde zamana göre hücre büyümesi……. : Seçilen karbon kayna ına göre selüloz verimi……… : DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile seçilen karbon kayna ına göre

selüloz verimi……….. : Melaslı besi yerinde bakteriyel selüloz verimi……… : DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile melaslı besi yerinde bakteriyel

selüloz verimi………... 1 2 5 6 7 8 9 9 10 11 12 13 14 17 18 20 21 21 22 23 24 25 26 26 27 31 32 32 33 34 35 35

(9)

BAKTER YEL SELÜLOZ ÜRET M NDE FARKLI KARBON KAYNAKLARININ DE ERLEND R LMES

ÖZET

Selüloz, do ada en çok bulunan polimerdir ve insanlar tarafından binlerce yıldır kullanılmaktadır. Alternatif selüloz üretim yöntemlerinin ara tırılması ile ilgili çalı malar günümüzde de sürdürülmektedir. Bu çalı mada, A.xylinum 2325 türü kullanılarak, bakteriyel selüloz üretiminde farklı karbon kaynaklarının de erlendirilmesi amaçlanmı tır. Çalı manın ilk bölümünde klasik Hestrin & Schramm besi yeri kullanılarak optimum fermantasyon süresi 10 gün olarak belirlenmi tir. Daha sonra Hestrin & Schramm besi yerindeki glikoz, aynı oranlarda fruktoz, mannitol, sakkaroz ve laktoz ile de i tirilerek, 10 gün süreyle statik ko ullarda fermantasyon gerçekle tirilmi tir. Bu çalı manın sonunda en yüksek bakteriyel selüloz verimini veren karbon kayna ı fruktoz olarak belirlenmi tir. Karbon kayna ı olarak fruktoz kullanıldı ında elde edilen bakteriyel selüloz verimi 3,7 g/L’ dir. Karbon kayna ı olarak mannitol kullanıldı ında 2,9 g/L, sakkaroz kullanıldı ında ise 2,0 g/L selüloz elde edilmi tir. Laktoz kullanıldı ında ise bakteriyel selüloz olu umu gözlenmemi tir. Çalı manın son a amasında kompleks besi yeri olan melas ile bakteriyel selüloz sentezi gerçekle tirilmi tir. 20, 40, 60 ve 80 g/L ba langıç eker konsantrasyonundaki melas çözeltileri ile 10 gün süreyle statik ko ullarda fermantasyon yapılmı , en yüksek verim ba langıç eker konsantrasyonu 20 g/L olan melas çözeltisi ile 0,974 g/L olarak elde edilmi tir. Ba langıç eker konsantrasyonu arttıkça, selüloz veriminin dü tü ü gözlenmi tir. 80 g/L ba langıç eker konsantrasyonunda ise, bakteriyel selüloz olu umu gözlenmemi tir. A.xylinum 2325 türünün kompleks besi yeri olan melası etkin bir

(10)

EVALUATION OF DIFFERENT CARBON SOURCES ON BACTERIAL CELLULOSE PRODUCTION

SUMMARY

Cellulose is the most abundant polymer on the earth and used by people for thousands of years. Alternative ways for production of cellulose are still under investigation. In this paper, effect of different carbon sources on bacterial cellulose production are evaluated by using A.xylinum 2325. First of all, optimum time course for bacterial cellulose production was determined as 10 days. In defined Hestrin & Schramm medium different carbon sources are used instead of glucose. Among these carbon sources such as fructose, mannitol, sucrose and lactose, fructose gave the highest yield. The final concentration of bacterial cellulose in fructose containing medium under static conditions and 10 days of fermantation was measured as 3.7 g/L. When mannitol used as a carbon source 2,9 g/L cellulose was obtained. Also, sucrose gave only 2,0 g/L cellulose. In lactose containing medium no cellulose occured. In addition, bacterial cellulose production by A.xylinum using molasses medium was also carried out in static culture. 20, 40, 60 and 80 g/L initial sugar concentrations were evaluated. The maximum yield was obtained in 20 g/L initial sugar concentration. In molasses media containing 80 g/L initial sugar concentration, no bacterial cellulose production was observed. According to these results, molasses is not the efficient media for A.xylinum 2325.

(11)

1. G R VE AMAÇ

Do ada en çok bulunan polimer olan selüloz, insanlar tarafından binlerce yıldır kullanılmakta olup, alternatif üretim yöntemleri ile ilgili çalı malar günümüzde de halen sürdürülmektedir. ekil 1.1’de görülen selülozun yapısı oldukça basittir. Glikoz moleküllerinin -1,4-glukan ba larıyla birle mesiyle olu ur. Günümüzde selüloz do ada en çok bitkilerden elde edilmektedir. Ancak bitkilerden elde edilen selüloz saf de ildir. Lignin ve hemiselülozla birlikte bulunmaktadır. Bu ekilde saf selüloz elde edebilmek için safla tırma i lemi de yapmak gerekmektedir. Ayrıca günümüzde artan nüfus ve geli en teknoloji nedeniyle artan selüloz ihtiyacını kar ılayabilmek için daha çok alan tahrip edilmeye ba lanılmı tır. Bu durum direk olarak karbon döngüsünün de i mesine neden olmakta ve global ısınma, radyasyon, ekolojik dengenin de i mesi gibi kavramları ortaya çıkarmaktadır [1].

ekil 1.1 Selülozun kimyasal yapısı [2]

Temel selüloz elde etme yöntemleri dört ba lık altında toplanabilir. Bu dört yöntem ekil 1.2’ de toplu halde gösterilmi tir. Daha önce de bahsedildi i gibi selülozun bitkilerden elde edilip, lignin ve hemiselülozdan safla tırılması en çok tercih edilen yöntemdir. Bir di er yöntem, selülozun mikroorganizmalardan biyosentez yoluyla elde edilmesidir. Literatür verilerine dayanarak kullanılan mikroorganizmalar alg (Vallonia), mantar (Saprolegnia, Dictystelium discoideum) ve bakteri (Acetobacter, Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Sarcina,

(12)

Alcaligenes, Zoogloea) olarak sınıflandırılabilir. Seçilen mikroorganizma tipine göre elde edilen selülozun yapısı da farklılıklar göstermektedir. Ayrıca bu organizmaların hepsi ürettikleri selülozu hücre dı ına veremediklerinden, safla tırma i lemi de gerektirmektedirler. Ba ka bir yöntemde ise, selobiyozil floridden ba layarak safla tırılmı selülaz enzimi vasıtasıyla selüloz polimeri üretilmektedir. Bilinen en son yöntem ise, kemosentezle selüloz üretimidir. Bu yöntemde, glikozdan halka açma yöntemiyle polimerizasyonla selüloz üretilir [3].

ekil 1.2 Selüloz elde etme yöntemleri [3]

Günümüzde mikroorganizmalardan fermantasyon ile polimer sentezi büyük önem ta ımaktadır. Geli en dünyanın ihtiyaçlarını kar ılayabilmek ve karbon döngüsünün devamlılı ını sa layabilmek için selüloz eldesinde birçok mikroorganizma ile çalı malar yapılmı tır. Ancak bu organizmaların ço u üretti i selülozu hücre içinde tuttu undan fermantasyon maliyetleri yanında, mikrobiyal safla tırma i lemlerine de ihtiyaç duyulması yöntemin uygulanmasını zorla tırmaktadır. Selüloz sentezinde bir bakteri türü olan Acetobacter xylinum (A.xylinum) kullanıldı ında ise, elde edilen selülozun hücre dı ına verildi i ve bu nedenle herhangi bir safla tırma i lemi gerektirmedi i ve kimyasal yapısının bitkilerden elde edilen selülozla tamamen aynı oldu u görülmü tür. Mekanik özellikler kıyaslandı ında ise, bitkilerden elde edilen selülozun lignin ve hemiselülozdan safla tırılması sırasında mekanik dayanımının azaldı ı, bunun aksine A.xylinum’ dan elde edilen selülozun oldukça dayanıklı oldu u görülmü tür.

(13)

Bu çalı manın amacı, A.xylinum ile bakteriyel selüloz fermantasyonunda alternatif karbon kaynaklarının ara tırılmasıdır. Bunun için optimum fermantasyon süresi belirlenerek, basit besi yerinde uygun karbon kayna ı seçimi ile ilgili çalı malar yürütülmü ve kompleks bir besi yeri olan melasın verime etkisi ara tırılmı tır.

(14)

2. TEOR K BÖLÜM

2.1 Bakteriyel Selüloz Biyosentezi

Do ada selüloz üreten mikroorganizmalar alg, mantar, bakteri olarak sınıflandırılabilir. Ancak seçilen mikroorganizma türüne göre, elde edilen selülozun yapısı da farklılıklar göstermektedir. Tablo 2.1’ de selüloz üretebilen mikroorganizmaların listesi verilmi tir. Bu türlerden en çok tercih edileni

Acetobacter türüdür.

Tablo 2.1 Selüloz üreten mikroorganizmalar [4]

TÜR SELÜLOZ YAPISI

Acetobacter hücre dı ı, eritlerden olu an tabaka

Achromobacter lifli

Aerobacter lifli

Agrobacterium kısa lifler

Alcaligenes lifli

Pseudomonas belirgin olmayan lifler

Rhizobium kısa lifler

Sarcina ekilsiz

Zooglea belirgin olmayan lifler

A. xylinum, bilinen en etkili selüloz üreten mikroorganizmadır. Do ada meyvelerde,

meyve suyunda ve sirkede bulunur. Aerobik, gram-negatif, asetik asit bakterisidir.

A.xylinum ile üretilen selüloz, bitkiler ve di er mikroorganizmalar ile elde edilen

selülozlardan daha yüksek saflıktadır. Di er bir avantajı ise, selülozu ürettikten sonra hücre dı ına saldı ından herhangi bir safla tırma i lemi gerektirmemesidir. Tek bir

A.xylinum hücresi saniyede 200.000 adet glikoz molekülünü -1,4-glukan ba larıyla

ba layarak polimerize edebilir [5].

Bitkilerde bulunan selüloz di er polisakkaritlerle birlikte kompleks halinde hücre duvarının yapısını olu turmaktadır. A.xylinum’ da ise bunun tam tersine üretilen selüloz metabolik olarak inerttir ve saf olarak hücrenin dı ına salınmaktadır [6].

(15)

A.xylinum’ da bakteriyel selüloz biyosentezi kusursuz düzenlenmi , birkaç adımda

gerçekle en birçok enzim, katalitik ve düzenleyici protein kompleksleri içeren spesifik bir prosestir. Proses, bakteriyel selüloz prekörsırı olan üridin difosfoglikoz (UDPGlc) sentezini takiben glikozun -1,4-glukan ba larıyla polimerize olması ve olu an yüzlerce ve hatta binlerce selüloz polimerlerinin erite benzeyen karakteristik eklini almasından olu ur. UDPGlc sentezi, prosesin glikoz polimerizasyonunun moleküler mekanizması ve hücre dı ına ekstrüzyonu a amalarına göre daha bilinen bir reaksiyondur [4].

Selüloz sentezi, A.xylinum’ un dı membranı ve sitoplazmik mebranı arasında selüloz sentezleyen kompleks tarafından gerçekle tirilir. Bu kompleks aynı zamanda bakteri üzerindeki porlarla da ili kilidir. ekil 2.1’ de bu kompleks ve selüloz üretimi görülmektedir [7].

ekil 2.1 Bakteriyel selüloz olu umunun ematik gösterimi [8]

ekil 2.1’ de A ile gösterilen kısım, selüloz sentezleme bölümüdür. Tek bir bakteri hücresinde sayısız selüloz sentezleme bölümü bulunmaktadır. Her bir bölümde, 16 glukan zincirinden olu an lifler olu ur. Daha sonra bu lifler birle erek erit haline gelirler. B ile gösterilen kısım ise, membran proteini olan selüloz sentaz (AcsAB protein) ve onunla ili kili proteinlerin (AcsC and AcsD) bulundu u kısımdır. Bu proteinlere, selüloz sentezleme kompleksi adı verilir ve dı membran ile sitoplazmik membran arasında bulunurlar [8].

(16)

Elektron mikroskobuyla incelendi inde A.xylinum’ un yüzeyinde bulunan selüloz sentezleme bölümlerinin düz bir eksen üzerinde bulundu u gözlenmi tir. Her bir pordan hücre dı ına salınan 16 zincirli lif, parçalanamayan en küçük selülozik birim oldu undan, selüloz ürünün ba langıç bölümü olarak kabul edilir. Bu lifler, selülozun mikrofibril yapısı kalkoflor beyazı (Tinopal) ile boyandı ında görülebilmektedirler ve yakla ık 1,5 nm uzunlu undadırlar. ekil 2.2’ de de görülebilece i gibi selüloz yapısının olu umu rastgele gerçekle memektedir. Glukan ba larının olu umundan itibaren, liflerin, mikrofibrillerin ve son olarak da erit eklindeki selüloz makromolekülünün olu umu hiyerar ik bir düzen içinde gerçekle mektedir. Bu proses her ne kadar hücre dı ında gerçekle se de, hücre tarafından yönetilmektedir.

ekil 2.2 A. Xylinum’ da selüloz olu um mekanizması [6]

Di er bir husus ise, A.xylinum’ da polimerizasyon ve kristalizasyon a amalarının birbirini tamamlayan önemli iki proses olmalarıdır. Kristalin mikrofibrillerin olu umu, ancak -1,4-glukan zincirleri halen olu uyor iken gerçekle ebilmektedir. Polimerizasyon verimi, kristalizasyon prosesine ba lı olarak artı göstermektedir. Bu a amada, bakteriyel selüloz sentezinde sınırlayıcı adım, kristalizasyon prosesidir, denebilir [9].

Selüloz, A.xylinum’ un karbon metabolizmasının son ürünüdür. Pentoz fosfat döngüsü, krebs döngüsü ve glikoneogenez ile ili kilidir. Aerobik, asetik asit bakterisi olan A.xylinum’ da fosfofruktokinaz enzimi bulunmadı ından glikoliz gerçekle memektedir. Selüloz sentezi, katabolik bir proses olan oksidasyon ile ili kilidir ve katabolik reaksiyonlarda üretilen enerjinin yakla ık %10’ unu tüketirken protein sentezi gibi anabolik reaksiyonları engellememektedir. A.xylinum, hegzoz,

(17)

gliserol, dihidroksi aseton, pirüvat ve dikarboksilik asit gibi çe itli karbon kaynaklarını yakla ık %50 verimle selüloza çevirebilir. Bu bile ikler, krebs döngüsü, pentoz-fosfat döngüsü ve glikoneogenez sonucu biyosenteze dahil olurlar. Pentoz-fosfat döngüsü ile karbonhidratların oksidasyonu, krebs döngüsü ile organik asitlerin oksidasyonu gerçekle ir [6]. Direkt selüloz sentezleyicisi olan UDPGlc, bitkiler de dahil olmak üzere birçok organizmada oldukça yaygın kullanılan bir yol ile üretilmektedir. Bu yolda; glikoz glikokinaz katalizörlü ünde 6-fosfata, 6-fosfat fosfoglikomutaz katalizörlü ünde izomerizasyon ile 1-fosfata, glikoz-1-fosfat UDPGlc fosforilaz enzimi ile UDPGlc’ a dönü ür. Son a amada ise, selüloz sentaz enzimi ile, UDPGlc’ dan selüloz sentezlenir [4]. Bu mekanizma ekil 2.3’ te verilmektedir.

ekil 2.3 A.xylinum’ da selüloz sentezinin biyokimyasal mekanizması [7] Bu dönü üm esnasında en önemli rol, UDP-Glikoz fosforilaz enzimindedir. Selüloz-negatif mutantlar (Cel-), bu enzim bulunmadı ından, her ne kadar yüksek selüloz sentaz aktivitesi gösterseler de, selüloz sentezleyemezler. UDP-Glikoz fosforilaz aktivitesi kullanılan A.xylinum türüne ba lı olarak da de i iklik göstermektedir. Bilinen en yüksek aktivite BPR2001 türünde görülmektedir. UDP-Glikoz fosforilaz aktivitesindeki artı , selüloz veriminde de artı sa lamaktadır [4]. A.xylinum’ un bazı türleri ise karbon kayna ı olarak glikoz yerine fruktozu tercih ederler. Bu durumda izlenen yol; fruktozun fruktoz-1-fosfata, fruktoz-1-fosfatın fosfoglikoizomeraz enzimi katalizörlü ünde glikoz-6-fosfata dönü mesidir [6]. Glikoz-6-fosfat ise, ekil 2.3’ te verilen mekanizma ile selüloza dönü türülür. A.xylinum’ un karbon metabolizması ekil 2.4’ te ayrıntılı olarak verilmektedir.

Glikoz Glikokinaz Glikoz-6- Fosfat Fosfoglikomutaz Glikoz-1- Fosfat UDP-Glikoz Fosforilaz UDP-Glikoz Selüloz Sentaz Selüloz

(18)

ekil 2.4 A.xylinum’ un karbon metabolizması [4]

2.2 Bakteriyel Selüloz Fermantasyonu

Günümüze kadar, bakteriyel selüloz üretiminde de i ik fermantasyon yöntemleri kullanılmı tır. Bu yöntemler; statik yöntem, karı tırmalı yöntem, karı tırmalı tank fermantörler ve hava kaldırmalı biyoreaktörler olarak sıralanabilir. stenilen ürünün özelliklerine göre seçilen fermantasyon tipi de i iklik göstermektedir. Statik yöntem; en yaygın ve en çok bilinen yöntemdir. A.xylinum aerobik bakteri oldu undan fermantasyon hava-sıvı ara yüzeyinde gerçekle mektedir ve geni yüzey alanı gerektirmektedir. Bu nedenle oldukça maliyetli bir yöntemdir ve ticari açıdan kabul görmemektedir. Statik kültürde olu an selüloz kalın, deriye benzeyen beyaz bir tabaka halindedir. Hücre büyümesi ve fermantasyon sırasında bakteri hücreleri bu tabakaya tutunmu halde bulunurlar. Böylece selüloz hücrelerin asılı kalmasına ve oksijence zengin ortamda bulunmalarına yardımcı olur [10]. ekil 2.5’ te statik yöntemde elde edilen bakteriyel selüloz görülmektedir.

(19)

ekil 2.5 Statik kültürde elde edilen bakteriyel selüloz [4]

Statik yöntemde fermantasyon 5-20 gün arasında devam eder. Selüloz tabakasının kalınlı ı arttıkça oksijen difüzyonu zorla aca ından hücreler ölmeye ba lar. Statik yöntemin di er bir dezavantajı ise, ekim yapıldıktan sonra sisteme müdahale edilememesidir. Ortam pH’ ı ya da besi yeri kompozisyonu sürekli de i mektedir, ancak bunları optimum seviyede uzun süre tutmak bu yöntemde mümkün olmamaktadır [11].

Karı tırmalı yöntemde; statik yöntem kadar yüksek verim elde edilememesine ra men, statik yönteme göre daha çok tercih edilmektedir. Bunun nedeni; maliyeti arttırmadan ölçek büyütmeye elveri li bir yöntem olmasıdır. Karı tırmalı yöntemde elde edilen selüloz, statik yöntemin aksine, düzensiz, lifli küçük kürecikler eklindedir [4]. ekil 2.6’ da karı tırmalı yöntemde elde edilen selülozun yapısı görülmektedir.

(20)

Karı tırmalı yöntemde oksijen transferi daha iyi sa lanabilmektedir. Ancak selüloz verimi statik yönteme göre daha dü üktür. Bunun nedeni ortamda selüloz üretemeyen mutantların (Cel-) olu masıdır. Cel- hücrelerin olu umu karı tırma ve

havalandırmayla ilgilidir. Karı tırıcı tipi ve hızı seçimi bu nedenle oldukça önemlidir. Selüloz verimini arttırmak için di er bir yol ise, karı tırma ve havalandırma hızlarından etkilenmeyecek mutant A.xylinum türlerinin kullanılmasıdır [10].

ekil 2.5 ve ekil 2.6’ da da görülebilece i gibi statik ve karı tırmalı yöntemlerde üretilen selüloz ekil olarak oldukça farklıdır. Mikroskop altında mikrofibril yapıları incelendi inde yapılarındaki farklılık daha net gözlenebilmektedir. ekil 2.7’ de statik ve karı tırmalı kültürlerde elde edilen selülozun mikroskop altındaki mikrofibril yapıları verilmi tir. ekilden görüldü ü üzere, statik yöntemde elde edilen selüloz aynı eksende yer alan liflerden olu urken, karı tırmalı yöntemde düzgün olmayan, kıvrılmı ve yer yer üst üste binmi selüloz lifleri elde edilir. Ayrıca, karı tırmalı yöntemde elde edilen selüloz mikrofibrilleri statik yöntemdekilere göre daha incedir. Sürekli karı tırma esnasında olu an kuvvetler nedeniyle selüloz yapısında de i iklikler görülmektedir [12].

(A) (B)

ekil 2.7 Statik (A) ve karı tırmalı (B) ko ullarda el edilen bakteriyel selülozun SEM görüntüleri [12]

Karı tırmalı tank fermantörlerde en sık kar ıla ılan problem, zamanla selüloz olu tukça ortam viskozitesinin artmasıdır. Bu durumda karı tırmayla ilgili güçlükler ortaya çıkmakta ve oksijen transferi zorla maktadır [13]. Bu nedenle reaktör tasarımında karı tırma miktarı ve oksijen transfer kapasitesi iki önemli parametre olmaktadır [14].

(21)

Yapılan çalı malar sonucunda, ortam viskozitesini dü ürebilmek için, karı tırıcının reaktördeki sıvıyla arasındaki mesafenin mimimum olması gerekti i gözlemlenmi tir. Bakteriyel selüloz üretiminde en uygun karı tırıcı tipinin Maxblend karı tırıcı oldu u belirtilmi tir. ekil 2.8’ de karı tırmalı tank fermantörlerde kullanılan karı tırıcı tipleri ve Maxblend tipi karı tırıcıyla dizayn edilmi reaktör örne i görülmektedir [15].

(A) (B)

ekil 2.8 Karı tırıcı tipleri (A) ve Maxblend karı tırıcılı reaktör (B) [14-15] Karı tırıcılı reaktörlerde, oksijen transferini arttırmak için öncelikle karı tırıcı hızını arttırmak dü ünülmü tür. Ancak, büyük ölçekte dü ünüldü ünde istenilen hıza ula abilmek için gerekli motor gücü, proses maliyetini oldukça arttırmaktadır. Bunun yerine oksijen transferini arttırmak için, oksijence zenginle tirilmi hava kullanmak veya yüksek basınç altında çalı mak daha uygundur. Yüksek basıncın, mikroorganizmalar üzerinde inhibitör etkisi gösterdi i ve aminoasit gibi maddelerin olu umuna yol açtı ı bilinmektedir, ancak bakteriyel selüloz üretimiyle ilgili böyle bir olumsuz etki gözlenmemi tir [15].

Yapılan çalı malar sonucu, mekanik karı tırıcıların olumsuz etkisini ortadan kaldırabilmek için, bakteriyel selüloz üretiminde hava kaldırmalı reaktörlerin kullanımına ba lanılmı tır. Hava kaldırmalı reaktörlerde, oksijence zenginle tirilmi hava kullanıldı ından oksijen transferi istenildi i gibi sa lanmakta ve karı tırıcı olmadı ından daha az enerji ile çalı ılabilmektedir. Chao ve arkada ları, yaptıkları çalı mada aynı A.xylinum türünü kullanarak, mekanik karı tırıcılı reaktörlerde kullanılan enerjinin 1/5’i kadar enerji ile, hava kaldırmalı reaktörde %20 daha yüksek verimde selüloz elde etmi lerdir [16].

(22)

Hava kaldırmalı reaktörlerde olu an selülozun yapısı da karı tırıcılı reaktörlere göre farklılık göstermektedir. Hava kaldırmalı reaktörlerde selüloz, kürecikler eklinde olu urken, mekanik karı tırıcılı reaktörlerde lifli yapıdadır. ekil 2.9’ da bu fark görülmektedir [17].

(A) (B)

ekil 2.9 Mekanik karı tırıcılı (A) ve Hava kaldırmalı (B) reaktörlerde üretilen selülozun yapısı [17]

Günümüze kadar yapılan çalı malarda, endüstriyel ölçekte bakteriyel selüloz fermantasyonunda en kolay uygulanabilen, en dü ük maliyetli ve en yüksek verimin elde edildi i fermantasyon tipi, hava kaldırmalı reaktörlerdir [17].

2.3 Bakteriyel Selülozun Kullanım Alanları

Bakteriyel selüloz, yüksek saflıkta olması ve mekanik-kimyasal dayanım özelliklerinin oldukça iyi olması nedeniyle çok çe itli kullanım alanına sahiptir. üphesiz ki, bakteriyel selülozun en önemli kullanım alanı ka ıt üretimidir. Ancak üretim maliyetlerinin dü ürülememi olması nedeniyle, yüksek mekanik dayanım, yüksek yırtılma direnci gibi özelliklere sahip özel ka ıt üretimlerinde kullanılabilmektedir. Di er bir önemli konu ise, toksik gazların absorbsiyonunda kullanılan aktif karbonun yapısında %30 normal ka ıt hamuru yerine %5 bakteriyel selüloz kullanıldı ında aynı miktarda absorbsiyon yapılabilmesidir.

Sony Corp. firması tarafından üretilen hoparlör ve kulaklıklarda da bakteriyel selüloz kullanılmaktadır. Böylelikle daha yüksek ve temiz tonlarda ses elde edilebilmektedir [18].

(23)

Bakteriyel selülozun ümit vadetti i di er bir alan ise tıp sektörüdür. Yaraları sarmada kullanıldı ında, yüksek sıvı tutma kapasitesi sayesinde selülozun içindeki su istenilen medikal solüsyon ile de i tirilerek kullanılmaktadır. Ayrıca yanıklarda acıyı azaltma, enfeksiyon kapmayı önleme, kolay iyile meyi sa lama, tedavi süresini ve maliyetini azaltma gibi oldukça önemli faydaları oldu undan geçici deri olarak kullanılmaktadır [19]. ekil 2.10’ da bakteriyel selüloz ile kaplanmı bir yara görülmektedir. Ayrıca bakteriyel selüloz, yapay kan ve lenf damarlarının ve idrar yollarının yapısında da kullanılmaktadır [20]. Sıvı haldeyken yüksek mekanik dayanıma sahip olması, biyolojik olarak uyumlu olması ve insan ve hayvan vücudunda sindirilememesi gibi avantajlarından dolayı medikal alanda oldukça ümit vermektedir.

ekil 2.10 Bakteriyel selüloz ile kaplanmı yara [19]

Ara tırmacılar bakteriyel selülozun fiziksel ayırma i leminde membran olarak kullanılması konusunda da çalı malar yürütmektedir. Amperometrik glikoz sensörlerinde, bakteriden elde edilen selüloz kullanıldı ında, a açtan elde edilen selüloza göre 6-7 kat daha uzun süre stabiliteyi koruyabildi i açıklanmı tır. Bakteriyel selülozla kaplanmı sensörler seyreltilmi kan içerisinde 200 saate kadar dayanım gösterirken, seyreltilmemi kanda 24 saat dayanabilmektedirler. Bu çalı manın sonucunda, klasik amperometrik glikoz sensörlerin ömrününün bakteriyel selüloz ile kaplanarak oldukça arttırılabilece i açıklanmı tır. Ayrıca bakteriyel selüloz, suda çözünebilen karboksimetil selüloz (CMC), polietilen glikol (PEG) gibi di er polimerler ile de kompozit malzemeler olu turarak, membran yapısının ve por büyüklüklerinin ayarlanmasına olanak sa lamaktadır.

(24)

Bakteriyel selüloz için gelecek vadeden di er bir konu ise, elektronik ka ıt üretimidir. Brown ve Shah, bakteriyel selüloz katmanının içine elektronik boyayı gömmü lerdir. Daha sonra bu katmanı effaf elektrodların arasına yerle tirmi lerdir. Ba langıçta sistem düz beyaz bir ka ıt gibi görülmektedir, ancak elektrodlara elektrik akımı verildi inde boyanın rengi koyulmaya ba lamı ve elektrik akımı kesildikten sonra da rengini korumu tur. Dü ük enerji tüketimi bu sistemin önemli avantajlarından biridir. Sisteme daha sonra ters akım uygulandı ında, boyanın renginin açıldı ını ve ba taki düz beyaz ka ıt görünümünü tekrar aldı ı belirtilmi tir. Bakteriyel selülozla üretilen elektronik ka ıdın di er bir avantajı da, görüntünün normal ka ıtla elde edilen görüntüyle aynı olmasıdır [21]. ekil 2.11’ de elektronik ka ıdın bir görüntüsü verilmi tir.

ekil 2.11 Elektronik ka ıt [21]

Bakteriyel selüloz gıda sektörüne de hizmet verebilmektedir. Dü ük kalorili içeceklerde, pastane ürünlerinde, dondurma üretiminde kullanılmaktadır. Dü ük kalorili çikolatalı içeceklerde kıvam arttırıcı olarak %3 xantan reçinesi kullanılmaktadır. Bunun yerine aynı miktarda bakteriyel selüloz ilave edildi inde aynı viskozite elde edilebilmektedir. Ancak, ürüne ısıl i lem uygulandı ında xantan reçinesi kullanılan içecekte viskozite dü erken, bakteriyel selüloz kullanılan içecek kıvamını korumaktadır. Di er bir ilginç ara tırma ise, dondurma üretiminde yapılmı tır. Dondurmaya bakteriyel selüloz ilave edildi inde, dondurma erise bile selülozun yüzey geriliminden ötürü akmamaktadır. Bakteriyel selülozun gıda sektöründe kullanımı ürünün kalitesini oldukça arttırmaktadır.

(25)

Biyoreaktör dizaynlarında yapılacak iyile tirmeler, dü ük maliyetli hammadde kullanımı gibi iyile tirmeler ile verimin ve üretim ölçe inin arttırılması ile bakteriyel selüloz gelecekte endüstriyel kullanım için oldukça cazip bir hale gelebilecektir.

2.4 Literatür Çalı maları

Bu bölümde, A.xylinum kullanılarak bakteriyel selüloz üretimiyle ilgili literatürde yapılan çalı malardan örnekler verilecektir.

Hong-Joo Son ve arkada ları, elmadan izole ettikleri A. Xylinum türü olan A9’ un statik yöntem yanında çalkalamalı yöntemde de yüksek verimle selüloz üretebildi ini göstermi ve fermantasyon ko ullarını optimize etmi lerdir. Bu çalı maya kadar, selüloz üretiminde statik yöntem kullanılmı tı. Bunun nedeni çalkalamalı fermantasyon prosesi esnasında Cel- mutantların olu ması ve verimin oldukça dü mesiydi. Ancak endüstriyel ölçekte dü ünüldü ünde statik yöntem ile selüloz üretimi için çok geni yüzey alanına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu durum, prosesin verimlili ini oldukça dü ürmektedir. Hong-Joo Son ve arkada ları, izole ettikleri A9 türü ile hem statik, hem de çalkalamalı fermantasyon prosesinde aynı ölçüde yüksek verim elde edebilmi lerdir. Yaptıkları çalı malarda, bu türün 200 dev/dk’ da bile selüloz üretme yetene ini kaybetmedi ini yüzey gerilimine kar ı dayanıklı oldu unu gözlemlemi lerdir. Çalı malarına, a ırlıkça %2 glikoz, %0.5 polipepton, %0.675 Na2HPO4.12H2O, ve %0.115 sitrik asit monohidrat içeren distile su ile hazırlanmı

besi yeri kullanarak ba lamı ve bu besi yeri üzerinde modifikasyonlar yapılmı tır. Çalı malarında ayrıca sıcaklık etkisini incelemi lerdir. 20 ile 40 0C arasındaki

sıcaklıklarda fermantasyon gerçekle tirilmi tir. 25-30 0C arasında en yüksek verimin

elde edildi ini ve 35 0C’ nin üstünde selüloz üretiminin azaldı ını görmü lerdir. pH

3.0-9.0 arasında çalı arak pH etkisini gözlemlemi ler ve pH 6.5’ te maksimum verime ula ıldı ını görmü lerdir. Literatürde pH 4.5-7.5 arası optimum çalı ma pH’ ı olarak kabul edilmektedir. Fermantasyon ko ulları belirlendikten sonra karbon kaynaklarının etkisini incelemi lerdir. En yüksek verim, karbon kayna ı olarak glikozun kullanıldı ı besi yeri ile elde edilmi tir. Çalı mada daha sonra farklı azot kaynaklarının etkisi incelenmi tir. En yüksek verim azot kayna ı olarak maya ekstratı kullanıldı ında elde edilmi tir. Ancak maya ekstraktı endüstriyel ölçekte ekonomik olmadı ından mısır urubunun kullanılabilece ini belirtmi lerdir. Daha

(26)

%0-1.0 oranlarında besi yerine Na2HPO4.12H2O ekleyerek selüloz verimine

bakılmı tır. En yüksek verimin %0.8 Na2HPO4.12H2O eklendi inde elde edildi ini

görmü lerdir. Bu oranın altında ya da üstünde selüloz veriminde dü ü gözlenmi tir. Sitrik asidin ise selüloz verimine etkisinin olmadı ı görülmü tür, bu nedenle daha sonraki çalı malarını sitrik asitsiz besi yeri hazırlayarak sürdürmü lerdir. Son olarak fermantasyon verimine etanol ve organik asitlerin etkisini incelemi lerdir. %4 glikoz içeren besi yerine %0.2 oranında etanol, asedik asit, fumalik asit, laktik asit, malik asit, pirüvik asit, sükisinik asit ilave ederek selüloz verimini ölçmü lerdir. En yüksek selüloz verimi ortamda etanol varken elde edilmektedir. Ortama %1.4 oranında etanol ilave edildi inde etanolsüz besi yerine oranla verimin 4 kat arttı ını gözlemlemi lerdir. Etanol, Cel+ bakterilerin Cel-’ e dönü mesini engelledi i için verimi oldukça arttırmaktadır. Bu sonuçlara göre çalı malarının sonunda A9 türü için optimum besi yerini, pH 6.5’da %4 glikoz, %0.1 maya ekstraktı, %0.7 polipepton, %0.8 Na2HPO4.12H2O ve %1.4 etanol olarak belirlemi lerdir [22].

Krystynowicz ve arkada ları, çalı malarında A. Xylinum E25 türünü kullanarak

optimum fermantasyon ko ullarını sa lamaya çalı mı lardır. Yaptıkları çalı malar sonucunda kullandıkları türün statik ko ullarda çok daha stabil oldu unu ve yüksek verimle selüloz üretti ini, buna kar ılık karı tırmalı fermantasyon sırasında Cel -mutantların olu tu unu ve bu -mutantların olu umunun kullanılan medya kompozisyonuna ba lı oldu unu gözlemlemi lerdir. Ara tırıcılar çalı malarında karı tırmalı ve havalandırmalı kültürlerde selüloz üretmeyen mutantların olu umunun oldukça arttı ını ve selüloz veriminin dü tü ünü belirtmi lerdir. Bunun nedeni, statik ko ullarda selüloz üreten hücrelerin oksijence zengin olan besi yeri-hava ara yüzeyine do ru hareket edip burada selüloz membranı olu turarak oksijenin alt kısımlara inmesini sınırlandırması, karı tırmalı ko ullarda ise, e it havalandırma sa landı ından hücrelerin selüloz üretmek yerine ço almayı tercih etmesi eklinde açıklamı lardır. Bu sonuca göre de i ik besi yeri kompozisyonlarının statik ve karı tırmalı kültürlerde Cel- mutantların olu umuna etkisi incelenmi tir. Statik ko ullarda de i ik besi yeri kompozisyonlarının ve etanolün mutant olu umuna etkisinin olmadı ını, ancak karı tırmalı kültürlerde %80’ e kadar mutant olu umu gerçekle ti ini gözlemlemi lerdir. Ara tırmacılar, HS besi yerinde bir takım modifikasyonlar yaparak optimum besi yerini belirlemi lerdir. Buna göre, standart besi yerine %1 etanol ve %0.05 MgSO4.7H2O eklemi lerdir. Ortamda etanol

(27)

bulunması hücre konsantrasyonu ve üretim hızını arttırmı tır. Bunun nedeni, etanolün sistemde ilave enerji kayna ı olarak kullanılarak ATP olu umunu arttırması ve böylece glikozun sadece selüloz üretiminde kullanılması eklinde açıklanmı tır. Çalı ma, farklı ba langıç glikoz konsantrasyonlarıyla sürdürülmü ve dü ük glikoz konsantrasyonlarının verimi arttırdı ı tespit edilmi tir. ekil 2.12’ den de görülebilece i gibi, en yüksek selüloz verimi ve en kalın selüloz membranı glikoz konsantrasyonu 20 g/L iken elde edilse de, kuru a ırlıktaki en yüksek selüloz miktarı glikoz konsantrasyonu 5g/L iken elde edilebilmi tir. Bu durumun bakteriyel selüloz üretim maliyetlerinin azaltılmasında büyük ölçüde önemli olaca ı çalı mada ayrıca belirtilmi tir [23].

ekil 2.12 De i ik ba langıç glikoz konsantrasyonlarının selüloz verimine etkisi [23] Ramana K.V. ve arkada ları, Hindistan Ulusal Koleksiyonundan temin ettikleri

A.xylinum türü ile bakteriyel selüloz üretiminde, de i ik karbon ve azot

kaynaklarının etkisini incelemi lerdir. Karbon kayna ı olarak, sorbitol, glikoz, galaktoz, laktoz, asetik asit, mannitol, maltoz, ni asta ve sakkaroz kullanmı lardır. Hazırladıkları besi yeri kompozisyonu; 50g/L karbon kayna ı, 5 g/L amonyum sülfat, 5 g/L maya ekstraktı, 0,05 g/L MgSO4.7H2O eklindedir. Kullandıkları her

karbon kayna ına kar ılık, besi yerindeki amonyum sülfat yerine de i ik azot kaynakları kullanmı lardır. Bunlar, kazein hidrolizatı, glisin, soya fasulyesi, pepton ve sodyum glutamattır. Çalı malar sonunda, optimum azot kayna ının karbon kayna ı seçimiyle oldukça ili kili oldu unu görmü lerdir. Karbon kayna ı sakkaroz veya mannitol olarak seçildi inde mikroorganizma azot kayna ı olarak kazein hidrolizatı veya peptonu tercih etmektedir. Di er karbon kaynakları, sorbitol,

(28)

galaktoz, maltoz, ni asta ve asetik asit, oldukça dü ük verimle selüloz üretebilmektedir. Bu karbon kaynakları kullanıldı ında elde edilen selüloz verimi 0.4-2.0 g/L arasında de i mektedir. Azot kaynakları kıyaslandı ında ise, karbon kayna ı olarak glikoz, mannitol, sukroz kullanıldı ında en iyi verimin pepton, kazein hidrolizatı ve amonyum sülfat ile elde edildi ini gözlemlemi lerdir. Bu sonuçlar

ekil 2.13’ de verilmektedir.

ekil 2.13 A.xylinum’ da de i ik karbon ve azot kaynaklarının bakteriyel selüloz verimine etkisi. Karbon kaynakları: (A) sakkaroz, (B) glikoz, (C) mannitol, azot kaynakları: (1) amonyum sülfat, (2) pepton, (3) sodyum glutamat, (4) kazein hidrolizat, (5) glisin, (6) soya fasulyesi [24]

Ara tırmacılar, A.xylinum ile bakteriyel selüloz üretiminde uygun karbon kaynaklarının glikoz, mannitol ve sakkaroz, azot kaynaklarının ise, kazein hidrolizat, pepton, glutamat ve amonyum sülfat oldu unu belirtmi lerdir. Bu çalı mayla dü ük maliyetle selüloz elde etmenin besi yeri optimizasyonu ile sa lanabilece ini göstermi lerdir [24].

Sherif Keshk ve arkada ları, melaslı besi yerinin etkisini A.xylinum ATCC 10245 türünü kullanarak incelemi lerdir. Çalı malarında glikoz ve eker pancarından elde edilen melaslı besi yerini paralel incelemi ve karbon kayna ının verime etkisini gözlemlemi lerdir. Çalı malarına ba larken, A.Xylinum ATCC 10245’ i klasik HS besi yerinde canlandırmı lardır. Daha sonra bu kültürden 0.5 ml alarak klasik HS veya modifiye edilmi besi yerinin 15 mL’ sine ekim yapmı lardır. 28 0C’ de, pH 6’ da statik ko ullarda, 5-7 gün fermantasyon gerçekle tirmi ler ve elde edilen selülozu safla tırmı lardır. Çalı maları sonucunda elde edilen selüloz verimleri Tablo 2.2’ de verilmektedir. Tartılan selüloz miktarları 250 mL sıvı besi baz alınarak

(29)

hesaplanmı tır. Tablodan da görülebilece i gibi besi yerindeki glikoz konsantrasyonu azaltılıp melas konsantrasyonu arttırıldıkça selüloz veriminde de artı gözlenmektedir. Çalı mada, bakteriyel selüloz üretiminde kompleks besi yeri olan melasta, glikozlu besi yerine göre daha yüksek verim elde edildi ini ve elde edilen selülozun fiziksel yapısında herhangi bir de i iklik gözlenmedi i belirtilmi tir. Ayrıca, yüksek olan üretim maliyetlerini dü ürmede melaslı besi yeri kullanımının oldukça avantajlı olaca ı da vurgulanmı tır [25].

Tablo 2.2 Besi yeri kompozisyonuna göre bakteriyel selüloz verimi [25] Glikoz (g) Melas (g) Selüloz (g)

2.0 0.0 1.34 1.8 0.2 1.40 1.4 0.6 1.44 1.0 1.0 1.50 0.6 1.4 1.56 0.2 1.8 1.60 0.0 2.0 1.75

Sangok B. ve Makota S., yaptıkları çalı mada melas kullanarak kesikli fermentasyon ile bakteriyal selüloz üretme çalı maları yapmı lardır. Yaygın yöntemler kullanılarak selüloz üretimi kültivasyon süresinin uzun olması ve glikoz, fruktoz, sukroz gibi karbon kaynaklarının pahalı olması nedeniyle ekonomik olmamaktadır. Bu nedenle daha etkin üretim metodlarının geli tirilmesi ve daha ucuz karbon kaynaklarının bulunması çok büyük önem ta ımaktadır. eker üretiminin en önemli yan ürünü olan melas, günümüzde en ucuz karbon kayna ı olması nedeniyle mikrobiyal çalı malarda büyük önem ta ımaktadır. Laktik asit, polihidroksibütirat (PHB), etanol, pullulan ve xantan gibi önemli ürünlerin fermantasyonunda melas kullanılmaktadır. Sangok B. ve çalı ma arkada ları A.xylinum BPR2001 ve melas kullanılarak bakteriyel selüloz üretmi lerdir. Melas, fermantörde kullanılmadan içindeki safsızlıklardan ve a ır metallerden arındırılmı tır. Bunun için sıcaklık-H2SO4

safla tırma yöntemi uygulanmı tır. ekil 2.14’ te fermantasyon proseslerinde kullanılan fermantör görülmektedir.

(30)

ekil 2.14 Fermantörün ematik gösterimi. (1)hava kompresörü, (2)akı ölçer, (3)hava filtresi, (4)numune alma bölümü, (5)pH elektrodu, (6)DO probu, (7)sıcaklık elektodu, (8)inokülasyon ve besleme nozülü, (9)ısıtıcı, (10)havalandırma bölümü, (11)4 N NaOH, (12)4 N H2SO4, (13)besi yeri, (14)besi yeri pompası, (15)gaz çıkı ı,

(16)O2-CO2 gaz ölçer, (17)kontrol paneli, (18)kaydedici [26]

Ara tırmacılar, A.xylinum BPR2001’ in karbon kayna ı olarak fruktoz kullanıldı ında yüksek verimde selüloz üretebildi ini görmü lerdir. Yüksek melas konsantrasyonlarında hücre ço alması yava ladı ından selüloz verimi dü mü , buna kar ılık dü ük melas konsantrasyonlarında (20g/L), fruktoz ile aynı miktarda selüloz üretilebildi i görülmü tür. Çalı mada, kesikli fermantasyonda, dü ük eker konsantrasyonlarında melaslı besi yeri kullanımının oldukça avantajlı oldu u ve Melasın maliyetinin fruktozun 1/250’si oldu u dü ünüldü ünde, bakteriyel selüloz üretiminde melasın oldukça önemli bir karbon kayna ı olaca ı sonucuna varılmı tır [26].

(31)

3. DENEYSEL ÇALI MALAR

3.1 Kullanılan Hammaddeler 3.1.1 Mikroorganizma

Bu çalı mada, Alman kültür koleksiyonu DSMZ’ den alınan 2325 numaralı

A.xylinum kullanılmı tır. Mikroorganizma ekil 3.1’ de gösterildi i gibi liyofilize

olarak temin edilmi ve laboratuarda canlandırılmı tır.

ekil 3.1 Liyofilize A.xylinum [27]

Ampul ekil 3.2’ de gösterildi i gibi açılmı ve mikroorganizma canlandırılmı tır. Steril ortamda ampul ba lı ı alevde ısıtılmı , daha sonra cımbızla kırılmı tır, içteki ampul çıkarılmı tır. Daha sonra ampulde bulunan steril pamuk yine cımbız yardımıyla çıkarılarak liyofilize mikroorganizma peleti önceden hazırlanmı ve steril edilmi besi yerine ekilmi tir.

(32)

3.1.2 Melas

Melas, eker pancarı veya eker kamı ından eker üretme prosesinde bir yan ürün olarak açı a çıkmaktadır. Melasın kalitesi, eker pancarı veya kamı ının olgunlu una, ekstrakte edilen eker miktarına ve ekstrüksiyon yöntemine ba lı olarak de i im gösterebilmektedir. Çalı mada kullanılan ve eker pancarından elde edilen melas, Ankara-Türkiye eker fabrikaları A. ’ den temin edilmi olup, birinci kalite melastır.

3.1.2.1 eker Kamı ından Melas Eldesi

eker kamı ı ezilerek yapraklarından ayrılır ve ezilerek suyu ekstrakte edilir. Daha sonra bu sıvı kısım kaynatılarak, suyu uçurulur ve kristalize eker elde edilir. eker ayrıldı ında elde edilen kısım birinci melastır. Bu i lemle ekerin tamamı kristalize edilemedi inden, melastaki eker konsantrasyonu oldukça yüksektir. Bu ekilde kaynatma i lemi üç kez tekrarlanır. Üçüncü kaynatmanın sonunda elde edilen melas oldukça koyu renklidir ve rafine edilmi eker olan sakkaroza göre vitamin ve minarelce oldukça zengindir. Ayrıca kalsiyum, magnezyum ve demir de içermektedir. Bir yemek ka ı ı melas günlük mineral ihtiyacının %20’ sini kar ılamaktadır [28]. ekil 3.4’ te eker kamı ı görülmektedir.

(33)

3.1.2.2 eker Pancarından Melas Eldesi

eker pancarından elde edilen melas eker kamı ından elde edilene göre farklıdır. Ara kademelerde elde edilmez, son kristalizasyon prosesinden sonra elde edilir. Yakla ık %50 oranında eker içerir. Bu eker büyük oranda sakkarozdur, ancak glikoz ve fruktoz da içermektedir. Hayvan yeminde katkı olarak kullanılmaktadır [29]. ekil 3.5’ te eker pancarı görülmektedir.

ekil 3.4 eker Pancarı [30]

eker kamı ı ve eker pancarından elde edilen melasın mineral içeri i açısından kar ıla tırılması Tablo 3.1’ de verilmi tir.

Tablo 3.1 Melastaki Mineraller [28]

Mineral eker kamı ı eker pancarı

Bakır (mg/kg) 36 13

Demir (mg/kg) 249 117

Manganez (mg/kg) 35 10

Çinko (mg/kg) 13 40

Melastaki vitaminler ise Tablo 3.2’ de kıyaslanmaktadır. Tablo 3.2 Melastaki Vitaminler [28]

Vitamin eker kamı ı eker Pancarı

Biotin (mg/kg) 0.36 0.46 Kolin (mg/kg) 745 716 Pantotenik Asit (mg/kg) 21.0 7.0 Riboflavin (mg/kg) 1.8 1.4 Tiamin (mg/kg) 0.9 -

(34)

Tablo 3.1 ve 3.2’ den de görülebilece i gibi eker kamı ından elde edilen melas vitamin ve minarelce eker pancarından elde edilen melasa göre oldukça zengindir. Bu özelli inden dolayı eker kamı ından elde edilen melas besin kayna ı olarak ticari bir de ere sahipken, eker pancarından elde edilen melasın böyle bir kullanımı yoktur. Bu nedenle fermantasyon prosesinde de erlendirilmesi, alternatif bir kullanım alanı yaratmanın yanında, proses maliyetlerini de dü ürmeye yardımcı olabilecektir.

3.1.3 Besi yeri

Besi yeri hazırlanırken kullanılan tüm kimyasallar Merck ve Reidel-de Haen firmalarından temin edilmi tir. Mikroorganizma canlandırılırken Hestrin & Schramm (HS) besi yeri kullanılmı tır. Besi yeri kompozisyonu, a ırlık/hacimce %2 glikoz, %0.5 pepton, %0.5 maya ekstraktı, %0.27 Na2PO4, %0.15 sitrik asit monohidrattan

olu maktadır. Distile su ile hazırlanan besi yeri 1 N asetik asit ile pH 5.0’ e ayarlanmı tır. Daha sonra 121 0C’ de 30 dk otoklavlanmı tır. So utulan besi yerinin 50 mL’ si 250 mL’ lik erlene alınmı ve liyofilize haldeki mikroorganizma ilave edilerek 30 0C’ de 7 gün bekletilmi tir. 7. günün sonunda erlende selüloz olu umu gözlenmi tir. Daha sonra bu kültürden stok hazırlanmı tır. Stok hazırlarken öncelikle distile su ile %60’ lık gliserol çözeltisi hazırlanmı ve otoklavlanmı tır. Daha sonra steril ortamda ependorf tüplere 100 µL kültür, 1000 µL gliserol çözeltisi ilave edilmi , hazırlanan stoklar -80 0C’ de saklamaya alınmı tır. Daha sonraki çalı malarda bu stoklar kullanılmı tır. Hazırlanan stoklar ekil 3.3’ te gösterilmektedir.

(35)

3.2 Fermantasyon

Stok hazırlandıktan sonra ölçek büyütülmü tür. Ölçek büyütülürken; ilk olarak 50 ml’ lik erlene 1/5 oranını sa lamak için 10 ml sıvı besi yeri koyulmu , üzerine stok ilave edilmi ve 30 0C’de 150 rpm’ de 2 gün bekletilmi tir. Daha sonra 100 ml’ lik erlene 18 ml saf besi yeri 2 ml önceki kültürden koyularak aynı ko ullarda yine 2 gün karı tırıcıda bırakılmı tır. Daha sonra 250 ml’ lik erlene 45 ml saf besi yeri 5 ml 100’lük erlendeki kültürden ilave edilerek fermantasyon sonuna kadar statik büyümeye bırakılmı tır. Erlende selüloz olu umu ekil 3.6’ da görülmektedir.

ekil 3.6 Bakteriyel Selüloz Olu umu

Fermantasyon sonrası elde edilen bakteriyel selüloz safla tırılmı tır. Safla tırma i lemi gerçekle tirilirken elde edilen selüloza, canlı hücrelerden tamamen arındırmak için 4200 rpm’ de 15 dk santrifüj i lemi uygulanmı ve süzülmü , böylece selüloz sıvı kısımdan ayrılmı tır. Daha sonra selüloz 0,1 N NaOH çözeltisinde 80 0C’ de 20 dk bekletilmi ve asetik asit ile yıkanarak nötralle tirilmi tir. Son olarak distile su ile yıkanarak 85 0C’ de a ırlı ı sabitlenene kadar 4 saat kurutulmu ve tartım alınarak kaydedilmi tir. Elde edilen bakteriyel selülozun kurutma i leminden önceki ve sonraki halleri ekil 3.7’ de görülmektedir. Bakteriyel selüloz, yüksek su tutma kapasitesinden dolayı kurutma i leminden sonra oldukça incelmektedir.

(36)

(A) (B)

ekil 3.7 Safla tırma i leminden sonra elde edilen bakteriyel selüloz (A), kurutulmu bakteriyel selüloz (B)

Çalı malar süresince kirlenme olup olmadı ı belli aralıklarla gözlemlenmi tir. Bunun için, sıvı Hestrin & Schramm besi yerine %1.5 agar ilave edilerek, petrilere dökülmü , kuruması beklenmi ve 50 L kültür ekilmi tir. Cam özeyle yayılmı ve sıcak odada (30 0C) bir hafta bekletilmi tir. Koloni olu umu gözlendikten sonra,

olu an bu koloniler mikroskop altında literatürdekilerle kıyaslanmı tır. Kirlilik olu umu gözlemlenmemi tir. Elde edilen koloniler ekil 3.8’ de görülmektedir.

ekil 3.8 A.xylinum kolonileri

3.2.1 Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi

Fermantasyon süresinin belirlenmesi için, alınan stok, içinde10 mL HS besi yeri olan 50 mL’ lik erlene ekilmi , statik ko ullarda 30 0C’ de 3 gün bekletilmi tir. Daha sonra içinde 18 mL taze besi yeri olan erlene önceki kültürden 2 mL ilave edilerek yine aynı ko ullarda 3 gün bekletilmi ve bu süre sonunda deney ba latılmı tır. Deney süresince kontrollü 4 set ile çalı ılmı tır. 250 mL’ lik erlenlere 45 mL saf HS besi yeri, 5 mL önceki kültürden ekim yapılmı tır. Statik ko ullarda 30 0C’ de

(37)

fermantasyon gerçekle tirilmi tir. 3., 7., 10. ve 14. günlerde olu an selüloz safla tırılıp tartım alınmı , HPLC (Shimadzu) cihazı ile ortamdaki glikoz konsantrasyonu belirlenmi , spektrofotometre (Shimadzu) ile 600 nm’ de optik yo unluk (OD) ölçülmü tür. Sonuçlar göz önüne alınarak optimum fermantasyon süresi belirlenmi tir. Bundan sonraki çalı malarda bu süre kullanılmı tır.

3.2.2 Uygun Karbon Kayna ı Seçimi

Çalı manın bu bölümünün amacı, HS besi yerinde karbon kayna ını de i tirerek en yüksek verimde selüloz üreten karbon kayna ını tespit etmektir. Bunun için, glikoz yerine maltoz, fruktoz ve sakkaroz a ırlık/hacimce %2 oranında olacak ekilde besi yerine ilave edilmi tir. Fermantasyon süresi sonunda elde edilen selüloz safla tırılıp tartılarak uygun karbon kayna ı seçilmi tir.

3.2.3 Bakteriyel Selüloz Fermantasyonunda Melas Kullanımı

Çalı manın bu bölümünün amacı, kompleks besi yeri olan melasın bakteriyel selüloz sentezinde alternatif besin kayna ı olarak kullanılabilirli ini ara tırmaktır. Bunun için öncelikle melasta eker tayini yapılmı , daha sonra safsızlık ve a ır metallerden arındırmak için ısıl-H2SO4 i lemleri yapılmı ve farklı eker konsantrasyonlarında

melas çözeltileri hazırlanmı tır. 3.2.3.1 Melasta eker Tayini

Melas, sakkaroz ve indirgen ekerler içermektedir. Sakkaroz bir disakkarittir ve hidrolize edildi inde 2 monosakkarite dönü mektedir, bunlar glikoz ve fruktozdur. Sakarozun kimyasal yapısı ekil 3.9’da görülmektedir.

ekil 3.9 Sakkarozun açık formülü [31]

Melastaki eker miktarını tayin etmek için titrasyon, gravimetrik ve kolorimetrik yöntemler kullanılmaktadır. Bu çalı mada, bir titrasyon yöntemi olan Lane-Eynon

(38)

metodu kullanılmı tır. Metodun temeli, bürette bulunan eker çözeltisinin, erlende bulunan kaynayan bakır sülfat çözeltisi ve indikatör olan metilen mavisiyle titre edilerek, fruktoz, glikoz gibi indirgen ekerlerin bakır sülfatla reaksiyona girmesini sa lamaktır. Ortamdaki bakır sülfat tükendikten sonra eklenen ilk eker damlası rengi maviden beyaza döndürecektir. Eklenen eker miktarı kaydedilerek, indirgen eker miktarı hesaplanır. Ancak bu yöntemin en büyük dezavantajı, indirgen ekerlerin türünün hesaplanamamasıdır [32].

Çalı maya ba larken, 5 gr melas tartılmı , saf su ile 250 mL’ ye seyreltilerek %2’ lik eker çözeltisi elde edilmi tir. Daha sonra bu eker çözeltisinden 25 mL örnek alınarak tekrar saf su ile 100 mL’ ye seyreltilmi %0.5’ lik eker çözeltisi elde edilmi ve bu elde edilen çözelti bürete alınmı tır. Erlene ise, 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltisi alınıp, üzerine büretteki çözeltiden 10 mL ilave edilerek ısıtılmaya ba lanmı tır.

Fehling A çözeltisi hazırlanırken, 69.28 gr CuSO4.5H2O 1 lt. distile suda çözülür,

Fehling B çözeltisi hazırlanırken ise, 346 gr ‘Rochelle’ tuzu (KNaC4H4O6.4H2O) ve

120 gr NaOH 1 L distile suyla tamamlanır.

Erlendeki çözelti kaynamaya ba ladı ında 3-4 damla metilen mavisi ilave edilerek, titrasyon ba latılmı tır. Mavi renkte bir de i im gözlenmedi inden, kullanılan melasta indirgen eker bulunmadı ı tespit edilmi tir.

Bu çalı manın kontrolünü yapabilmek için, aynı i lemler %2’ lik çözelti ile de tekrarlanmı tır. Erlene 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltileri koyulmu , üzerine büretteki %2’ lik eker çözeltisinden 10 mL ilave edilerek ısıtılmaya ba lanmı tır, kaynama ba layınca da metilen mavisi eklenerek titrasyon yapılmı tır. Çalı ma sonunda daha deri ik bir çözelti ile çalı ılmasına ra men renk de i imi gözlenemedi inden, melasın içinde indirgen eker bulunmadı ı kesinle tirilmi tir.

Bu çalı madan sonra sakkaroz miktarının tayini için inversiyon yapılmı tır. Erlene 25 ml %2’ lik eker çözeltisi koyulup, üzerine 1 N HCl çözeltisinden 15 mL ilave edilmi ve kaynatılmı tır. Daha sonra çözelti so utulmu ve bazik hale getirebilmek için renk pembeye dönene kadar %10’ luk NaOH ilave edilmi , hazırlanan bu çözelti bürete alınmı tır. Erlene ise, 12.5 mL Fehling A ve 12.5 mL Fehling B çözeltileri koyulmu ve ısıtılmaya ba lanmı tır. Kaynama ba layınca 3-4 damla

(39)

metilen mavisi eklenerek mavi renk kaybolup, effafla ıp, alt tabakada çökelti olu ana kadar titrasyon yapılmı tır. Renk döndü ünde, büretteki çözelti sarfiyatı 41.6 mL olarak kaydedilmi tir. Standart tablodan bu miktara kar ılık gelen invert eker de eri 124.85 olarak okunmu tur. Buradan toplam eker miktarı hesaplanmı tır. Toplam eker miktarı = (invert eker de eri *100) / çözelti sarfiyatı (3.1) e itli i ile hesaplanır. Buna göre,

Toplam eker miktarı = (124.85*100) / 41.6 = 0.3 mg’ dır.

Melastaki toplam eker konsantrasyonu = (0.3 / 0.5) * 100 (3.2) = % 60

Melastaki gerçek eker konsantrasyonu, hesaplanan toplam eker konsantrasyonunun %95’ i olarak kabul edilmektedir. Bu durumda;

Gerçek eker konsantrasyonu = 60*0.95

= %57 olarak hesaplanır.

Çalı mada kullanılan melas indirgen eker içermedi inden, bu %57’ lik ekerin tamamı sakkarozdan olu maktadır.

3.2.3.2 Melasa Uygulanan Ön lemler

Melas, fermantasyon prosesinde kullanılmadan önce içindeki safsızlıklardan arındırmak için ön i leme tabi tutuldu. Öncelikle 50 g melas tartıldı ve distile su ile 250 ml’ ye tamamlandı. Çözelti homojen olana kadar karı tırıldı ve katı partiküllerin ayrılması için 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edildi. Daha sonra çöken kısım süzülerek ayrılmı , kalan sıvı kısım ise, öncelikle ısı daha sonra ısı-H2SO4 muamelesi ile

fermantasyonda kullanılacak hale getirilmi tir.

Isıl i lemde, çözelti 120 0C’ de 20 dk ısıtılmı ve daha sonra oda sıcaklı ında bir

gece bekletilmi tir. Ertesi gün çözelti 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülmü tür.

Daha sonra 4 N H2SO4 ile pH 3.0’ e ayarlandı ve oda sıcaklı ında bir gece

bekletilmi tir. Ertesi gün 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülerek sıvı kısım ayrılmı tır. Bu sıvı kısım, 120 0C’ de 20 dk ısıtılmı ve oda sıcaklı ında bir gece bekletilmi tir. Ertesi gün tekrar 6000 rpm’ de 20 dk santrifüj edilmi ve süzülerek safsızlıklardan arındırılmı tır. Fermantasyon süresince bu safla tırılan

(40)

3.2.3.3 Farklı Konsantrasyonlarda Melas Çözeltilerinin Hazırlanması

Deney süresince 4 farklı konsantrasyonda melas çözeltisi hazırlanarak fermantasyon gerçekle tirildi ve konsantrasyonun selüloz verimine etkisi incelendi. Bu nedenle çalı maya ba lamadan önce melastaki eker konsantrasyonu belirlendi.

Melas ön i leme tabii tutulurken, 50 g melas alınıp, 250 ml’ ye tamamlanmı tı. Bu durumda melas konsantrasyonu;

d = m/V (3.3) e itli inden

d = (50g*0,57)/0,25L

= 114 g/L olarak hesaplanır.

Ön i lem sırasında 12,5 mL 4N H2SO4 ile muamele yapıldı ından ba langıçtaki eker

konsantrasyonu de i mi tir. Bu de i im;

d = (d1V1 + d2V2)/ (V1 + V2) (3.4)

e itli i ile hesaplanır.

d = (114*0,25 + 0*0,0125)/ (0,25 + 0,0125) d = 108,6 g/L olarak belirlenir.

eker konsantrasyonu 108,6 g/L olarak belirlenen bu çözeltiden, 50’ er mL’ lik sırasıyla 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L ve 80 g/L olmak üzere 4 farklı çözelti hazırlandı. Bu konsantrasyonları elde edebilmek için;

20 g/L = (108,6* V1) + (0*VSU) / 50 (3.5)

e itli inden yararlanıldı.

Bu durumda; 20 g/L’ lik melas çözeltisi hazırlayabilmek için 9.2 mL melas alınıp distile suyla 50 mL’ ye tamamlanmı tır. Aynı ekilde, 40 g/L’ lik çözelti için 18.4 mL melas, 60 g/L’ lik çözelti için 27.6 mL, 80 g/L’ lik çözelti için 36.8 mL melas alınarak 50 mL’ ye tamamlanmı tır.

Daha sonra 250 mL’ lik erlenlere bu çözeltilerden 1/5 oranını sa layabilmek için 45 mL melas çözeltisi, 5 mL A.xylinum kültürü koyularak 10 gün süreyle fermantasyon gerçekle tirilmi tir. Fermantasyon sonunda elde edilen selüloz safla tırılarak, tartım alınmı tır.

(41)

4. SONUÇLAR VE TARTI MA

4.1 Fermantasyon Süresinin Belirlenmesi

Deneysel çalı manın ilk bölümünde HS besi yeri kullanılarak statik ko ullarda 30 0C’ de çalı ılmı ve optimum fermantasyon süresi hesaplanmı tır. Bunun için 14 gün süreyle fermantasyon gerçekle tirilmi ve 3, 7, 10 ve 14. günlerde numune alınarak, selüloz olu umu, hücre büyümesi ve glikoz tüketimi hesaplanmı tır. Deney süresince bakteriyel selüloz olu umu ekil 4.1’ de verilmektedir.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ZAMAN(GÜN) S E LO Z V E R M (G /L )

ekil 4.1 Bakteriyel Selüloz Veriminin Zamana Göre De i imi

ekil 4.1’ de de görülebilece i gibi selüloz üretimi zamanla artmaktadır. 10. günün sonunda üretilen selüloz miktarı 3,2 g/L iken, 14. günün sonundaki miktar 3,5 g/L’ dir.

Fermantasyon süresince bakteriyel selüloz olu urken, besi yerinde bulunan glikozun tüketim hızı HPLC ile ölçülmü tür. ekil 4.2’de glikoz tüketim e risi görülmektedir.

(42)

0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 0 3 6 9 12 15 ZAMAN (GÜN) K E T LE N G L K O Z M K TA R I (g /L )

ekil 4.2 Besi Yerindeki Glikoz Miktarının Zamana Göre De i imi

ekil 4.2’ den de görülebilece i gibi selüloz miktarı 3. günün sonunda 7,9 g/L iken, 10. günün sonunda ölçülemeyecek kadar azalmı tır.

Ortamdaki canlı hücre miktarı ise, 600 nm’ de spektrofotometre ile ölçülmü tür. Sonuçlar ekil 4.3’ te verilmektedir.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ZAMAN (GÜN) O D (6 00 n m )

ekil 4.3 Bakteriyel Selüloz Üretiminde Zamana Göre Hücre Büyümesi Yapılan çalı malar sırasında, 10. günden itibaren ortamda glikoz konsantrasyonu ve canlı hücre miktarı büyük ölçüde azalmaktadır. Bunun yanında 10. günden itibaren bakteriyel selüloz üretim hızı da dü mektedir. Bu veriler göz önüne alınarak, bakteriyel selüloz üretiminde optimum fermantasyon süresi 10 gün olarak belirlenmi ve di er çalı malarda bu süre göz önüne alınmı tır.

(43)

4.2 Farklı Karbon Kaynaklarının Bakteriyel Selüloz Üretimine Etkisi

Çalı manın bu bölümünde farklı karbon kaynakları kullanılarak selüloz verimi hesaplanmı tır. Kullanılan karbon kaynakları ve elde edilen selüloz miktarları Tablo 4.1’ de verilmektedir. Fermantasyonlar 30 0C’ de, statik ko ullarda, 10 gün süre ile gerçekle tirilmi tir.

Tablo 4.1 Bakteriyel selüloz üretimine karbon kayna ının etkisi Karbon

kayna ı Bakteriyel selüloz verimi (g/L) Glikoz 3,3 Laktoz 0 Mannitol 2,9 Sakkaroz 2 Fruktoz 3,7

Tablo 4.1’ de de verildi i gibi en yüksek verimde selüloz, karbon kayna ı olarak fruktoz kullanıldı ında elde edilebilmektedir, onu glikoz izlemektedir. Sıralamalı sonuçlar ekil 4.4’ te verilmi tir.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

FRUKTOZ GL KOZ MANN TOL SAKKAROZ LAKTOZ KARBON KAYNA I B A K TE R Y E L S E LO Z V E R M (G /L )

(44)

Aynı ko ullarda DSMZ’ den alınan DSM 2004 no’ lu A.xylinum kültürü ile çalı ıldı ında elde edilen bakteriyel selüloz verimi ise, ekil 4.5’ te verilmektedir.

ekil 4.5 DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile seçilen karbon kayna ına göre selüloz verimi

ekil 4.4 ve 4.5 incelendi inde kullanılan mikroorganizmaya göre farklı karbon kaynaklarının daha etkin bir ekilde kullanılabilece i görülmektedir. A.xylinum 2325 ile en yüksek verim, karbon kayna ı fruktoz oldu unda elde edilirken, A.xylinum 2004 kullanıldı ında en yüksek verim, karbon kayna ı sakkaroz oldu unda elde edilebilmektedir.

4.3 Farklı Ba langıç Konsantrasyonlarına Sahip Melas Çözeltilerinin Bakteriyel Selüloz Verimine Etkisi

Çalı ma süresince 4 farklı melas konsantrasyonunda çalı ılarak, 10 gün süreyle statik ko ullarda, 30 0C’ de fermantasyon gerçekle tirilmi tir. Çalı manın sonunda elde

edilen selüloz miktarları ekil 4.6’ da verilmektedir.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Glikoz Sukroz Fruktoz Mannitol Laktoz

KARBON KAYNA I B ak te ri ye l S el ü lo z V er im i ( g /L )

(45)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 20 40 60 80

MELASTAK EKER KONSANTRASYONU (%)

S E LO Z V E R M (G /L )

ekil 4.6 Melaslı Besi Yerinde Bakteriyel Selüloz Verimi

ekil 4.6’ da da görülebilece i üzere melastaki eker konsantrasyonu arttıkça elde edilen selüloz miktarı azalmaktadır. Melastaki eker konsantrasyonu % 20 iken 0,974 g/L selüloz üretilmi , eker konsantrasyonu %40’ a çıkarıldı ında 0,718 g/L’ ye dü mü , %60’ ta ise, 0,224 g/L selüloz üretilebilmi tir. eker konsantrasyonu %80’ e çıkartıldı ında selüloz olu umu gözlenememi tir. Bunun nedeni, ortamdaki fazla eker konsantrasyonun mikroorganizma üzerinde inhibitör etkisi yapması eklinde açıklanabilir.

ekil 4.7’ de ise, aynı ko ullarda A.xylinum DSM 2004 kullanıldı ında elde edilen bakteriyel selüloz verimi görülmektedir.

ekil 4.7 DSMZ 2004 no’ lu A.xylinum ile melaslı Besi Yerinde Bakteriyel Selüloz Verimi

ekil 4.6 ve 4.7 incelendi inde, farklı A.xylinum türleri ile çalı ıldı ında aynı ko ullarda melaslı besi yerinde, farklı verimler elde edildi i gözlemlenmi tir. 20 g/L eker konsantrasyonu ile çalı ıldı ında DSM 2004 no’ lu A.xylinum ile 1,132 g/L selüloz elde edilirken, DSM 2325 no’ lu A.xylinum kullanıldı ında 0,974 g/L selüloz

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 20 40 60 80 eker konsantrasyonu(g/L) S el u lo z ve ri m i ( g /L )

(46)

elde edilebilmi tir. eker konsantrasyonu 40 ve 60 g/L’ ye çıktı ında, 2004 no’ lu

A.xylinum ile elde edilen selüloz verimi çok büyük de i im göstermezken, 2325 no’

lu A.xylinum ile elde edilen verim hızla dü mektedir. Tüm çalı maların aynı ko ullarda (30 0C, pH 5.0, 10 gün süreyle statik fermantasyon) gerçekle ti i

dü ünülürse aradaki fark, 2004 no’ lu A.xylinum türünün, melası 2325 no’ lu

A.xylinum türüne göre daha iyi kullanabildi i eklinde açıklanabilir. Kullanılan

melasın %100 sakkarozdan olu tu u dü ünüldü ünde, 2004 no’ lu A.xylinum türünün karbon kayna ı olarak sakkarozu, 2325 no’ lu A.xylinum’ a göre daha iyi kullanması beklenmektedir. Bu durum, Bölüm 4.3’ te verilen basit besi yerinde karbon kayna ı seçimi ile ilgili yapılan çalı manın sonuçlarında, sakkaroz kullanıldı ında 2004 no’ lu A.xylinum’ la 3,4 g/L selüloz, 2325 no’ lu A.xylinum’ la ise, 2 g/L selüloz elde edilmesi ile de do rulanmaktadır.

Seçilen mikroorganizma türüne göre, aynı besi yeri ve aynı fermantasyon ko ullarında çalı ılsa bile, elde edilen bakteriyel selüloz verimi farklılık gösterebilmektedir. Bu durumda yüksek verimle bakteriyel selüloz üretebilmek için, fermantasyon ko ullarının iyile tirilmesi ya da yüksek verimde selüloz üretme kabiliyetine sahip mutant A.xylinum türlerinin kullanılması ile ilgili çalı maların yapılması gerekmektedir.

Referanslar

Benzer Belgeler

Yerel mahkemenin bu kararı, Daire çoğunluğu tarafından, “işverenin fesih nedeni olarak gösterdiği gübre hammaddesi amonyağın üretimi yerine ithaline dair aldığı

—Saint Joseph Fransız Lise si- Kurucusu: Frères Des Ecoles Chrétiennes adlı Fransız rahipleri­.. nin bir

sa Valiliğinden azli sebebleri arasın , da: Tiyatro Ue uğraşması, maiyetindeki memurları Bursada kurduğu tiyatroya gitmeye zorlaması, maarifle uğraşacağı yerde

跨領域學院舉辦跨域週,以系列活動引領北醫學子成為未來跨領域人才 臺北醫學大學跨領域學院於 2020 年 9 月 14 至 18 日中午

E x ve p x ifadeleri ise inelastik saçılma bölgesine ait olduklarından (W>1.08 GeV/ ( ) alt enerji değer kesmesi kullanılmıştı. Bunun yanı sıra elektronların

Dolayısıyla karbon fiyatlandırmadan elde edilen gelirlerin bir takım saptırıcı vergilerin azaltılması amacıyla kullanılması, diğer bir ifade ile gelirlerin gelir ve kurumlar

Bu çalışmada farklı miktarlarda NKS, KF ve ÇF içeren karışımlardan oluşan 36 sayıda elektriksel iletken beton üretilmiştir. Elektriksel iletken betonların

2 Prebiyotik olarak kullanılan tatlandırıcıların sakkaroza göre nispi tatlılık derecesi (Sadler ve Stowell, 2012) ... 1 Yumuşak jöle tipi üretimi ve analizinde kullanılan