Bağımsız Dış Denetim ve Bağımsız Dış Denetim Standartları 1 Bağımsız Dış Denetim

Esta etapa foi realizada no Fungal Ecology Lab, Division of Biology, da

Kansas State University – KSU.

2.2.7.4.1 Amplificação por PCR para sequenciamento

Uma alíquota do DNA metagenômico das amostras de solo, extraído através do kit Power Soil DNA, MoBio (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA), foi quantificada por espectrofotometria, utilizando-se um espectrofotômetro NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). A concentração final foi ajustada

para 2,5 ng µL-1_.

A sequência de bases da região ITS de fungos (ITS) foi determinada por sequenciamento massivo paralelo (MPS), usando iniciadores contendo a sequência do iniciador do MPS (MARGULIES et al., 2005), um segmento marcador de 5 pb para identificação das amostras após o sequenciamento, e iniciadores ITS1F ou ITS4 (GARDES; BRUNS, 1993), como descrito por Jumpponen e Jones (2009).

Para permitir sequenciamento simultâneo, os iniciadores foram selecionados, de um total de 96 iniciadores sintetizados, através de um teste com Saccharomyces cerevisiae (ascomicetos). Após a otimização da concentração das 90 amostras de DNA, a região ITS das amostras de DNA foi amplificada por PCR em reações de 50µL cada. Os amplicons produzidos continham sequências de DNA das regiões

ITS 1 e ITS 2 e do gene rRNA 5,8S. Cada amostra foi amplificada em três reações separadas, como replicações técnicas, resultando em uma amplificação

heterogênea de uma mesma amostra ambiental. Cada reação continha: 200 ηM de

cada um dos iniciadores “forward” e “reverse”, 5 ηg de DNA, 200 µM de cada

deoxinucleotideo trifosfato, 2,5 mM MgCl2, 1 unidade de Taq DNA polimerase

(Promega, Madinson, WI, USA) e 5 µL de tampão de PCR. A amplificação foi feita com uma desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, 25 ciclos de desnaturação a 94ºC por um minuto, anelamento a 57ºC por 1 minuto e extensão a 72 ºC por 2 minutos, seguida por um passo final de extensão a 72ºC por 8 minutos. Todas as amplificações foram realizadas em placas de 96 poços em um termociclador Master Cycler (Eppendorf, Hamburg, Germany). A possível amplificação de contaminantes foi determinada utilizando-se um controle negativo de amplificação pela adição de água esterilizada ao invés da solução de DNA na reação. Os controles negativos permaneceram livres de amplificação.

Alíquotas de 20 µL da replicação técnica de cada amostra foram misturadas e purificadas usando-se o sistema magnético de purificação de PCR AmPure SPRI (AgentCourt Bioscience, Berverky, MA, EUA). Este kit foi selecionado porque discrimina fragmentos menores de 100 pb em comprimento e elimina efetivamente dímeros de iniciadores que excedem 40 pb em comprimento. Um passo adicional de purificação foi realizado pela precipitação de impurezas em isopropanol a -20°C (overnight), centrifugação e eluição do sobrenadante em 50 µL de água pura. Os produtos de PCR puros foram novamente quantificados por espectrofotometria, utilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop ND1000. Para o sequenciamento, foram colocados no mesmo tubo 50 ng de cada amostra de DNA. Os produtos de PCR misturados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose com baixo

ponto de fusão (1,5%) e extraídos com o kit AxyPrep™ DNA Gel Extraction (Axygen,

USA). A concentração dos produtos de PCR foi então ajustada para 10 ng µL-1. O

conjunto de produtos de PCR foi sequenciado em 1/4 de uma placa de sequenciamento no sequenciador GS FLX (454 Life Sciences, Branford, CT, USA), no laboratório Integrated Genomics Facility Department of Plant Pathology, Kansas State University, Manhattan, KS, EUA.

2.2.7.4.2 Bioinformática e designação das unidades taxonômicas operacionais (UTOs)

As sequências foram processadas pelo pipeline PyroTagger para o controle de qualidade das mesmas e a determinação das UTOs de fungos (mais de 97% de similaridade) (KUNIN; HUGENHOLTZ, 2010). Os amplicons menores que 360 pb, ou com bases ambíguas, ou sem as sequências de iniciadores ou DNA marcador foram eliminados da análise. Todas as UTOs singletons foram excluídas das análises subsequentes, segundo Tedersoo e colaboradores (2010). Após o

grupamento das sequências, um representante de cada UTO “não singleton” foi

manualmente atribuído aos táxons filo, ordem, família, gênero e espécie, com base na melhor correspondência do BLASTn (ZHANG et al. 2000), após a filtragem dos acessos que foram selecionados como sequências ambientais ou fungos não- cultiváveis. Apenas os 10 melhores hits do BLASTn foram considerados na análise.

2.2.7.4.3 Índices de Diversidade

A riqueza de UTOs (S) foi calculada pela soma do número de UTOs dentro

de cada amostra. O índice de diversidade de Simpson (1-∑pi2) e o índice de

Diversidade de Shannon (H’= -∑pi (loge(pi))) foram calculados para cada amostra.

sendo que pi é a abundância relativa de cada UTO. A Equilabilidade (E) foi

calculada pela razão da diversidade de Shannon com a riqueza de UTOs

(H’/logc(S)). Curvas de acumulação de espécies (rarefação) foram geradas usando

os programas EstimateS (versão 8; COLWELL, 2006) e PRISM (versão 5, GraphPad Software, Inc., MOTULSKY, 2007) para cada área amostrada.

2.2.7.4.4 Frequência de UTOs

Para identificar táxons, foram usados dois tipos de análises. Primeiro, todas as UTOs que ocorreram em mais de 20% das amostras (16 ocorrências entre 86 amostras do experimento inteiro) e que foram representadas por mais de 100 sequências, foram analisadas para o efeito das épocas de coleta usando o

programa estatístico JMP 7.0.1 (SAS Institute). Segundo, um representante de cada UTO (não singleton) recebeu a atribuição dos táxons, como descrito anteriormente, baseando-se nos melhores resultados do BLAST (ZHANG et al., 2000) e informações de linhagem disponível para cada acesso.

2.2.7.4.5 Análises estatísticas

A análise estatística realizada com as três áreas amostradas apresentou números diferentes de sequências em cada área. Para garantir a normalidade dos dados, as três áreas foram analisadas separadamente. As áreas EEA e PEIC não apresentaram normalidade nos dados de diversidade de Simpson (1-D) e Equitabilidade (Evenness - E), respectivamente. Para garantir a normalidade, foram omitidas as amostras que excederam em ±2DP (desvio padrão da média) nos dados relativos a 1-D (EEA) ou de E (PECB). Com isso, duas amostras da EEA, coletadas na época de alta pluviosidade e uma amostra da época de baixa pluviosidade, todas coletadas sob a projeção da copa de Cabralea canjerana, foram omitidas. Adicionalmente, uma amostra coletada sob a projeção da copa de Guapira opposita, do PEIC, foi omitida porque não gerou nenhuma sequência.

As respostas foram analisadas usando a análise de variância ANOVA com

medidas repetidas em um modelo de interação “entre sujeitos”, usando a variável

“épocas” e “espécies de árvores (épocas)” para calcular em conjunto os efeitos das épocas de coleta e espécies de árvores sob as quais as amostras de solo foram coletadas.

Os dados referentes às comunidades de fungos do solo foram analisados com o programa PC-ORD (v.4.1, McCUNE; MEFFORD, 1999) para examinar diferenças na comunidade de fungos de cada área amostrada, em diferentes épocas. Distâncias Pairwise foram estimadas usando o índice de Søresen (Bray Curtis) e analisadas usando-se a análise multivariada de escalonamento multidimensional não-métrico (NMS; MATHER, 1976) para evitar questões decorrentes da não normalidade potencial em cada conjunto de dados. O número ótimo de dimensões (k) foi selecionado baseando-se no teste Monte Carlo de significância em cada nível de dimensionalidade, comparando-se 40 corridas com

dados empíricos contra 50 corridas aleatórias. O número de dimensões ótimas variou entre as diferentes áreas amostradas (k= 2 para PECB e PEIC, k = 3 para EEA) e as análises foram realizadas para estes níveis ótimos. Para determinar diferenças, os escores de NMS foram analisados usando ANOVA, como descrito anteriormente.