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Avaliação in vitro do efeito de diferentes formulações da solução de Carnoy utilizada em cirurgia oral e maxilofacial sobre substratos humanos calcificados. Francisco Samuel Rodrigues Carvalho DDSa*; Victor Pinheiro Feitosa DDS, PhDb; Paulo Goberlânio de Barros Silva DDS, PhDc; Eduardo Costa Studart Soares DDS, PhDd; Fábio Wildson Gurgel Costa DDS, PhDe.
aEstudante de pós-graduação, Divisão de Cirurgia Oral e Maxilo-facial, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil. Professor, Divisão de Morfologia Buco-maxilo-facial e Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial, UNIFOR, Fortaleza, Brasil.
bProfessor adjunto, Divisão de Materiais Dentários, Unicatólica, Quixadá, Ceará, Brasil. cProfessor, Faculdade de Odontologia, Centro Universitário Unichristus, Fortaleza, Ceará, Brasil.
dProfessor titular, Divisão de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial, Hospital Universitário Walter Cantídio, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil.
eProfessor Adjunto, Divisão de Radiologia Oral, Hospital Universitário Walter Cantídio, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Brasil.
Autor de correspondência*: Francisco Samuel Rodrigues Carvalho
Rua Monsenhor Furtado, s/n. Rodolfo Teófilo, Fortaleza, Ceará, Brasil. CEP: 60.430- 350. Telefone: +55(85)996224146
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Conflito de interesse: não declarado; Fundos: nenhum
Palavras-chave: solução de Carnoy. cirurgia oral. espectroscopia Raman. estudo in vitro
Título curto: Efeito da solução de Carnoy sobre substratos humanos calcificados. Declaração de relevância clínica:
As soluções de Carnoy com e sem clorofórmio apresentam potencial de
desmineralização de substratos humanos calcificados, sendo a formulação com clorofórmio a que apresentou maiores danos e penetração superficiais.
RESUMO
Objetivo. Avaliar o efeito de diferentes formulações da solução de Carnoy em substratos humanos calcificados.
Metodologia. Foi realizado um estudo in vitro com 36 dentes e 18 fragmentos ósseos humanos, divididos em dois grupos experimentais (Grupo I = solução de Carnoy com clorofórmio; Grupo II = solução de Carnoy sem clorofórmio) e um grupo controle (solução salina). Os grupos foram subdivididos em: pré-condicionamento, pós- condicionamento e pós-condicionamento com lavagem. Utilizou-se microespectroscopia Raman, teste de microdureza de Knoop e microscopia eletrônica de varredura (MEV) com análise do espectro de energia dispersiva (EDX).
Resultados. Houve desmineralização das estruturas dentárias tanto nas relações matriz mineral/matriz orgânica e carbonato/fosfato (GI e GII; p<0,05), além de degradação do colágeno (GII; p<0,05). No tecido ósseo, a degradação da matriz orgânica foi observada pela redução na relação entre os subtipos de colágeno (GI e GII; p<0,05). A presença do clorofórmio resultou em uma redução estatisticamente significante na microdureza superficial das amostras de tecidos dentários (p=0,036), mas não ultrapassando os 0,010µm. Nos grupos experimentais, o MEV/EDX evidenciou significativas alterações estruturais em todas as amostras analisadas.
Conclusões. A solução de Carnoy alterou, in vitro, a matriz orgânica e inorgânica dos substratos humanos analisados, sendo seu efeito mais pronunciado quando da presença de clorofórmio.
INTRODUÇÃO
Diversas lesões benignas (odontogênicas e não odontogênicas), mas localmente agressivas e com alto percentual de recorrência, podem acometer o complexo bucomaxilofacial.1 O tratamento conservador dessas lesões pode acarretar elevados índices de recidivas; entretanto, uma abordagem radical pode causar severo comprometimento funcional e estético.1,2 Terapias complementares aos tratamentos cirúrgicos, como o emprego da solução de Carnoy ou da criocirurgia, tem sido amplamente utilizadas desde a década de 80, visando melhorar os desfechos clínicos.3
Voorsmit, Stoelinga, van Haelst em 19814, foram os primeiros pesquisadores a utilizarem a solução de Carnoy em lesões do complexo bucomaxilofacial, preconizando sua utilização no tratamento do tumor odontogênico ceratocístico, em virtude dessa lesão demonstrar um importante poder de infiltração e apresentar altas taxas de recorrências.4 Desde então a solução tem sido empregada, também, no tratamento adjuvante de outras patologias como: cisto odontogênico glandular5, fibroma ossificante dos maxilares,6,7 e notadamente em ameloblastomas.8
Com base em estudos prévios1,4,9,10, Voorsmit estabeleceu um protocolo clínico de aplicação da solução de Carnoy durante um período de 5 minutos sobre superfícies ósseas, o qual promovia necrose de aproximadamente 1,5mm de profundidade.11 A solução de Carnoy originalmente utilizada era composta por etanol à 95% (9mL), ácido acético glacial (3mL) e cloreto férrico (1g).9 Posteriormente, sua formulação foi alterada pela presença de 6mL de álcool absoluto, ao invés de etanol, além do acréscimo de clorofórmio.10 A adição do clorofórmio, entretanto, apresenta algumas divergências em relação ao seu uso.9,12 Desde o ano de 2000 a Administração para Alimentos e Drogas
dos Estados Unidos vetou o seu uso em produtos cosméticos devido à sua carcinogenicidade, observada em estudos animais, e risco provável para a saúde humana.13
Existem resultados oriundos tanto de estudos experimentais, os quais reportaram o grau de penetrabilidade dessa solução em tecidos ósseos de animais,4 bem como de estudos clínicos, os quais demonstraram sua aplicabilidade como terapia adjuvante.12 Nesse contexto, por se tratar de um cauterizante químico aplicado em cavidades cirúrgicas por vezes adjacentes a dentes vitais, não se conhece possíveis efeitos in vitro da solução de Carnoy sobre a superfície dentária. Em comparação com outras alternativas terapêuticas, como por exemplo a pesquisa de Pollan et al., (1974)14 que descreveu os efeitos da crioterapia sobre dentes de cães,14 não há pesquisas similares sobre o efeito da solução de Carnoy quando aplicada em superfície dentária, sejam elas estudos in vivo ou mesmo in vitro.
Em comum a esses trabalhos previamente descritos, observa-se uma lacuna acerca de possíveis mecanismos que ajudem a explicar os resultados clínicos advindos do uso da solução de Carnoy, incluindo o papel desempenhado pelos seus componentes químicos notadamente sobre o tecido ósseo humano. Para tanto, necessita-se do uso de metodologias específicas que permitam sua mensuração em termos qualitativos e quantitativos, tal como a microespectroscopia Raman.
Em 1928, o físico indiano Sir Chandrasekhara Venkata Raman observou e interpretou o fenômeno de espalhamento inelástico da luz através da matéria utilizando técnica de microespectroscopia, denominando-o de efeito Raman.15 A espectroscopia Raman constitui-se como uma valiosa técnica analítica capaz de mensurar a composição
química de amostras de complexos biológicos, como bioflúidos, células e tecidos. Além disso, tem sido considerada como uma impressão digital molecular de diferentes substratos, fornecendo informações quantitativas quanto à sua composição química.16 Considera-se que a espectroscopia Raman é uma modalidade não-invasiva, quimicamente seletiva, e que tem sido observada em diversas publicações no campo da cirurgia oral17 e estomatologia/patologia oral.18,19
Portanto, o objetivo do presente trabalho foi analisar e quantificar, em uma perspectiva inovadora no contexto da cirurgia oral e maxilofacial, possíveis alterações físico-químicas sobre diferentes substratos humanos (dentes e tecido ósseo) quando da utilização da solução de Carnoy convencional (com clorofórmio) e a solução modificada (sem clorofórmio), empregando microespectroscopia Raman, teste de microdureza de Knoop, além da microscopia eletrônica de varredura. Até o presente momento, aparentemente, não existem trabalhos publicados que tenham realizado investigação semelhante sobre a solução de Carnoy.
MATERIAIS E MÉTODOS
Tipo de estudo e amostra
Foi realizado um estudo in vitro, com substratos humanos dentários e ósseos, tendo sido submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará (protocolo de aprovação # 1.610.791).
Os substratos humanos consistiam de 36 terceiros molares inferiores e 18 fragmentos de tecido ósseo normal, ambos provenientes do Serviço de Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial do Hospital Universitário Walter Cantídio (Fortaleza, Ceará, Brasil).
Os dentes foram armazenados em solução de fisiológica 0,9%, à temperatura de 4ºC, durante um período máximo de 7 dias. Os espécimes ósseos foram armazenados em solução fisiológica 0,9% e submetidos ao experimento no mesmo dia.
Optou-se pela utilização solução fisiológica 0,9% em virtude da mesma preservar as características do cemento20 e da estrutura óssea.21 Nenhum tratamento de superfície dentária foi realizado, como por exemplo raspagem ou condicionamento com soluções ácidas, objetivando a manter a integridade estrutural do cemento e de possíveis fibras periodontais remanescentes.
Critérios de Inclusão
Para serem incluídos no estudo os dentes deveriam ser hígidos, bem como sua remoção necessitaria ter sido realizada com auxílio de fórceps ou de alavancas, mas sem a manipulação da porção radicular do dente com um destes instrumentos. Além disso, foi adotado na metodologia do presente trabalho que os dentes necessitariam apresentar no mínimo 2/3 da sua raiz completa com o objetivo de garantir uma área maior para análise por meio de microespectroscopia Raman.
Os fragmentos ósseos necessitariam ser oriundos cirurgia ortognática mandibular cujo em seu planejamento deveria haver a necessidade de sua remoção.
Critérios de Exclusão
Foram adotados os seguintes critérios de exclusão: (1) dentes com lesões cariosas, doença periodontal, fraturas radiculares e/ou alterações macroscópicas superficiais; (2) fragmentos ósseos alterados macroscopicamente, apresentando características sugestivas
de tecido patológico, adjacentes ou associados a lesões mandibulares, ou ainda que apresentassem alterações superficiais decorrentes de sua remoção.
Preparo das soluções
As soluções de Carnoy utilizadas no experimento foram formuladas pelo mesmo pesquisador com treinamento farmacêutico de mais de 10 anos, utilizando 6 mL de álcool absoluto, 3 mL de clorofórmio, 1 mL de ácido glacial acético e 1 grama de cloreto férrico hexahidratado (FeCl3.6H2O) de modo a obter aproximadamente 10 mL de solução final conforme especificado na literatura.4,10 Para obtenção da solução de Carnoy sem clorofórmio foi realizada a substituição desse composto químico por 3 ml de álcool absoluto.9,12,22 Após a manipulação e obtenção das soluções, estas foram acondicionadas em frascos de vidro, na cor âmbar e com tampa plástica, e armazenadas em local fresco, arejado, livre de luz, e à temperatura ambiente, somente até a realização do experimento. Todas as soluções foram manipuladas e utilizadas no mesmo dia.
Protocolo experimental
Os dentes (n=36) e os fragmentos ósseos (n=18) enquadrados nos critérios de elegibilidade foram selecionados para a pesquisa, de modo a favorecer a aquisição dos dados em triplicata. Os espécimes foram numerados e aleatoriamente distribuídos (Microsft Excel®; função Randbetween), por um colaborador que desconhecia o protocolo da pesquisa e que não participou de nenhuma etapa laboratorial do presente estudo, em três grupos principais e cada grupo foi dividido, ainda, em dois subgrupos. Os grupos principais foram classificados quanto à utilização de solução de Carnoy com clorofórmio (Grupo I), solução de Carnoy sem clorofórmio (Grupo II) e solução salina (controle; Grupo III). Os subgrupos eram referentes à realização ou não de lavagem com
solução fisiológica de cloreto de sódio a 0,9% (Soro Fisiológico 0,9% - Fresenius Kabi Brasil Ltda – Barueri-SP) após os substratos humanos terem recebido condicionamento com as soluções testadas na presente pesquisa.
Os fragmentos ósseos, foram oriundos de um único paciente, tendo sido previamente seccionados com auxílio de cortadeira metalográfica (Buehler – Modelo ISOMETTM LS; Lake Bluff, Illinois) com disco de diamante sob irrigação com soro fisiológico, sendo seccionados de modo a obter blocos ósseos nas seguintes dimensões: 0,4 cm de largura, 1 cm de comprimento e 0,5 cm de espessura. Posteriormente, esses blocos foram divididos igualmente entre cada grupo (n=6) e subgrupo (n=3) (figura 1).
Os substratos humanos testados foram imergidos em um béquer de vidro em 100 ml da respectiva solução de cada grupo, onde permaneceram por um período de 5 minutos. Em seguida, foram removidos com auxílio de uma pinça plástica. Caso o subgrupo não incluísse lavagem com solução fisiológica, os espécimes eram acondicionados em recipiente plástico individual à temperatura ambiente, ou caso o subgrupo envolvesse a irrigação com solução fisiológica previamente à estocagem, os substratos tiveram suas superfícies irrigadas com solução de soro fisiológico 0,9% durante 5 minutos (figura 1). Tal protocolo de irrigação foi proposto de modo à reproduzir o que é realizado na prática clínica durante o trans-cirúrgico do procedimento.
Após a realização dos condicionamentos, os dentes foram seccionados de modo a obter 3 secções sagitais de cada espécime, sendo cada uma destas destinada a microespectroscopia Raman, ao teste de microdureza de Knoop, e a microscopia eletrônica de varredura (figura 1).
Para o presente estudo, foram realizadas microespectrometria Raman para caracterização estrutural dos espécimes em cada grupo, avaliação da microdureza através do teste de Knoop, bem como microscopia eletrônica de varredura/espectrometria de energia dispersiva para proporcionar uma análise qualitativa dos substratos humanos após condicionamento com as soluções empregadas. Para tanto, um pesquisador previamente calibrado realizou todas as análises e, para prover cegamento no estudo, o mesmo avaliador desconhecia qual o grupo do qual se tratava cada espécime.
Microespectrometria Raman
Inicialmente, todos os substratos humanos foram avaliados por meio de microespectrometria Raman (Xplora, Horiba, Paris, França). Para a padronização do presente estudo, os espécimes dentários foram submetidos à avaliação em três regiões da raiz (ápice radicular, região cervical radicular e ponto médio entre ápice e cervical radicular) (figura 2A), enquanto os espécimes ósseos tiveram suas aquisições realizadas em três pontos distintos (foram selecionados dois pontos situados a 2,0 mm das laterais dos espécimes e um ponto médio localizado entre os outros pontos descritos) (figura 2B). A distribuição espacial dos componentes orgânicos e inorgânicos foram determinadas através das intensidades relativas correspondentes aos picos Raman. Para tanto, foi utilizado laser de argônio com comprimento de onda de 638 nm e potência de 3,2mW (Olympus). Além disso, aumentos de 10 e 100 vezes foram utilizados para permitir o foco nas regiões avaliadas.
O espectro Raman foi obtido na faixa de 400 cm-1 a 4000 cm-1 com 10 segundos de análise e total de 3 acumulações por região. Os picos analisados foram: (1) relação mineral com matriz orgânica, a qual foi determinada pela intensidade do fosfato banda ʋ1
(~958 cm−1) dividido pela combinação das intensidades das bandas de prolina e hidroxiprolina (~854 + ~871 cm−1); (2) relação carbonato para fosfato foi mensurada através da razão entre a intensidade da banda carbonato (~1070 cm−1) com a banda fosfato ʋ1 (~958 cm−1); (3) cross-link de colágeno, o qual foi calculado pela razão da intensidade de dois componentes da sub-banda na região de amida I (~1660/~1683 cm−1).23
Foi adotado para o presente estudo avaliar as relações existentes entre as intensidades das bandas em virtude da variabilidade da aquisição dos dados na microespectrometria Raman. Isso inclui a probabilidade de um photon causar um efeito de dispersão Raman, além de outras causas tais como a orientação do espécime, o volume de material excitado pelo laser, a absorção da luz, a radiação cósmica e a fluorescência. Dessa maneira, tal medida agiria reduzindo a interferência de agentes externos conforme indicado na literatura.23, 24
Dureza de Knoop
Para avaliação da microdureza as secções transversas foram inicialmente lixadas com papéis de carboneto de silício nas granulações 400-, 500- e 600- , e, posteriormente, polidas com disco de feltro embebido com pasta diamantada microparticulada em baixa velocidade, aposicionadas em cuba ultrassônica com solução fisiológica 0,9% durante um intervalo de 180 segundos e avaliadas em aumento de 40x para confirmar o polimento. Tal protocolo foi utilizado devido a avaliação da microdureza necessitar de superfícies dentárias polidas que permitam a visualização das identações.25
Em seguida, as secções polidas dos dentes foram submetidas ao teste de microdureza de Knoop em máquina Shimadzu HMV-2000 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). A microdureza foi mensurada sob uma carga de 10 gramas com tempo de
permanência de 15 segundos, nas profundidades de 0,010 µm, 0,110 µm e 0,210 µm, sendo as leituras realizadas na porção cervical, média e apical do cemento radicular em triplicata (figura 2A).
Microscopia eletrônica de varredura e espectrômetro de energia dispersiva
Após a realização dos demais testes, os espécimes foram metalizados com ouro através de um Metalizador Quorum QT150ES (Quorum Technologies Ltd., Lewes, East Sussex, Reino Unido) para, em seguida, ser realizado teste de microscopia eletrônica de varredura em microscópio PHILLIPS XL30 com espectrômetro de energia dispersiva (EDX) (Koninklijke Philips, Amsterdam, The Netherlands). Tal protocolo objetivou permitir a avaliação de possíveis alterações de superfície e de composição dos espécimes estudados.
Optou-se pela metalização dos fragmentos com ouro por se tratar de um preparo considerado barato e rápido, e que promove um revestimento eficiente mesmo em superfícies muito ásperas com alto rendimento de emissão de elétrons secundários, o que favorece a avaliação em ampliações pequenas e médias conforme sugerido na literatura.21
Análise estatística
Os dados da microespectroscopia Raman foram apresentados como médias e desvios-padrão. A diferença entre os grupos foi realizada utilizando o teste estatístico
one-way analysis of variance (ANOVA) seguido pelo pós-teste de Bonferroni. Os dados do teste de Knoop foram analisados estatisticamente através do teste t de Student. Todas as análises quantitativas foram realizadas através do programa Graph Pad Prism 5.0, os dados foram submetidos a teste de normalidade e foi considerado p<0,05 como estatisticamente significante. Em adição, os dados oriundos da microscopia eletrônica de
varredura foram analisados qualitativamente a partir da observação de alterações estruturais da superfície avaliada ou da proporção dos componentes das amostras.
RESULTADOS
Microespectrometria Raman
Foi realizada análise de bandas e picos isolados em que as maiores alterações foram observadas nas bandas fosfato v1 (~960 cm-1) e carbonato (~1070 cm-1) (figura 3). Tal achado foi evidenciado pela perda do fosfato v1 (~960 cm-1) após o condicionamento com ambas as soluções de Carnoy no substrato dentário (figura 3A e 3B), além da perda do pico após a lavagem com soro fisiológico no substrato ósseo tratado com solução de Carnoy sem clorofórmio (figura 3D).
Após a realização da análise das bandas isoladas, avaliaram-se os valores obtidos através dos parâmetros Raman dos substratos humanos condicionados com solução de Carnoy com clorofórmio e solução de Carnoy modificada (tabelas 1 e 2). Para tanto, foram avaliadas a relação matriz mineral/matriz orgânica, relação carbonato/fosfato, e relação de cross-link de colágeno no cemento dentário (figura 4) e na superfície óssea (figura 5) dos espécimes.
Na superfície radicular dos dentes, foi observada redução no parâmetro relação matriz mineral/matriz orgânica quando se utilizou a solução de Carnoy convencional e a modificada (figura 4A). Considerando esse parâmetro, observou-se diferença estatisticamente significante (p=0,025) entre os subgrupos pré-condicionamento, pós- condicionamento e pós-condicionamento com lavagem que receberam solução de Carnoy sem clorofórmio. Nesse grupo, foi observada diferença estatisticamente significativa entre os subgrupos pós-condicionamento com lavagem versus pré-condicionamento
(p=0,003). No grupo onde empregou-se solução de Carnoy com clorofórmio, observou- se diferença estatisticamente significante entre os subgrupos pós-condicionamento versus
pré-condicionamento (p=0,004), bem como entre os subgrupos pós-condicionamento com lavagem versus pré-condicionamento (p=0,001).
Com relação à proporção carbonato/fosfato do cemento, houve um aumento na relação numérica entre estes compostos nas soluções de Carnoy com e sem clorofórmio (figura 4B). No grupo na qual a solução de Carnoy continha clorofórmio, houve diferença estatisticamente significativa para esse parâmetro avaliado entre os subgrupos pós- condicionamento versus pré-condicionamento (p=0,036), e entre os subgrupos pós- condicionamento com lavagem versus pré-condicionamento (p=0,001). Foi observada diferença estatisticamente significante (p=0,004) entre os três subgrupos nos quais foi utilizada solução de Carnoy sem clorofórmio. Nesse grupo experimental, ainda, foi observada diferença estatisticamente significante entre o subgrupo pós-condicionamento com lavagem versus pré-condicionamento (p=0,001).
O padrão de comportamento do cross-link de colágeno da estrutura dentária apresentou-se diferente entre a solução de Carnoy com e sem clorofórmio, havendo, respectivamente, redução e aumento, conforme observado na figura 4C. Foi observada para esse parâmetro diferença estatisticamente significante entre os subgrupos pré- condicionamento, pós-condicionamento e pós-condicionamento com lavagem (p=0,003).
Na avaliação do comportamento do cross-link de colágeno referente ao tecido ósseo do grupo onde foi utilizada solução de Carnoy com clorofórmio, foi observada diferença estatisticamente significativa entre os subgrupos pós-condicionamento versus
com lavagem versus pré-condicionamento (p=0,01) (figura 5C). No grupo onde a solução não continha clorofórmio houve diferença estatisticamente significante entre os subgrupos pós-condicionamento versus pré-condicionamento (p=0,027), e entre os subgrupos pós-condicionamento com lavagem versus pré-condicionamento (p=0,026) (figura 5C).
Dureza Knoop
Os efeitos da penetrabilidade das soluções foi verificada através da avaliação da microdureza do cemento por meio do teste de identação de Knoop (figura 2A). Foi observada diminuição na microdureza quando na avaliação mais superficial (0,010 µm) nos grupos onde se utilizou a solução de Carnoy com (pré: 38,48±4,411; pós: 24,06±1,413) e sem clorofórmio (pré: 38,48±4,411; pós: 32,96±2,733) em comparação a solução controle (pré: 34,08±5,994; pós: 40,25±9,369) (tabela 3). Essa diferença foi estatisticamente significante (p = 0,036) no grupo onde a solução de Carnoy apresentava