ARAŞTIRMANIN YÖNTEMİ VE VERİ TOPLAMA TEKNİKLERİ

Escrito segundo normas da revista:

Semina Caracterização físico-química e funcional das proteínas de amêndoas do

pinhão manso (Jatropha curcas L.)

Heloisa Maria Almeida do Nascimento1*_{; Vicente Queiroga Neto}2_. Resumo

O pinhão manso (Jatropha curcas L.), oleaginosa da família Euphorbiaceae, constitui fonte de proteínas, pouco explorado nesse sentido, pois a presença de fatores antinutricionais e tóxicos tornam a cultura pouco atraente para essa finalidade. O objetivo desse trabalho foi caracterizar a fração proteica da amêndoa do pinhão manso sobre os aspectos nutricionais, funcionais e propriedades físico- químicas, possibilitando dessa forma estabelecer seu potencial de utilização como ingrediente funcional de produtos alimentícios manufaturados. A amêndoa apresentou elevado conteúdo de lipídio (41,98%) e proteína (24,06%) e após desengordurada, apresentou 1,02% e 51,66%, respectivamente. Para obtenção dos isolados proteicos, as amêndoas desengorduradas foram submetidas à extração proteica em pH 7,2 e 10,0 e precipitação isoelétrica em pH 4,0, 4,5, 5,0 e 5,5, sendo observado rendimento mais pronunciado no pH 10,0, com precipitação em pH 4,0. Nesses mesmos índices de pH obteve-se dois isolados proteicos (IP10,0 e IP7,2), os quais foram submetidos a análises das propriedades funcionais, como solubilidade, capacidade de absorção de água e de óleo e capacidade de emulsificação. Os isolados apresentaram solubilidades superiores em pH 10, e mínimas em torno do ponto isoelétrico. Os dois isolados exibiram elevadas capacidades de absorção de água e de óleo, e boa capacidade de emulsificação para aplicação em produtos de panificação, cárneos e molhos. O perfil aminoacídico dos isolados mostra a deficiência de aminoácidos sulfurados, como a metionina e cistina. As propriedades térmicas dos isolados proteicos e frações foram estudadas por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), e observou-se que o IP10,0 apresentou melhor estabilidade térmica, assim como as globulinas, em relação as albuminas. Os resultados do presente estudo indicam que os isolados proteicos obtidos de amêndoas do pinhão manso não podem ser inseridos na composição de alimentos devido presença dos ésteres de forbol. Portanto, novos experimentos devem envolver processamentos que visem à retirada dos fatores antinutricionais.

Palavras-chave: Proteínas; Jatropha; extração; funcionalidade; isolado.

1_{Nutricionista, Mestranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal da Paraíba,}

UFPB, João Pessoa, PB. E-mail:[email protected]

2_{Prof. Dr., Unidade Acadêmica de Ciências Biológicas, Centro de Saúde e Tecnologia Rural,}

Universidade Federal de Campina Grande, Campus Patos, UFCG, Campina Grande, PB. E-mail: [email protected]

Abstract

Jatropha (Jatropha curcas L.), oleaginous plant from Euphorbiaceae Family, is a source of protein, little explored in this way, because the presence of antinutritional and toxic factors make the culture unattractive for this purpose. The aim of this study was to characterize the protein fraction of the jatropha almond on the nutritional aspects, functional and physicochemical properties, thus enabling to establish their potential use as functional ingredients in food manufactured products. Almond showed high lipid content (41.98%) and protein (24.06%) and after defatted, presented 1.02% and 51.66% respectively. To obtain the isolated protein, almonds defatted protein were extracted at pH 7.2 and 10.0 and isoelectric precipitation at pH 4.0, 4.5, 5.0 and 5.5, being observed more pronounced yield at pH 10.0, with precipitation at pH 4.0. In these same pH index were obtained two isolated protein (IP10.0 e IP7.2), which were subjected to analysis of functional properties, such as solubility, absorption capacity for water and oil and emulsifying capacity. The isolates showed higher solubilities at pH 10, and minimum around the isoelectric point. The two isolates exhibited high absorption capacities of water and oil, and good emulsifying capacity for application in bakery products, and meat sauces. The thermal properties of the protein isolates and fractions were analyzed by Differential Scanning Calorimetry (DSC), and it was observed that the IP10.0 showed better thermal stability, as well as globulins, albumins compared. The results of this study indicate that the isolated protein obtained from jatropha almonds can not be inserted in the feed composition due to the presence of phorbol esters. Therefore, new experiments must involve processes aimed at removal of antinutritional factors.

Keywords: Proteins; Jatropha; extraction; functionality; isolated.

Introdução

O consumo de vegetais vem aumentando devido ao baixo valor calórico oferecido e por serem importantes fontes de proteínas em abundância e de baixo custo. As proteínas vegetais disponibilizadas pelos cereais e leguminosas, em especial as oleaginosas, são utilizadas em sistemas alimentícios como ingredientes nutricional e funcional a fim de melhorar a estabilidade e textura (EL NASRI; EL TINAY, 2007), tornando-as mais aceitáveis pelos consumidores.

Do ponto de vista nutricional, as proteínas são fontes de aminoácidos essenciais, necessários ao crescimento e à manutenção dos organismos vivos. A utilização das proteínas vegetais na dieta humana já é uma prática, seja de forma direta ou como fonte para obtenção de concentrados e isolados proteicos (SOUZA et. al., 2009) utilizados como ingredientes funcionais em produtos industrializados. A presença de fatores antinutricionais limita essa utilização, pois depreciam acentuadamente as características biológicas do vegetal, porém, são eliminados quando submetidos a processamento adequado, daí a necessidade de conhecimento do seu potencial nutricional.

A escolha da proteína depende de suas propriedades funcionais desempenhadas durante a formulação do alimento, tais como: capacidade de absorção de água e óleo, solubilidade e capacidade de emulsificação (MOURE et. al., 2006; KUMAR; MAKKAR; BECKER, 2010). As formas de isolamento proteico são alternativas encontradas para agregação de valor a matérias-primas resultantes da extração lipídica. Com isso os isolados e concentrados proteicos merecem ser mais explorados a fim de obter informações a respeito de seu comportamento no desenvolvimento de produtos.

O pinhão manso (Jatropha curcas L.) é uma oleaginosa considerada opção agrícola para região nordeste (ARRUDA et. al., 2004). Segundo Martínez-Herrera et. al. (2006) o conteúdo lipídico encontrado nas sementes está em torno de 53,9% a 58,5%. O óleo resultante da extração nas sementes é considerado uma fonte de energia de baixo custo para produção de biodiesel, quando procede de plantações em larga escala (ANNARAO et. al., 2008; QIAN; SHI; YUN, 2010; KARTIKA et. al., 2012). Com a extração da fração lipídica, as amêndoas resultantes, com elevado teor proteico, são descartas devido a carência de informações de suas características nutricionais e funcionais (ABDALLA et. al., 2008).

Mesmo diante do potencial da espécie, o pinhão manso é uma planta ainda não domesticada e pouco conhecida cientificamente sob diversos aspectos (FERRARI et. al., 2009). Na tentativa de contribuir para preservação e agregando valor comercial às espécies vegetais nativas da região do Semi-Árido, a presente pesquisa tem como objetivos promover a extração dos isolados proteicos utilizando o princípio da precipitação isoelétrica; caracterizar algumas propriedades funcionais como a solubilidade, capacidade de absorção de água e óleo e propriedades emulsificantes; classificar as frações proteicas, bem como investigar as propriedades térmicas e o conteúdo de ésteres de forbol presente nas amêndoas do pinhão manso.

Material e Métodos

Obtenção das farinhas de amêndoas do pinhão manso

Os experimentos foram desenvolvidos no laboratório de Análises de Alimentos localizado na

Universidade Federal de Campina Grande - Campus Patos/PB. Foram utilizadas amêndoas de pinhão

manso, extraídas de sementes coletadas na fazenda Tamanduá, situada no município de Santa Terezinha localizado no estado da Paraíba.

As amêndoas foram trituradas em processador doméstico até obtenção da farinha integral (FI), a qual foi desengordurada em aparelho de Soxhlet com n-hexano até quase completa isenção dos mesmos dos lipidios. A farinha desengordurada (FD) foi espalhada em uma bandeja plástica por 24 horas para remoção de vestígios do solvente, sendo posteriormente armazenada à 5ºC em sacos de polietileno até posterior utilização.

Composição centesimal

As farinhas integral e desengordurada foram avaliadas quanto à umidade, resíduo mineral fixo (RMF), lipídios e proteínas conforme as metodologias da AOAC (2005): perda por dessecação em estufa a 105 ºC até peso constante; resíduo por incineração em forno mufla a 550 ºC até peso constante; extração direta e contínua com n-hexano em aparelho Soxhlet e processo de digestão Kjeldahl, respectivamente. O conteúdo de carboidratos totais, incluindo fibras, foi calculado por diferença de 100,0 com a soma dos percentuais dos demais componentes da composição centesimal.

Obtenção dos isolados proteicos

Preliminarmente, com a finalidade de verificar o rendimento em proteínas extraídas e precipitadas isoeletricamente, quantidades equivalentes a 2,0 g de farinha desengordurada em 20,0 Ml de água destilada (1:10) foram equilibradas em pH 10,0, usando ácido clorídrico e hidróxido de sódio 1,0 N, e, em 20,0 ml de solução tampão fosfato pH 7,2 (fosfato 50 mM, cloreto de sódio 0,5 M). Tais suspensões foram agitadas por 30 minutos, e os extratos a diferentes pH, resultantes de três extrações subsequentes, foram separados por centrifugações a 3.600 x G em centrífuga refrigerada, reunidos, medidos seus volumes, e alíquotas foram retiradas e destinadas à precipitação isoelétrica em pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5. Após precipitações, as suspensões foram centrifugadas em centrífuga refrigerada (FANEM, mod. 206) a 3.600 x G por 30 min e o conteúdo de proteínas determinado de forma indireta nos extratos.

Os isolados foram obtidos a partir da combinação de métodos descritos por Khalil, Ragab e Hassanien (1985) e McWatters e Holmes (1979). Suspensões compostas de 150,0 g de farinha desengordurada em 1.500 ml de água destilada (1:10) foram equilibradas em pH 10,0 sob agitação, em agitador magnético, por 1 hora. Os extratos obtidos foram centrifugados em centrífuga refrigerada (MLW, mod. K 26 D) a 1.600 x G por 30 min. Posteriormente os extratos resultantes foram decantados e filtrados, e tiveram seus volumes medidos. O processo de extração foi repetido, e ao final, todos os sobrenadantes foram reunidos e o pH ajustado para 4,0. A extração em pH 7,2 procedeu conforme proposto por Koyoro e Powers (1987). Para tal extração o tampão fosfato pH 7,2 (fosfato 50mM, cloreto de sódio 0,5 M) foi adicionado à FD seguindo as mesmas condições de extração, centrifugação e precipitação isoelétrica com adição de HCl (1,0 N) até pH 4,0. As proteínas precipitadas isoeletricamente (PPI) nos pH 4,5 e 4,0 foram liofilizadas, originando IP10 e IP7,2,

respectivamente, e então armazenadas em recipientes de vidro, sob refrigeração a 5 °C.

Fracionamento de proteínas

O sistema de classificação de Osborne foi utilizado para qualificar e quantificar os tipos de proteínas existentes nas amêndoas de pinhão manso. Amostra da FD foi extraída em NaCl (0,5M), na proporção de 1:10 (m/v) durante 4 horas em agitador magnético, à 5 ºC. Esse processo foi repetido e os extratos reunidos foram centrifugados a 9000 g durante 30 min, filtrados em papel de filtro qualitativo e submetidos à diálise por 74 horas a uma temperatura de 5 ºC. O volume sobrenadante resultante da diálise correspondeu a fração albumina, e o precipitado foi ressuspenso em NaCl 0,5M e redializado, representando a fração globulina. Para a obtenção das demais frações o processo inicial anteriormente descrito foi repetido a partir do resíduo resultante da extração da albumina, tendo como mudanças o tempo de agitação que passou a ser de 2 horas e as soluções de extração. O resíduo foi então similarmente extraído com 70% de etanol, HCl 0,1 M e NaOH 0,1 M, para obtenção sequencialmente, de prolamina, glutelina ácida e glutelina básica, respectivamente. Todas as frações foram submetidas ao processo de liofilização e acondicionadas em recipiente de vidro âmbar até

posterior utilização. Os volumes sobrenadantes resultantes de cada extração foram medidos e os teores de proteínas solúveis determinados por Biureto (GORNALL; BORDAWILL; DAVID, 1949).

Estudo Térmico

As propriedades térmicas da albumina (AB), globulina (GO) e isolados proteicos foram determinadas através da Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), segundo a metodologia descrita por Lin-Chan e Ma (2002). Para isso foi utilizado um calorímetro diferencial Shimadzu, no qual amostras equivalentes a 1,0 mg de proteína foram postas em contato com 10 l de água destilada, a uma razão de aquecimento de 10 ºC.min-1 _{até atingir temperatura máxima de 130 ºC.}

Perfil de aminoácidos

O perfil de aminoácidos foi determinado num Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (VARIAN, Waters 2690, Califórnia, USA), equipado com uma coluna de Fase Reversa (C18) (PICO- TAG, 3,9 x 150 mm), conforme White, Hart e Fry (1986). As amostras pesadas foram hidrolisadas em 300µL de HCl em presença de nitrogênio (105 ºC, 24 horas). Os hidrolisados foram tratados com metanol/água/trietilamina (2:2:1) e secou-se. As amostras secas foram derivatizadas com metanol/água/trietilamina/fenilisotiocianato (7:1:1:1) ficaram em repouso por 20 minutos, sendo a seguir secas. Essas amostras foram ressuspesas com 500µL de tampão acetato de sódio (pH 6,4), homogeneizadas e transferidas à coluna de fase reversa C18; utilizando o tampão acetato de sódio e solução de acetonitrila a 60%, como fase móvel. A detecção foi realizada em comprimento de onda de 254 nm, à temperatura de 35°C e fluxo de 1mL.min-1_{. O perfil de aminoácidos nas amostras analisadas}

foi determinado através da comparação dos tempos de retenção e das áreas dos picos obtidos para cada aminoácido na amostra em estudo.

Propriedades funcionais Solubilidade

A solubilidade foi determinada a partir de amostras dos isolados proteicos contendo 1,0 mg de proteína em contato com 20 mL de água destilada, conforme Dench, Rivas e Caygill (1981). O pH foi ajustado a valores de 2,0-10,0 usando solução de 0,1N de NaCl ou HCl. Ajustado o pH as amostras foram agitadas durante 30 min. até obtenção das suspensões que foram centrifugadas a 4.300 x G por 30 min. Os volumes sobrenadantes foram medidos e a as proteínas solúveis determinadas pelo método de Biureto (GORNALL; BORDAWILL; DAVID, 1949).

Capacidade de absorção de água e Capacidade de absorção de óleo

A absorção de água e óleo foi determinada de acordo com os métodos descritos por Quinn e Paton (1979) e Lin, Humbert e Sosulski (1974). Amostras dos isolados proteicos equivalentes a 25 mg de proteínas foram colocadas em tubos graduados de centrifuga e adicionados 2,5 mL de água

destilada ou 2,5 g de óleo. Os tubos foram submetidos à agitação durante 30 minutos, e posteriormente as suspensões em meio aquoso foram centrifugadas a 2.750 x G por 10 min. enquanto as suspensões em solução contendo óleo foram centrifugadas a 1.550 x G durante 25 min. O volume liberado, após centrifugação, foi medido e expresso em mL de água ou óleo por grama de proteína.

Capacidade de emulsificação

A capacidade emulsificante (CE) foi determinada através da combinação de métodos descritos por Weeb, Ivey e Cric (1970), Kato et al. (1985) e Hung e Zayas (1991). O pH das dispersões (1,0 mg/ml de água) foi ajustado para 2,0, 4,0, 6,0 e 8,0, sob agitação contínua durante 30 minutos. Volumes de 50 ml das dispersões foram transferidos ao copo do emulsificador, e em seguida agitadas a 10.000 rpm com óleo de soja introduzido a um fluxo de 19 ml.min-1_{. A inversão da emulsão de}

óleo/água para água/óleo foi caracterizada por uma queda de corrente elétrica, e o tempo gasto para ocorrer foi anotado e utilizado na determinação da quantidade de óleo necessário. A capacidade emulsionante foi expressa em ml de óleo.0,1g-1 _{de proteínas.}

Componente tóxico

A determinação do éster de forbol foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Makkar et al.(1997). As análises foram realizadas em cromatógrafo líquido equipado com detector de arranjos de diodos com coluna Lichrospher 100 RP-18 (125 x 4 mm, 5 m) Merck (ou equivalente). A amostra foi acrescida de 10 mL de metanol, agitados durante 2 minutos e centrifugados a 660 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido a um balão de 25 mL, sendo o processo repetido até completar o volume do balão. Ao final, o conteúdo foi armazenado em recipiente escuro no freezer até injeção na CLAE.

A temperatura da coluna foi mantida à 22ºC com uma vazão da fase móvel de 1,3 mL/min-1_.

Essa fase foi composta por ácido fosfórico 0,175%, acetonitrila filtrada e gaseificada. A curva padrão foi preparada utilizando o forbol-12-miristato 13-acetato como padrão externo.

Análise estatística

Aos parâmetros relacionados à composição centesimal, rendimentos de extração, procedimentos de fracionamentos e extração de proteínas e análise de aminoácidos, foi aplicada a estatística descritiva com observação das médias e desvio padrão de 3 repetições em cada característica observada. Quando das propriedades funcionais dos isolados de pH 7,2 e 10,0, foi utilizada a análise de variância, com 3 repetições. Às fontes de variação significativas da análise de variância, foi aplicado o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Essas análises estatísticas foram executadas usando o programa estatístico SAS 9.1.

Resultados e Discussão

Caracterização da farinha de amêndoas do pinhão manso

A composição centesimal das farinhas integral (FI) e desengordurada (FD) provenientes das amêndoas do pinhão manso está representada na tabela 1. Os conteúdos de lipídios, proteínas e resíduo mineral fixo (RMF), na farinha integral e desengordurada foram de 41,98% e 1,02%, 24,06% e 51,66% e 4,56% e 9,42%, respectivamente.

Dos componentes determinados experimentalmente, as frações lipídica (41,98%) e proteica (24,06%) constituíram os majoritários na farinha integral. O teor de lipídios encontrado (42,12%) na FI foi inferior ao de pinhão manso (46%-64%) (HERRERA; AYALA; MAKKAR, 2010), amendoim (48,68%) (JIANG et. al., 2010), avelã (60,50%) (SUI et al., 2011) e gergelim (50,20%) (LATIF; ANWAR, 2011), o que pode está relacionado ao clima ou variações sazonais. Na FD é possível observar que a composição lipídica foi reduzida a 1,02%, superior (0,6%) ao encontrado por Devappa e Swamylingappa (2008), e inferior (2,5%) ao relatado por Xiao e Zhang (2011). Essa redução da fração lipídica reflete melhoria no perfil proteico da farinha a ser utilizada na obtenção dos isolados proteicos.

Na farinha desengordurada a fração proteica (51,66%) mostrou-se mais expressiva, comparado aos demais componentes, graças à extração lipídica. Em estudos prévios realizados com amêndoas de pinhão manso (60,3%) (DEVAPPA; SWAMYLINGAPPA, 2008), gergelim (59,0%) (ACHOURI; NAIL; BOYE, 2012), soja (54,8%) (NAZARETH; DEAK; JOHNSON, 2009) e faveleira com e sem espinho (57,55% e 63,0%) (CAVALCANTI; BORA, 2010) as quantidades de proteínas também foram mais expressivas, porém os valores encontrados foram superiores. Em relação às amêndoas de macadâmia (36,45%) (JITNGARMKUSOL; HONGSUWAN; TANANUWONG, 2008) e canola (36,13%) (KHATTAB; ARNTFIELD, 2009), o pinhão manso apresentou maior valor podendo ser resultado do tempo gasto e solvente utilizado na extração lipídica. O elevado teor de proteínas nas amêndoas gera interesse para sua inserção na alimentação animal e humana, no entanto, fatores interferentes como toxinas e antinutricionais acabam limitando essa prática.

Os teores de RMF na farinha integral e desengordurada foram inferiores ao resultado observado por Martínez-Herrera (2006), de 5,1% e 11,8%, e a farinha desengordurada de girassol que foi de 8,0%, conforme relatado por Salgado et al. (2012). Fatores como tipo da espécie, estágio de maturação e os relacionados à zona geográfica (solo, clima, etc.), promovem diferenças nos valores dos componentes da composição centesimal.

Rendimento de extração proteica

O índice de rendimento de proteínas extraídas (IRPE, %) na farinha desengordurada em níveis de pH 7,2 e 10,0 e nas demais condições estabelecidas está expresso na figura 2.

O extrato de pH 10,0 apresentou maior índice de rendimento, de 87,72%, seguido pelo extrato em pH 7,2 (72,03%). O índice em pH 10,0 apresentou-se superior ao observado por Achouri, Nail e Boye (2012) em proteínas de gergelim (20,0%), canola (50,0%) (GHODSVALI et. al., 2005) e amendoim (62,0%) (JIANG et. al., 2010). A extratibilidade e consequentemente o rendimento de extração das proteínas é função da natureza da amostra e das condições de extração (pH, força iônica, etc.). O pH é capaz de interferir na extração, pois afeta a natureza e distribuição de cargas elétricas sobre as proteínas, tornando-as mais solúveis em níveis de pH elevados (alcalinos) em relação ao ponto isoelétrico (BORA; RIBEIRO, 2004). O excesso de cargas elétricas de mesmo sinal promove repulsões inter e intramolecular, expondo mais grupos ionizáveis para interagir com a água e, por conseguinte aumentar a extratibilidade. É importante destacar que a adição de base à solução de extração contribui para o acúmulo de carga negativa na superfície da proteína. Isso favorece as interações eletrostáticas proteína-água com redução das interações hidrofóbicas entre as moléculas. À medida que as moléculas de proteínas se tornam mais polares, um maior número de moléculas de água ficam dispostas na superfície das proteínas tornando-as solúveis em água (GEHRING et. al., 2011).

Em pH 7,2 (72,03%) o rendimento de extração foi menos pronunciado quando comparado ao pH 10,0. Na extração de proteínas de gergelim a adição de cloreto de sódio provocou mudanças que sugerem desdobramento, dissociação e rearranjo das moléculas de proteínas (ACHOURI; NAIL; BOYE, 2012). Situações de baixos rendimentos de extração proteica indicam pouca degradação da parede celular pelo ácido, impedindo a difusão da proteína para o meio (SARI; BRUINS; SANDERS, 2013).

Fracionamento de proteínas

A proporção relativa das frações proteicas de amêndoas de pinhão manso, separadas de acordo com a solubilidade em diferentes sistemas de solventes, está representada na tabela 3. Da quantidade total de proteínas na farinha desengordurada (PFD), globulinas (58,6%) e albuminas (14,77%), representaram as frações em quantidades majoritárias. As demais frações representaram 15,07% do total de proteínas, sendo 4,27% de prolaminas e 10,8% de glutelinas ácidas e básicas.

As globulinas são consideradas proteínas de armazenamento das sementes (TAI et. al., 2001), e assim como em outras oleaginosas, as amêndoas de pinhão manso são abundantes nessa fração proteica, cujo comportamento de associação/dissociação depende da força iônica e variações no pH do meio (ACHOUR; NAIL; BOYE, 2012). Comparativamente com outras espécies de oleaginosas, a amêndoa em estudo apresentou em relação às sementes de faveleira com e sem espinho índices inferiores das frações albuminas (16,46% e 16,05%), globulinas (63,37 e 63,91%), e glutelinas (11,67% e 11,34%) e superiores de prolaminas (1,23% e 1,27%) (CAVALCANTI; BORA, 2010), enquanto para espécies de canola, Tan et al. (2011) encontraram teores inferiores de albumina (39,88- 45,06%) e superiores de globulina (45,25-47,81%). Malumba et al. (2008) em estudos com o milho relataram quantidades superiores de prolamina (33,5%), por ser a proteína de armazenamento do

milho, e inferiores de albumina (4,1%) e globulina (4,2%) tendo a albumina como a fração que facilmente desnatura frente aplicação de calor. Na farinha de soja, Liu et al. (2007) observaram inferior rendimento de extração das globulinas (19,6%), possivelmente pela utilização da água, já que