ARAŞTIRMANIN UYGULAMASI VE VERİLERİN TOPLANMAS

Çalışmamızın planlamasında geçmişte yapılmış benzer çalışma sonuçları kullanılarak yapılan güç analizinde her grup için 6 hayvan kullanıldığı koşullarda çalışmanın gücü %100 olarak hesaplanmıştır.

Buna göre hayvanlar rastgele 4 gruba ayrıldı ve her grupta 6 denek olacak şekilde deney ve kontrol grupları oluşturuldu.

Tüm gruplardaki denekler, deney protokolü teker teker uygulandığı için, sırayla kafesinden alınarak, tartıldı (Şekil 3). Vücut ağırlığına göre, bulunduğu grubun deney protokolüne uygun olarak, 30ml/kg hacimde %0,9 sodyum klorür (NaCl) solüsyonu veya %20'lik EtOH (Sigma-Aldrich®) solüsyonu intraperitoneal yoldan enjekte edildi (Şekil 4). Sonrasında 30 dakika beklenerek 9mg/kg Xylazine (Rompun®, BayerDVM), 90mg/kg Ketamin HCl (Ketalar®, Pfizer) kombinasyonu intramuskuler uygulanarak anestezi yapıldı (Tablo 4).

Tablo 4. Deneylerde kullanılan kimyasal/biyolojik maddeler ve farmakolojik ajanlar

Ajan Doz Veriliş Yolu Hacim Veriliş Sıklığı Etki Süresi

Xylazine 9 mg/kg im. Tek doz > 30 dakika

Ketamin HCl 90 mg/kg im. Tek doz > 30 dakika

Etil Akol %20'lik solüsyon ip. 30 ml/kg Tek doz

% 0,9 NaCl solüsyonu ip. 30 ml/kg Tek doz

NaCl: Sodyum klorür, HCl: Hidro klorür, im.: intramusküler, ip.: intraperitoneal, mg/kg: miligram / kilogram ml/kg: mililitre / kilogram.

Şekil 3. Deneklerin tartımı Şekil 4. İntraperitoneal enjeksiyon

29

1. Kontrol grubu (Grup K): Hayvanlar ayrı ayrı tartıldıktan sonra intraperitoneal yoldan 30 ml/kg hacimde %0,9 sodyum klorür (NaCl) solüsyonu enjekte edildi. Verilecek total sıvı miktarı EtOH verilmesi planlanan gruba uygulanacak EtOH solüsyonu hacmine denk olması için hesaplanarak belirlendi. Enjeksiyonu takiben 30 dakika sonra hayvanlara genel anestezi uygulandı. Genel anestezi uygulandıktan 20 dakika sonra biyokimyasal tetkikler için yeterli miktarda kan alındı, hayvanlardan kan alınarak ötenazi uygulandı ve HIF1-α doku düzeyi çalışmak amacıyla beyin dokusu alındı.

2. Alkol grubu (Grup A): Hayvanlar ayrı ayrı tartıldıktan sonra intraperitoneal yoldan %20'lik EtOH (Sigma-Aldrich®) solüsyonu kullanılarak 6 gr/kg EtOH verilecek şekilde enjekte edildi. Enjeksiyonu takiben, EtOH kan düzeyinin en yüksek seviyeye ulaştığı kabul edilen 30 dakika süre sonrası hayvanlara genel anestezi uygulandı. Genel anestezi uygulandıktan 20 dakika sonra biyokimyasal tetkikler için yeterli miktarda kan alındı, hayvanlardan kan alınarak ötenazi uygulandı ve HIF1-α doku düzeyi çalışmak amacıyla beyin dokusu alındı.

3. Şok grubu (Grup S): Hayvanlar ayrı ayrı tartıldıktan sonra intraperitoneal yoldan 30 ml/kg hacimde %0,9 NaCl solüsyonu enjekte edildi. Enjeksiyonu takiben 30 dakika sonra hayvanlara genel anestezi uygulandı. Takiben, uygun teknik ile kuyruk veni heparin ile yıkanmış 24G vasküler kanül ile kateterize edilerek, hesaplanmış total kan hacmininin yaklaşık %40'ı kadar kan alındı. Hipovolemik şok modeli yaratılan denekler, kuyruğun proksimal kısmından non-invaziv olarak monitörize ediledi ve 5, 10, 15 ve 20. dakikalarda kalp atımı ve tansiyonu kaydedildi. Sonrasında biyokimyasal tetkikler için yeterli miktarda kan alındı, hayvanlardan kan alınarak ötenazi uygulandı ve HIF1-α doku düzeyi çalışmak amacıyla beyin dokusu alındı.

4. Alkol ve şok grubu (Grup AS): Hayvanlar ayrı ayrı tartıldıktan sonra intraperitoneal yoldan %20'lik EtOH solüsyonu kullanılarak 6 gr/kg EtOH verilecek şekilde enjekte edildi. Enjeksiyonu takiben, EtOH kan düzeyinin en yüksek seviyeye ulaştığı kabul edilen 30 dakika süre sonrası hayvanlara genel anestezi uygulandı. Takiben, uygun teknik ile kuyruk veni heparin ile yıkanmış 24G vasküler kanül ile kateterize edilerek, hesaplanmış total kan hacmininin yaklaşık %40'ı kadar kan alındı. Hipovolemik şok modeli yaratılan denekler, kuyruğun proksimal kısmından non-invaziv olarak monitörize ediledi ve 5, 10, 15 ve 20. dakikalarda kalp atımı ve tansiyonu kaydedildi. Sonrasında biyokimyasal tetkikler için yeterli miktarda kan alındı, hayvanlardan kan alınarak ötenazi uygulandı ve HIF1-α doku düzeyi çalışmak amacıyla beyin dokusu alındı.

30 Yaşamsal Bulgular

Nabız ve tansiyon değerleri küçük hayvan kuyruğu non-invaziv kan basıncı monitörü (May NIBP250®) kullanılarak hayvanların kuyruklarından non-invaziv olarak ölçüldü (Şekil 5,6). Elde edilen değerler kullanılarak şok indeksi hesaplandı.

Şekil 5. a) Non-invaziv kan basıncı monitörü (May NIBP250®) (soldaki resim) b) Kuyruktan non-invaziv ölçüm amacıyla kullanılan kuyruk manşonu (sağdaki resim)

Şekil 6. Non-invaziv kan basıncı monitörü ile elde edilen bir ölçüm örneği Biyokimyasal Tetkikler

Alınan kan örneklerinde pH, pCO2, baz açığı, HCO3-, K+ düzeyleri Trakya

Üniversitesi Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi içindeki Merkez Laboratuvarı'nda kan gazı tetkik cihazı (Cobas b 211®) ile çalışıldı.

31

Kan ve Dokuda HIF1-α Düzeyinin Belirlenmesi

Kan ve dokuda HIF1-α düzeyi Trakya Üniversitesi Teknoloji Araştırma ve Geliştirme Uygulama ve Araştırma Merkezi'nde ELISA (Bioassay Technology Laboratory® Rat hypoxia-inducible factor 1-α ELISA kit) yöntemi ile çalışıldı.

Deneklerden alınan kan örnekleri 4000 devirde 15 dakika santrifüj edilerek serumu ayrıldı ve ELISA yöntemi ile çalışılana kadar -20oC'de donduruldu. Ayrıca deneklerden alınan

beyin dokusu örnekleri -80oC'de donduruldu. Daha sonra her iki hemisferden geçecek şekilde, yaklaşık 0,25mg ağırlığa sahip doku örnekleri alındı ve hassas terazi ile tartılarak kaydedildi. Doku örnekleri ependorf tüplere alındı ve içlerine 1 mm ve 4,8 mm çapında 1lb beads (Next advance®) ilave edildi. Üzerlerine pH değeri 7,4 olan 500 µl PBS (Phosphate buffered saline, Sigma®) ilave edildikten sonra homojenizatör (Next advance tissulyser®) yardımı ile homojenize edildi. Elde edilen homojenat 3000 devirde 20 dakika santrifüj edilerek süpernatan toplandı. Elde edilen serum ve doku örnekleri Anti-HIF1-α antikoru kaplı 96 kuyucuklu mikroplaklarla çalışıldı ve ELISA protokolü uygulandı (Şekil 7). ELISA plakları 450nm dalga boyunda okunarak absorbans değerleri tespit edildi (Şekil 8).

Şekil 7. Örneklerin ELISA plaklarına Şekil 8. 450nm dalga boyunda yüklenmesi okutulan ELISA plağı