A hidrólise de penicilina diretamente em caldo de cultura exige grandes esforços para a recuperação de 6-APA, visto que as características físico-químicas desta molécula associada à complexidade do caldo dificultam este processo de separação.
Existem poucos relatos na literatura sobre a extração de 6-APA a partir de um meio complexo (DUTTA et al., 2000; OLIVER et al., 1997), visto que a extração de 6-APA deste meio é mais difícil do que a extração de PG, devido à diferença nas propriedades físico- químicas destas moléculas. Por outro lado, inúmeros relatos sobre a separação de 6-APA a partir de uma matriz simples (água) têm sido divulgados (WANG et al., 2007). Estes estudos servem como base para compreender a interação deste composto com diferentes agentes de extração. Entretanto, só são aplicados a processo em que a penicilina é hidrolisada em água, e isso não apresenta grandes vantagens na eliminação no número de etapas de obtenção de 6- APA, nem elimina o uso de solventes orgânicos no processo global, visto que a penicilina deve ser extraída e cristalizada para posterior hidrólise e obtenção de 6-APA. Portanto, um fator chave para viabilizar a produção de 6-APA a partir de caldos de cultivo consiste em desenvolver novos métodos de separação efetivos para simplificar e melhorar o processo.
Para atingir valores máximos de recuperação de 6-APA, em matrizes simples ou complexas, vários pesquisadores têm investigado o uso de diferentes fases líquidas e sólidas, as quais podem interagir com 6-APA através de interações iônicas, não iônicas, hidrofóbicas e complexação (WANG et al., 2007).
Entre os materiais utilizados para separação de 6-APA destacam-se: Amberlite LA-2, trioctilamina, Aliquat-336 (BORA et al., 1997), XAD16, XAD1180, XAD1600 (SKONEZNY et al., 2005), resina aniônica IRA 400 (LUUK et al., 1996) e aminas secundárias com peso molecular entre 325 e 395 (VAN DER DOES et al., 1999). Estes materiais se mostram promissores para atingir bons rendimentos de recuperação de 6-APA.
3.5.1 Extração Líquido-Líquido
Um processo alternativo ao processo industrial utilizado para a extração de 6- APA em meio aquoso foi proposto por Van der Does, (1999). Este processo utiliza uma solução para extração alternativa aos solventes convencionais (acetato de amila, butila), a qual envolve o uso de uma amina secundária de elevado peso molecular e um álcool imiscível em
água, processos similares também foram apresentados anteriormente sob a forma de patente (PFIZER & CO INC, 1966; BEECHAM RES LAB LTD, 1966). Nestes processos a recuperação de 6-APA atinge níveis de 97 %.
Cascaval, (2002), estudou a separação de 6-APA por extração reativa em Amberlit LA-2 e di-(2-etil hexil) ácido fosfórico e comparou estes resultados com a extração física em 1,2-dicloroetano. Este estudo mostrou que Amberlit LA-2 é quase 5 vezes mais eficiente que os demais sistemas utilizados. Esta extração ocorre por meio de uma reação interfacial entre os componentes numa razão equimolar, e o mecanismo de reação é controlado pelo tipo do agente de extração e o pH da fase aquosa.
3.5.2 Extração em Fase Sólida
Vários trabalhos na literatura citam a capacidade de 6-APA formar complexos binários ou ternários. Entre os agentes complexantes do 6-APA estão os íos bivalentes Cu, Co, Ni e Zn e os aminoácidos glicina, valina, alanina, serina e outros (MUKHERJEE, 1991, 1994; SHEHATA et al., 2004; ZHANG et al., 1995). Além da complexação com moléculas iônicas, 6-APA também pode interagir com adsorventes poliméricos neutros (copolímero de estireno ou etilvinil benzeno e divinil benzeno) e até mesmo com superfícies hidrofóbicas (por exemplo, carvão), sob determinadas condições de força iônica, pH e temperatura.
O mecanismo de interação de 6-APA com materias não iônicos foi rigorosamente estudado por Dutta 2000, e demonstrou que a afinidade dos β-lactâmicos por estes materiais depende da estrutura química do adsorvente e de sua estrutura morfológica. Foi demonstrado também que a interação por transferência de carga desempenha um papel importante na adsorção de β-lactâmico em soluções aquosas. Os estudos conduzidos por Dutta mostram que 6-APA em meio aquoso apresenta pouca afinidade por superfícies hidrofóbicas como o carvão ativado, XAD 4 e XAD 7, comparado a outros moléculas contendo o núcleo β-lactâmico.
Este conhecimento da interação da molécula de interesse com a superfície do adsorvente é importante para o desenvolvimento de adsorventes eficientes para a recuperação de 6-APA. Desta maneira, é possível estabelecer condições ótimas de adsorção e dessorção, através de um processo seletivo, ou seja, um processo onde a adsorção não específica por componentes de matrizes complexas como o caldo fermentativo não é favorável (DUTTA et al., 2000).
A interação de 6-APA com superfícies hidrofóbicas pode ser intensificada em função do pH da solução. Por exemplo, no uso de carvão ativado como adsorvente, a eficiência de adsorção de 6-APA aumenta com a redução do pH. Entretanto, observou-se que uma pequena fração de 6-APA adsorve irreversivelmente em carvão ativado a pH 4. A vantagem de utilizar carvão ativado como adsorvente é seu baixo custo e fácil disponibilidade, entretanto a difícil regeneração deste torna seu uso proibitivo em vários casos (DUTTA et al., 1997).
Alguns adsorventes utilizados para a separação de 6-APA em meio aquoso apresentam caráter iônico. Estes adsorventes mostram-se eficientes, mesmo quando 6-APA encontra-se em meio complexo. Por exemplo, Oliver et al., 1997 realizou a hidrólise de PG em caldo fermentativo. Neste caso, foram realizadas etapas de filtração e ultrafiltração antes da hidrólise de PG e a extração de 6-APA foi realizada utilizando a resina de troca iônica Aliquat 336. Este processo é descrito parcialmente na literatura como patente.
Outro exemplo de aplicação de adsorvente de troca iônica é citado por Wielen, 1996, que estudou o equilíbrio de troca entre os íons: penicilina G, 6-APA, AFA e Cl- na resina de troca iônica Amberlit IRA 400. Os experimentos foram realizados em sistema aquoso no modo batelada e a capacidade máxima da resina foi 1,26 mequiv/g da resina úmida.
Do exposto até aqui se pode concluir que o desenvolvimento de um novo método para a produção de 6-APA com menor número de etapas exige o estudo de métodos de separação deste a partir de matrizes complexas.
Dadas as características físico-químicas deste composto, mecanismo de extração via interação iônica mostram-se favoráveis. Portanto, além dos adsorventes comerciais já utilizados em trabalhos anteriores, a investigação no uso de polímeros naturais de caráter iônico ou que sejam facilmente modificados quimicamente parar adquirir esta propriedade pode resultar em processos de recuperação de 6-APA mais eficientes e de baixo custo.
3.5.3 Quitosana como adsorvente
O caráter iônico de 6-APA favorece a interação deste composto com suportes carregados. Quitosana é um material polimérico de baixo custo que apresenta boa capacidade de interação iônica e vem sendo muito usado em inúmeros processos biotecnológicos.
A quitosana é considerada o segundo maior composto orgânico mais abundante do mundo. Este biopolímero é derivado da quitina e sua estrutura química contém repetições de unidades beta (1-4) 2-amino-deoxi-D-glicose (ASSIS et al., 2003; HIRANO et al., 1999; VAZQUEZ-DUHALT et al., 2001).
As cadeias poliméricas da quitosana apresentam alto conteúdo de aminas, que a tornam solúvel em soluções aquosas ligeiramente ácidas, mas insolúvel próximo e acima do seu pKa 6,3. Entretanto, a estabilidade química da quitosana pode ser atingida através de ligações cruzadas com etilenoglicol diglicidil éter (EGDG), glutaraldeído e epicloridrina reduzindo sua solubilidade em meio ácido (CHATTERJEE et al., 2005; GINANI et al., 1999; LI et al., 2005; VIEIRA et al., 2006).
Inúmeras aplicações para quitosana natural ou modificada quimicamente são descritas na literatura. Alguns exemplos são: purificação de medicamentos, cosméticos e alimentos (ARRUDA et al., 1999), adsorção de amoxicilina (ADRIANO et al., 2005), adsorção de proteína (GUMUSDERELIOGLU et al., 2004), veículo para liberação de fármacos (MI et al., 2002), suporte na técnica de “Smart” biocatalisadores (VAZQUEZ- DUHALT et al., 2001), imobilização de inúmeras enzimas (ADRIANO et al., 2005; KRAJEWSKA et al., 2004; RODRIGUES et al., 2008).
Quitosana pode ser utilizada sob diferentes formas: pó, fibras, microesferas, membranas (BEPPU et al., 1999; HE et al., 1999; HIRANO et al., 1999). Seja em seu estado natural ou modificada a quitosana apresenta alta capacidade de adsorção, entretanto ainda é possível aumentar e melhorar esta propriedade pela modificação química de seus grupos amina ou hidroxila tornando-a mais ativa em processos de adsorção. Estas modificações da quitosana podem torna seu uso como adsorvente competitivo com as resinas de troca iônica comerciais, as quais apresentam uma concentração de grupos ativos na superfície de 0,83 a 3,91 mmolg-1 da resina seca (JEON et al., 2003). Portanto, este biopolímero apresenta elevado potencial para aplicação na recuperação de 6-APA a partir de caldos fermentativos.
Além da recuperação do produto de interesse através de um processo simples e de baixo custo, outro fator chave a ser considerado na produção de 6-APA é o biocatalisador. O preparo de biocatalisadores altamente ativos e estáveis depende entre outros fatores do grau de pureza da enzima utilizada. No item a seguir, são apresentadas algumas metodologias para purificação e imobilização de PGA.