A análise dos compostos de interesse presentes em caldo fermentativo foi realizada também em HPLC. O método cromatográfico utilizado para quantificar PG, 6-APA e AFA utilizou um sistema de HPLC da SHIMADZU Com coluna C-18, novaPack, 3,9x 300mm. A fase móvel utilizada era composta de acetonitrila e solução de fosfato de sódio monobásico 5 mM e pH 5,95. Um gradiente de solvente foi utilizado, e a concentração de acetonitrila variou com o tempo de análise da seguinte maneira: 0-2 min (ACN atinge 20 %), 2-5 min (ACN atinge 25 %), 5-7 min (ACN é mantida 25 %) e de 7-10 min (ACN volta a 0 %). Uma vazão de 1 mL/min foi utilizada e a detecção foi feita a 225 nm.
4.2.19 Quantificação de Sacarose
Para quantificar sacarose presente no caldo fermentativo utilizando o método do ácido dinitro salicílico (DNS) foi necessário realizar um pré-tratamento da amostra. Uma alíquota de 1 mL de caldo fermentativo foi submetida à hidrólise ácida para liberação dos açúcares redutores, após neutralizar a amostra contendo açúcar redutor, a mesma foi submetida a análise por DNS (MILLER, 1959).
4.2.20 Cultivo de P. chrysogenum em Shaker
A primeira etapa para o cultivo de Penicillium chrysogenum foi o preparo do meio para germinação. A composição deste meio é apresentada na Tabela 4.1.
O pH do meio de germinação foi ajustado para 7,0 utilizando hidróxido de amônio e em seguida, esse meio foi transferido para erlenmeyer com capacidade para 500 mL e submetido a esterilização em autoclave por 15 minutos. Após esterilização, o meio foi resfriado e adicionou-se a este em câmara asséptica 10 mL de uma solução salina contendo
Penicillium chrysogenum, proveniente da raspagem de esporos presentes em tubo inclinado
contendo o meio de crescimento e manutenção (agar, extrato de malte e peptona), o qual se encontrava armazenado a -5 ºC.
Tabela 4.1: Composição do meio de cultivo para Penicillium chrysogenum.
Componentes Concentração
água de maceração de milho 2,8 % v/v
sulfato de amônio 0,513 % m/v
fosfato de sódio monobásico 0,523 % m/v
hidróxido de cálcio 0,131 % m/v
carbonato de cálcio 0,077 % m/v
anti-espumante (polipropileno) 0,256 % m/v
sacarose 2,5 % m/v
água q.s.p. 100 mL
O inóculo foi mantido sob agitação de 250 rpm em shaker a 25 ºC por 24h. Após esse período, 10 % do inóculo foi transferido para um erlenmeyer contendo 90 mL de meio fresco com composição idêntica àquela descrita para o inóculo (Tabela 3.1). Entretanto, para este meio de produção o precursor (ácido fenilacético) foi adicionado na concentração de 5 g/L. O tempo de cultivo para a produção foi de 120 h.
4.2.21 Cultivo de P. chrysogenum em Biorreator Tipo Tanque
Agitado
Os experimentos em biorreator se iniciaram com o preparo do inóculo como descrito na Tabela 3.1. Após 24 h 100 mL do inóculo foi totalmente transferido para o biorreator contendo aproximadamente 1,6 L de meio de produção. Um esquema do aparato utilizado para realizar o cultivo de P. chrysogenum é apresentado na Figura 4.7.
A temperatura no bioreator foi mantida a 25 ºC e pH 7. A vazão de ar variou de 1 a 4 L/min. O oxigênio dissolvido (OD) foi mantido entre 0 e 20% de saturação. O biorreator da Applikon dependable instruments com capacidade para 2 L foi acoplado ao sistema de aquisição de dados (National Instruments®) e variáveis on-line foram armazenadas a cada 10 segundos (pH, temperatura, oxigênio dissolvido, velocidade de agitação, fração molar de dióxido de carbono no gás efluente).
Figura 4.7: Desenho esquemático do aparato utilizado para o cultivo de P. chrysogenum. Fonte: Nucci et AL., 2009.
Soluções de hidróxido de amônio (12,5 % m/v) e ácido clorídrico (1M) estavam conectadas ao bioreator, e a adição automática era realizada utilizando bombas peristálticas para manter o pH 7, visto que este valor de pH é o mais indicado para o crescimento do fungo. Além disso, uma solução de sacarose com concentração de 100 g/L foi conectada para alimentação de fonte de carbono durante o cultivo.
4.2.22 Cultivo de P. chrysogenum em Air lift
O cultivo de P. chrysogenum em biorreator pneumátido do tipo “airlift” (Figura 4.8) com capacidade para 6L foi realizado de maneira similar ao descrito no item anterior, variando-se somente a vazão de ar, a qual foi mantida em 18 L/min.
Figura 4.8: Esquema do principio de funcionamento de reator “air lift”. Adaptada de www.rcub.bg.ac.yu.
4.2.23 Hidrólise de PG em Biorreator
A concentração de PG produzida pela cepa de Penicillium chrysogenum utilizada neste trabalho mostrou-se muito baixa, não sendo possível a detecção da mesma pelo método de análise utilizado. Fez-se necessário a adição de PG ao biorreator para simular as condições do cultivo na indústria, ou seja, durante o cultivo do fungo, PG foi adicionada gradativamente até atingir ao final do cultivo a concentração obtida em escala industrial (~30 g/L). Portanto, a cada 12h, adicionaram-se 6g de PG ao biorreator, além disso, pulsos de sacarose eram aplicados para manter a viabilidade da cepa. Amostras foram retiradas a cada 12h, antes e após a adição de PG, para a determinação da concentração de 6-APA após hidrólise.
A adição do biocatalisador ao biorreator foi realizada após 24h do início do cultivo, visto que, neste intervalo de tempo, o fungo está em fase de adaptação e crescimento e ainda não se observa a produção de penicilina, portanto não é necessária a presença do biocatalisador. Além disso, ao minimizar o tempo de exposição do biocatalisador a este meio, reduzem-se os riscos de perda da atividade do catalisador e inibição do crescimento do fungo devido a contaminações.
O biocatalisador esterilizado foi transferido para um Erlenmeyer contendo o meio de produção e foi mantido 24 h sob agitação de 250 rpm em shaker para verificar a existência de contaminantes. Ao fim de 24 h um teste em placa foi realizado para comprovar a esterilidade do biocatalisador. Em seguida, o biocatalisador foi transferido de maneira asséptica para o biorreator. A hidrólise de PG foi monitorada como descrito anteriormente.