Bir besin maddesi olarak ıspanak (Spinacia oleracea L.), yoğun tüketimi olması ve ağır metalleri alıp tutabilme kapasitesi nedeniyle bu araĢtırmada deneme bitkisi olarak seçilmiĢtir. Proje çalıĢmasının amacı, Kosova'nın farklı yerlerinde bulunan ıspanak bitkisindeki bazı ağır metalleri belirlemek ve farklı parametrelerin çeĢitli konsantrasyonlarını tespit etmektir. Söz konusu bu parametreler ise;
Fizyolojik ve biyokimyasal parametreler
Ispanaktaki bazı ağır metaller Ģeklinde sıralanabilir.
AraĢtırma iki fazlı yürütülmüĢtür; ilki deneme lokasyonlarının hazırlandığı ve belirlendiği analitik faz, ikincisi ise:
Bitkide farklı özellik ve parametrelerin araĢtırılması
Örnek toplama, hazırlık ve laboratuvar çalıĢması
YetiĢtirilen sebzelerin zamanında toplanması/hasadı
Elde edilen sonuçların ulusal ve uluslararası konferanslar yoluyla bilimsel çevrelerde ve ayrıca üretici ve diyetisyenler arasında da yayılmasını sağlamak
Kosovalı araĢtırma personelinin (proje ortağı) Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi' nde eğitimi.
14
PriĢtine Üniversitesi' nden Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi'ne ziyaretleri kapsamaktadır.
Bu ziyaretler araĢtırma deneme planı, tarımda uygulanabilecek modern metodlar ve teknikleri kapsamaktadır.
Ağır metaller, 5 g cm-3’ den daha yüksek yoğunluğa sahip iyonlardır. Demir, bakır, çinko, kobalt ve nikel bitkilerde yer alan birçok proteinin yapısına katılarak büyüme ve geliĢme sırasında önemli iĢlevlere sahip olan mikro elementlerdir. Bu elementlerin aĢırı konsantrasyonu bitkilerde hayati derecede önemli zarara neden olmaktadır. Yüksek toksik etkiye sahip kadmiyum, kurĢun, civa ve diğer metaller ise bitkiler için gerekli olmayan iyonlardır.
3.3. Deneme
AraĢtırmada her bir lokasyonda iki ıspanak (Spinacia oleracea L.) genotipi (Matador ve Clipper) kullanılmıĢtır. Parsel büyüklüğü 1 x 2: 2 m2 olarak planlanmıĢtır.
Her lokasyon üç tekerrürlü ve iki genotip olmak üzere 6 parselden oluĢmaktadır. Her bir lokasyonda deneme alanı 6 x 2: 12 m2 ve projenin tamamında ve üç farklı lokasyonda 12 x 3: 36 m2 deneme alanı mevcuttur. AĢağıda ġekil 3.1’de deneme planı verilmiĢtir.
Bitkilere ekimle birlikte 6 kg/da N, 6 kg/da P2O5 ve 6 Kg/da K2O 15. 15.15 ve üre gübrelerinden uygulanmıĢtır. Daha sonra 3-4 yaprak döneminde 4 kg/da N üre formunda uygulanmıĢtır. Tarla denemesi Mayıs ayında kurulmuĢtur. Kontrollü koĢullarda yetiĢtirilen sebzeler dört aylık geliĢim döneminden sonra Ağustos ayında hasat edilmiĢtir. Daha sonra parsellerden alınan bitki örnekleri laboratuvara taĢınmıĢ ve gerekli analizlere hazırlandıktan sonra Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi laboratuvarlarına kimyasal, fizyolojik ve biyokimyasal parametreleri kapsayan analizler
15 için gönderilmiĢtir. Ayrıca her üç deneme alanından deneme öncesi gerekli analizlerin yapılması için alınan toprak örnekleri Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi laboratuvarlarına bazı kimyasal ve fiziksel analizler için gönderilmiĢtir.
ġekil 3.1. Deneme planı
3.4. Yöntem
3.4.1. Toprak Reaksiyonu (pH)
16 Denemede kullanılan toprak örneklerinin pH değeri elektrometrik olarak belirlenmiĢtir (Sağlam, 2012).
3.4.2. Tuz
Tarla denemesi toprak örneklerinin tuz içeriği EC-metre ile belirlenmiĢtir (Sağlam, 2012).
3.4.3. Kireç
AraĢtırmada kullanılan toprak örneklerinin kireç içeriği Scheibler kalsimetresi yardımı ile belirlenmiĢtir (Sağlam, 2012).
3.4.4. YarayıĢlı Fosfor
Deneme topraklarının bitkilere yarayıĢlı fosfor içerikleri Olsen yöntemi ile ekstrakte edildikten sonra Sağlam (2012), ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry) cihazında okunarak belirlenmiĢtir.
3.4.5. Organik Madde
Toprak örneklerinin organik madde miktarları Smith Weldon yöntemi ile tayin edilmiĢtir (Sağlam, 2012).
17 3.4.6. DeğiĢebilir Potasyum
Denemede kullanılan toprak örneklerinin değiĢebilir potasyum miktarları amonyum asetatla ekstrakte edildikten sonra (Sağlam, 2012) ICP-OES ile belirlenmiĢtir.
3.4.7. DeğiĢebilir Kalsiyum ve Magnezyum
Toprak örneklerinin değiĢebilir Ca ve Mg içerikleri amonyum asetatla ekstrakte edildikten sonra EDTA ile titre edilerek belirlenmiĢtir (Sağlam, 2012).
3.4.8. Bitkilere YarayıĢlı Bazı Mikro Elementler (Fe, Cu, Zn, Mn)
Toprak örnekleri yarayıĢlı bazı mikro elementlerin analizi için 0.005 M DTPA+
0.01 M CaCl2 + 0,1 M TEA (pH 7.3) ile ekstrakte edilmiĢtir Elde edilen ekstrakttaki yarayıĢlı Fe, Cu, Zn, ve Mn miktarları ICP-OES’ de belirlenmiĢtir (Lindsay ve Norvell, 1978).
3.4.9. Tekstür
Denemede kullanılan toprak örneklerinin tekstür analizi Bouyoucos hidrometre yöntemine göre yapılmıĢtır (Tuncay, 1994).
18 3.4.10. Toprakta Ekstrakte Edilebilir Bazı Ağır Metaller (Cd, Cr, Co, Ni, Pb)
Toprak örneklerinin ekstrakte edilebilir Cd, Cr, Co, Ni ve Pb içerikleri DTPA ekstraksiyon yöntemi ile ekstrakte edilmiĢ (Lindsay ve Norvell 1978) ve ICP-OES cihazı ile belirlenmiĢtir (Kacar, 2016).
3.4.11. Bitki Örneklerinin Bazı Besin Elementi (N, P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn) ve Bazı Ağır Metal (Cd, Cr, Co, Ni, Pb) Ġçerikleri
Bitki örneklerinin N, P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn, Cr, Cd, Co, Ni ve Pb içerikleri Kacar ve Ġnal (2010)’ a göre belirlenmiĢtir.
3.4.12. Bitki Antioksidan Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi
Bitkilerden alınan yaprak örnekleri enzim analizlerin yapılacağı zamana kadar -18 °C’de saklanmıĢtır. Antioksidan enzim analizlerine baĢlanmadan önce bitki yapraklarının toplam protein içeriği spektrofotometrik olarak belirlenmiĢ (Bradford, 1976), antioksidan enzim aktivitelerinin belirlenmesi sırasında protein içeriği üzerinden hesaplamaya gidilmiĢtir.
Süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi: SOD enzim aktivitesi spektrofotometrik olarak Beauchamp ve Fridovich (1971) ve Giannipolities ve Ries (1977)’ e göre belirlenmiĢtir. Buna göre özütte meydana gelen aktivite, 300 μmol m-2 s-1 25 oC’ de 10 dk süresince gerçekleĢtirilen reaksiyon sonunda meydana gelen renk değiĢiminin
19 560 nm dalga boyunda ölçülmesiyle saptanmıĢtır. Spesifik enzim aktivitesi, enzim ünitesi mg g-1 protein olarak belirlenmiĢtir.
Askorbat peroksidaz (APX, EC 1.11.1.11) aktivitesi: APX enziminin aktivitesi spektrofotometrik olarak Nakano ve Asada (1981)’ nın yöntemi kullanılarak saptanmıĢtır. 1 enzim ünitesi, dakikada okside olan 1 µmol ml-1 askorbat miktarıdır ve spesifik enzim aktivitesi, enzim ünitesi mg g-1 protein olarak belirlenmiĢtir.
Katalaz (CAT; EC 1.11.1.6) Aktivitesinin Belirlenmesi: CAT enziminin aktivitesi, Bergmeyer (1970)’ in yöntemi kullanılarak belirlenmiĢtir. 240 nm’ de 3 dak.
süre ile H2O2 miktarında oluĢan azalma izlenmiĢtir. Analiz sırasında dakikada tüketilen µmol H2O2 miktarı, 1 enzim ünitesi olarak saptanmıĢ ve spesifik enzim aktivitesi, enzim ünitesi mg g-1 protein olarak belirtilmiĢtir.
Peroksidaz (POX; EC 1.11.1.7) Aktivitesinin Belirlenmesi: POX enziminin aktivitesi, Kanner ve Kinsella (1983)’ nın metoduna göre belirlenmiĢtir.
Spektrofotometrik okumalarda kullanılan reaksiyon karıĢımında; 0.05 M sodyum asetat tamponu (pH 6.5), 0.1 M pyrogallol, 0.09 M H2O2 ve süpernatant (üst faz) kullanılmıĢtır. Renk değiĢimi spektrofotometrede 300 nm dalga boyunda 120 sn süresince izlenmiĢ ve spesifik enzim aktivitesi, enzim ünitesi mg g-1 protein olarak belirtilmiĢtir.
Glutatyon redüktaz (GR, EC 1.6.4.2) aktivitesi: GR enziminin aktivitesi spektrofotometrik olarak Foyer ve Halliwell (1976)’ in metoduna göre belirlenmiĢtir.
NADPH varlığında okside GSH miktarındaki azalma 3 dakika süre ile 340 nm’ deki absorbans azalması izlenerek hesaplanmıĢtır. 1 enzim ünitesi, dakikada okside olan GSH (µmol ml-1) miktarıdır. Spesifik enzim aktivitesi, enzim ünitesi mg g-1 protein olarak belirtilmiĢtir.
20 3.4.13. Lipit Peroksidasyonu Miktarının Belirlenmesi
Analiz sırasında farklı bölgelerden toplanan iki ıspanak çeĢidine ait yapraklarında lipit peroksidasyonunun son ürünü olan malondialdehit (MDA) seviyesinin ölçülmesi ile lipit peroksidasyonu derecesi belirlenmiĢtir (Madhava Rao ve Sresty, 2000). MDA deriĢimi, spketrofotmetreik yöntemle belirlenmiĢtir.
Ekstinksiyon katsayısından (€=155 mM-1 cm-1) yararlanılarak (nmol g yaĢ ağırlık -1) hesaplanmıĢtır.
3.4.14. Bitki Örneklerinin Pigment Ġçerikleri
Pigment içeriğinin belirlenmesi için Arnon (1949) yöntemi kullanılmıĢtır. Bunun için bitki yapraklarından alınan 0.5 g’lık materyal, % 80’ lik aseton içerisinde homojenize edilmiĢ ve özütten alınan spektrofotometrik okumalar aracılığıyla yönteme uygun olarak hesaplamalar yapılmıĢtır. Bitkilerin klorofil a, klorofil b, toplam klorofil ve karotenoid miktarı (mg g-1 yaĢ ağırlık) yönteme göre hesaplanmıĢtır.
3.4.15. Bitki Örneklerinin Toplam Gutatyon ve Toplam Askorbat Seviyesinin Belirlenmesi
Bitkilerin toplam GSH (Glutatyon) miktarları Queval ve Noctor (2007)’ye göre belirlenmiĢtir. Toplam AsA içeriği askorbat oksidaz eklenmesi sonucu 265 nm’deki değiĢim hesaplanarak belirlenmiĢ (Foyer ve ark., 1983), GSH ve GSSG, DTNB ve GR eklenmesini takiben 412 nm’deki değiĢim üzerinden hesaplanarak belirlenmiĢtir (Griffith, 1980).
21 3.4.16. Ġstatistiksel Değerlendirme
Denemeden elde edilen bulguların değerlendirilmesi için varyans analizleri (SPSS 21) istatistik paket programı ile yapılmıĢ, ortalamalar arasındaki farklılıklar % 5 önemlilik seviyesinde LSD testine göre belirlenmiĢtir (DüzgüneĢ ve ark., 1987).
22 4. BULGULAR VE TARTIġMA
4.1. Deneme Alanları Toprak Örneklerinin Bazı Fiziksel ve Kimyasal