Apoptozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler; morfolojik görüntüleme yöntemleri, immünohistokimyasal yöntemler, biyokimyasal yöntemler, immünolojik yöntemler ve moleküler biyoloji yöntemleridir (Ulukaya 2003). Her bir yöntemin, apoptozis sürecinde görev alan organellere göre dağılımı Şekil 1.6’da gösterilmiştir (Huerta ve ark 2007).
1.9. 1. Hematoksilen-eozin Boyama
Hematoksilen-eozin’le boyamada, hematoksilen boyası kromatini boyadığından apoptotik hücreler nükleus morfolojisine göre değerlendirilir. Gözlenebilen değişiklikler şunlardır: hücre küçülmesi veya sitoplazmik küçülme, kromatinin kondanse olması ve nükleus zarının periferinde toplanması, nükleusun küçülmesi veya parçalara bölünmesi (Güles ve Eren 2008).
Şekil 1.6. Apoptozisin organellerde gerçekleşen süreçlere göre belirlenme yöntemleri (Ulukaya 2003)
1.9.2. Giemsa Boyama
Giemsa ile boyamada, hematoksilen-eozin ile boyamada olduğu gibi nükleus morfolojisi esas alınarak apoptotik hücreler tanınır (Güles ve Eren 2008).
1.9.3. Floresan Mikroskopi
Floresan mikroskopi, floresan maddelerin kullanılmasıyla yapılan bir boyama şeklidir. Floresan boyalar DNA’ya bağlanabildiklerinden hücrenin kromatini dolayısıyla nükleusu görünür hale gelebilir. Canlı ve ölü hücre ayrımını yapabilmek için, canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen bir boya (Hoechst boyası) ile sadece ölü hücreleri boyayabilen bir başka boya (Propidium iyodur) beraber kullanılır.
Membranı sağlam olan (canlı) hücreler, propidium iyodür gibi sadece membran bütünlüğü bozulmuş (ölü) hücreleri boyayan bir madde ile boyanmazlarken, ölü veya canlı tüm hücrelere girebilen Hoechst boyası ile boyanırlar. Bu yöntemle hücrelerin ölü ya da canlı olduğu anlaşılabilir ama ölü hücrelerin apoptozla veya nekroz ile ölüp ölmediklerinin ayrımı, hematoksilen boyamada olduğu gibi nükleus morfolojisine bakılarak yapılır (Güles ve Eren 2008).
1.9.4. Elektron Mikroskopi
Morfolojik değişikliklerin en doğru olarak gözlendiği bir yöntemdir. Sitoplazmik küçülme, kromatin kondansasyonu ve fragmentasyonu izlenebilirken, mitokondrinin durumu, hücre zarı ya da nükleus membranının bütünlüğünün bozulup bozulmadığı gibi subsellüler detaylar da incelenebilir (Güles ve Eren 2008).
1.9.5. Faz Kontrast Mikroskopu
Bu tür mikroskop sadece hücrelerin kültür ortamında, hücreyi veya hücre topluluğunu incelemek amacıyla kullanılır. Ölen hücrelerin yapıştıkları alt tabakadan ayrılarak besi yerinde yüzmeleri, apoptotik hücreler üzerinde gelişen cepçiklerle, hücreler henüz alt tabakaya yayılmış halde iseler stoplazmalarındaki vaküoller izlenebilirler (Güles ve Eren 2008).
1.9.6. Anneksin-V Yöntemi
Normal hücrelerde hücre zarının sitoplazmik yüzünde membran lipitlerinden biri olan fosfatidilserin (PS) bulunmaktadır. Eğer hücre apoptoza giderse normalde iç yüzde yerleşmiş olan PS molekülleri hücre zarının dış yüzüne transloke olurlar. Bu yer değiştirme hücre membran bütünlüğünün bozulmadığı apoptotik hücre ölümünün erken dönemlerinde meydana gelir. Anneksin- V, hücrenin dış yüzeyine transloke olan fosfatidilserine bağlanabilen bir protein olduğu için, floresein izotiyosiyanat (FITC) ile işaretlenerek apoptotik hücre görünür hale getirilebilir (Şekil 1.7). FITC- Anneksin-V komplesinin hücre yüzeyindeki fosfatidilserine bağlanma oranı flow sitometri ile ölçülebilmektedir. Nekrotik hücrelerin yüzeylerinde de Anneksin-V bağlanması görülebildiği için ikinci boya olarak propidyum iyodür eklenmektedir (Güles ve Eren 2008).
Şekil 1.7. Apoptosis-indüklenmiş memran değişimlerinin Annexin V ile tanımlanma şeması (http://www.rndsystems.com/)
1.9.7. TUNEL Yöntemi
DNA kırıklarının in situ olarak tanınmasını sağlar. Konvansiyonel parafin kesitleri, terminal deoksinukleotidil transferaz (TdT) ve nonizotopik işaretli nükleotidler (sıklıkla biyotinli dUTP) kullanılarak yapılan in situ işaretleme ardından floresan veya enzimatik görüntüleme, apoptotik hücreleri diğerlerinden ayırmada yeterli olmaktadır. Bu yöntem yaygın olarak “TdT-dUTP nick-endlabelling” sözcüklerinin kısaltılması olan “TUNEL” yöntemi adıyla anılmaktadır (Güles ve Eren 2008).
1.9.8. M30 Yöntemi
M30 yönteminde apoptotik hücreler, sitokeratin 18’in kaspazların etkisiyle kırılması sonucu açığa çıkan yeni antijenik bölgenin immünohistokimyasal yöntemle boyanması prensibine göre belirlenirler (Güles ve Eren 2008).
Sitokeratin 18 (CK 18), tek katlı ve glandüler epiteliyal hücrelerin major komponenti olan bir tip-1 intermediate filament proteinidir. Apoptozis esnasında epiteliyal efektör kaspaz 3, 6 ve 7’nin aktivasyonu sonucunda CK-18 açığa çıkmaktadır. Monoklonal antikor olan M-30, bir neoepitop olup, kaspaz aktivasyonu sonucu açığa çıkan CK-18’i spesifik olarak saptamaktadır. M-30, sadece kaspaz aktivasyonu sonucu açığa çıkan CK-18’i saptamaktadır. M-30 antikorlarının sadece apoptotik hücreleri saptadığını, ancak nekrotik hücreleri saptamadığı immünohistokimyasal olarak gösterilmiş ve M-30 antikoru reaktivitesinin, apoptozisde bir indeks olarak kullanılacağı belirtilmiştir (Leers ve ark 1999).
1.9.9. Kaspaz-3 Yöntemi
Kaspaz-3 yöntemi ile sadece apoptotik hücrelerde oluşan aktif kaspaz-3 immünohistokimyasal boyama metoduyla belirlenebilir (Güles ve Eren 2008).
1.9.10. Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz, orta büyüklükte ve büyük DNA moleküllerini elektroforezle ayırmak için en yaygın destek ortamıdır. Agaroz jeller genellikle floresan bir boya olan ethidium bromide ile boyanır ve UV ışığı altında DNA parçaları görüntülenir. Apoptotik hücrelerdeki endonükleaz aktivasyonu, kromatinin oligonukleozomal
parçacıklara ayrılmasına neden olur. Bu enzim kalsiyum ve magnezyum bağımlı olup, DNA’da tipik olarak 180-200 baz çifti ve katları biçiminde bir parçalanmaya yol açar. Bu parçalanma paterni, agoroz jel elektroforezinde merdiven biçiminde “ladder pattern” izlenir ve apopotoz için tipiktir. Agaroz jel elektroforez güvenilir sonuçlar veren kalitatif bir analiz yöntemidir (Güles ve Eren 2008).
1.9.11. Western Blotting
Western blotlama ya da immünoblotlama denilen yöntem, bir protein karışımı içindeki belirli bir proteini ve büyüklüğünü saptamak için kullanılan nicel bir yöntemdir. Bu metot istenilen bir proteine karşı yönlendirilen yüksek kalitede bir antikor kullanımına bağlıdır. Bu antikor prob olarak kullanılarak ilgili protein bir karışımın içinden saptanabilir. Western blot hücrede ne kadar protein biriktiğini gösterir. Bu metot yardımıyla apoptoza özgü bazı proteinlerin eksprese olup olmadıklarının (örn. bcl-2) ya da kırılıp kırılmadıklarının (örn. kaspaz-3) saptanması mümkündür. Sitokrom c’nin mitokondriden çıkıp çıkmadığı da bu metotla belirlenebilir (Güles ve Eren 2008).
1.9.12. Flow Sitometri
Flow sitometri yardımıyla, floresan bir madde ile işaretlenmiş antikor kullanılarak apoptozda eksprese olduğu bilinen herhangi bir hücre yüzey proteininin saptanması mümkündür. Böylece apoptotik hücreler belirlenebilir. Kolay uygulanabilir olması, aşırı uzun zaman almaması ve kantitatif sonuç verebilmesi açısından klinikte apoptozun belirlenmesi açısından kullanışlıdır.
Apoptoz flow sitometri uygulamasında iki şekilde belirlenir. a. Floresan bir madde olan propidium iyodür kullanılarak, b. Anneksin V kullanılarak (Güles ve Eren 2008).
1.9.13. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA yönteminde, antijen-antikor kompleksine bir enzimle işaretli antiglobulinin ilave edilmesi ve sonra substratın eklenmesi ile eğer antijen veya antikor var ise renk oluşumunun gözlenmesi esasına dayanmaktadır. Duyarlı spesifik ve çabuk sonuç veren bir testtir. Apoptozda görülen ilk olay, sitoplazma içine nükleozomların salınmasını takip eden DNA fragmentasyonudur. ELISA ile gerek
kültürü yapılmış hücre popülasyonlarında, gerekse insan plazmasında DNA fragmentasyonunu tespit etmek mümkündür. Aynı şekilde M30 düzeylerinin ölçümü de mümkündür. ELISA analizinde, ELISA pleytlerindeki sitoplazmik nükleozomları belirlemek ve yakalamak için iki nüklozomal epitopa spesifik bir çift monoklonal antikor kullanılır. Bu analiz yöntemi agaroz jel elektroforez ile apoptotik DNA merdiveninin belirlenmesinden yaklaşık 500 kat daha fazla duyarlı ve çok sayıda örneğin test edilmesi açısından daha uygundur (Güles ve Eren 2008).