Apopitozisin Saptanmasında Kullanılan Yöntemler

Apopitozis ile ilgili çalışmaların hızla artmasına karşın apopitozisi saptamak ve değerlendirmek kolay olmamaktadır (301). Özellikle tek bir hücrede apopitozis olayı saatler içinde geliştiğinden, apopitotik süreçteki hücreyi morfolojik olarak tanımlamak ve kantifiye etmek zor olmaktadır (302). dişGenellikle çalışmaların güvenilirliğini arttırmak için farklı yöntemlerin birkaçının bir arada kullanılması önerilmektedir (303).

1972 yılında, apopitozis saptandığında hücrenin morfolojik görünümüne göre karar verilmişti. Günümüzde morfolojik değerlendirmelerin yanısıra apopitozise özgü aktivasyonlar moleküler düzeyde belirlenebilmektedir. 1990'lı yıllarda DNA kırıklarının saptanması ve apopitotik hücrelerde aktif kaspazların belirlenmesi ile tanınan apopitozis daha sonraki yıllarda fosfatidilserin translokasyonunu belirleyen yöntemlerle saptanmaya başlandı. 2000li yıllarda ise keratin 18'in kırıldıktan sonraki formunu saptayan antikorların kullanılması ile daha da özgünleşti.

Günümüzde apopitozisin belirlenmesinde kullanılan yöntemler şöyledir:

1. Morfolojik görüntüleme yöntemleri 2. İmmünohistokimyasal yöntemler 3. Biyokimyasal yöntemler

4. İmmünolojik yöntemler 5. Moleküler biyoloji yöntemleri

2.4.6.1. Morfolojik görüntüleme yöntemleri

Işık mikroskobu kullanımı

Hematoksilen boyama: Hematoksilen boyama (HB) hem hücre kültürü çalışmalarında hem de doku boyamalarında kolaylıkla kullanılabilir.

Apopitotik hücrelerin saptanmasında genellikle ilk metod olarak başlanması uygundur ve çeşitli açılardan (örn. ilk değerlendirme, maliyet) diğer metodlara karşı avantaj sağlar. Hematoksilen boyamada, hematoksilen boyası kromatini boyadığından apopitotik hücreler nukleus morfolojisine göre değerlendirilir.

Apopitozise özgü değişiklikler iyi bir boyama yapılmışsa kolayca gözlenebilir.

Gözlenebilen değişiklikler şunlardır: hücre küçülmesi veya sitoplazmik küçülme, kromatinin kondanse olması ve nukleus zarının periferinde

toplanması, nukleusun küçülmesi veya parçalara bölünmesi (304-306).(ekil 2.23)

ekil 2.23. Nomal ve apopitotik insan lökosit hücresi

Giemsa boyama: Giemsa i!e boyamada hematoksilenle boyamada da olduğu gibi nukleus morfolojisi esas alınarak apopitotik hücreler tanınır.

Sitoplazma sınırları hematoksilen boyamaya göre daha iyi seçilebilmekle birlikte hematoksilen boyamaya belirgin bir üstünlüğü yoktur(304-306).

Floresan mikroskobu kullanımı

Floresan boyalar DNA'ya bağlanabildiklerinden hücrenin kromatini dolayısıyla nukleusu görünür hale gelebilir. Eğer hücre kültürü çalışmasında kullanılırlarsa, canlı hücre ile yaşayan hücrenin ayrımına olanak tanırlar.

Oysa, hematoksilen ya da Giemsa boyamanın kullanıldığı örneklerde hücrelerin tamamı yöntemin prensibi gereği zaten ölmektedirler. Canlı ve ölü hücre ayrımım yapabilmek için, canlı veya ölü tüm hücreleri boyayabilen bir boya (örn. Hoechst boyası) ile sadece ölü hücreleri boyayabilen bir başka boya (örn. propidium iyodür) beraber kullanılır. Bu yöntemlerde canlılığın belirleyicisi, hücrenin plazma membranının (hücre zarının) intakt olup olmadığıdır. Membranı intakt olan (canlı) hücreler propidium iyodür gibi sadece membran bütünlüğü bozulmuş (ölü) hücreleri boyayan bir boya ile boyanmazlarken, Hoechst boyası gibi ölü veya canlı tüm hücrelere girebilen

boyalar ise ortamdaki tüm hücreleri boyayarak ölü veya canlı hücre ayrımına olanak sağlarlar. Bu şekilde boyanan hücreler bir floresan mikroskobu ile tanınabilirler. Ölü hücrelerin apopitozisle mi yoksa nekrozisle mi öldüklerinin ayrımı nukleus morfolojisine bakılarak yapılır (304).

Elektron mikroskobu kullanımı

Apopitozisi değerlendirmede en değerli yöntemdir. Morfolojik değişikliklerin en doğru olarak gözlendiği yöntem budur. Mitokondrinin durumu, plazma membranı ve nukleus membranının bütünlüğü daha net değerlendirilir. Elektron mikroskobu çalışmalarında, apopitotik hücrede, sitoplazmik küçülme, kromatin kondansasyonu ve fragmentasyonu seçilmesine olanak verir (304-306).

Faz kontrast mikroskobu kullanımı

Bu tür mikroskop kültür ortamında, hücre topluluğunu incelemek amacıyla kullanılır (304-306).

2.4.6.2. İmmünohistokimyasal yöntemler

Anneksin V yöntemi

Normal hücrelerde hücre zarının sitoplazmik yüzünde fosfatidilserin bulunmaktadır. Eğer hücre apopitozise giderse normalde iç yüzde yerleşmiş olan PS molekülleri hücre zarının dış yüzüne transloke olurlar. Dış yüze transloke olan PS'ler, floresan bir madde île işaretlenmiş Anneksin V kullanılarak görünür hale getirilirler. Böylece apopitotik hücreler saptanmış olur (304, 305).

TUNEL yöntemi

Bu yöntemin ismi Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling kelimelerinin kısaltmasından kaynaklanmaktadır. DNA kınklarının in situ olarak tanınmasını sağlar. Parafin bloklar, donmuş kesitler, kültürü yapılmış solüsyon halindeki veya ya da lameller üzerinde büyütülmüş hücrelerde apopitozisin varlığı bu metodla saptanabilir (ekil 2.24) (304-305).

DNA’lar hızla parçalanmakta olduklarından, birdenbire hücre içerisindeki kromatin ağ bütünlüğünü kaybetmekte ve 3’-OH içeren DNA parçacıklarının sayısı çok yükselmektedir. TUNEL yönteminde terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) enzimi, ortama eklenen biotin dUTP’yi (2’-deoksiuridin 5’-trifosfat), parçalanmış DNA parçacıklarının serbest 3’OH uçlarına transfer etmektedir. Biotin ile işaretlenmiş DNA parçacıklarına, streptavidin gibi spesifik bir molekülün bağlanıp DNA fragmantasyonlarının uçlarında çözünmeyen renkli bir substrat oluşumunun gerçekleşmesiyle apopitotik hücre tanımlanmaktadır (307,308)

ekil 2.24. TUNEL metodu uygulanmış spinal kord görünüm

M 30 Yöntemi

M30 yönteminde apopitotik hücreler sİtokeralin 18'in kaspazların etkisiyle kırılması sonucu ortaya çıkan yeni antijenik bölgenin immünohistokimyasal yöntemle boyanması prensibine göre belirlenir. Sadece sitokeratin 18'i eksprese eden dokularda kullanılması mümkündür. Bu dokular epitelyal kaynaklı dokulardır (304, 305).

Kaspaz-3 Yöntemi

Kaspaz-3 yöntemi İle sadece apopitotik hücrelerde oluşan aktif kaspaz-3 IIIC metoduyla belirlenebilir. Bunun için, dokunun kaspaz-3 eksprese ettiğinin bilinmesi ya da çalışılan dokuda apopitozise yol açan ajanın kaspaz-3'ü kınp kırmadığının bilinmesi gerekir. Ancak, bu bilinirse apopitotik hücreler bu metodla tespit edilebilirler (304).

2.4.6.3. Biyokimyasal yöntemler

Agaroz jel elektroforezi

DNA kınklarının gösterilebildiği bir başka yöntemdir. Apopitoziste DNA, 180 baz çifti ve bunun katlarına karşılık gelen noktalardan kırıldığı için merdiven görüntüsü oluşur. Bu bulgu apopitozisin karakteristik özelliğidir ve nekroziste görülmez. O yüzden apopitozisi nekrozisten ayırmada faydalı yöntemlerden biridir (304, 305).

Western blotting

Apopitozise özgü bazı proteinlerin eksprese olup olmadıklarının (örn.

bcl-2) ya da kınlıp kırılmadıklarının (örn. kaspaz-3) saptanması mümkündür.

Sitokrom c'nin mİtokondriye çıkıp çıkmadığının belirlenmesi de bu metodla belirlenebilir. Yanlız, sitokrom c tespitinde önce alt-fraksiyonlama yapılarak hücrelerin mitokondriyal ve sitoplazmik fraksiyonları ayrılır. Ardından, normalde sitoptazmik fraksiyonda bulunması beklenmeyen sitokrom c'nin bu fraksiyonda tespit edilmesi halinde hücrelerin apopitozise gittikleri anlaşılır (304).

Flow sitometri

Flow sitometri yardımıyla, işaretlenmiş antikor kullanılarak apopitoziste eksprese olduğu bilinen her hangi bir hücre yüzey proteininin saptanması mümkündür. Böylece apopitotik hücreler belirlenebilir. Kolay uygulanabilir olması, aşırı uzun zaman almaması ve kantitatif sonuç verebilmesi açısından kullanışlıdır (304,305).

2.4.6.4. İmmünolojik yöntemler

ELISA

ELISA ile gerek kültürü yapılmış hücre populasyonlarında gerekse insan plazmasında DNA parçalanmasını tespit etmek mümkündür. Aynı şekilde M 30 düzeylerinin ölçümü de mümkündür (304).

Flourimetrik Yöntem

Kültürü yapılmış hücrelerde kaspaz aktivitesinin tayin edilmesinde kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde ilgili kaspazın antikorunun bulunduğu

"plate"lere hücre lizatlarının konulması İle kaspaz molekülleri tutulur, ve sonra ortama kaspazların parçaladığı ve kendisine floresan bir maddenin tutunduğu bir substrat İlave edilir. Ortamdaki kaspaz aktivitesiyle orantılıolarak ortaya çıkan şiddeti fluorimetre İle ölçülerek kaspaz aktivitesi saptanır (304).

2.4.6.5. Moleküler biyoloji yöntemleri

DNA Microarrays

DNA microarray teknolojisi henüz çok yeni ve çok pahalı bir yöntemdir.

Fakat, yakın bir gelecekte tıp pratiğini radikal bir biçimde değiştirme iddiası taşıyan bu teknoloji ile aynı anda ve kısa bir süre içinde (önceden aylarca sürerken) yüzlerce hatta binlerce genin ekspresyon derecelerinin (mRNA'lannın) tespiti mümkün olabilecektir. Böylece, apopitozise özgü hücre yüzey ölüm reseptörlerinin ekspresyon durumları hakkında geniş bilgi edinme olanağı doğacaktır (304).