Antibakteriyel testleri doğal yolla üretilen saf hidroksiapatit, schiff baz katkılı hidroksiapatit ve gümüş katkılı hidroksiapatite antibakteriyel aktivite ölçümü amacıyla Sakarya Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji bölümünde yapılmıştır. Katkısız olan materyal kontrol grubu olarak kullanılmış ve ilaveli materyallerin bakteri öldürücü etkisi (bakterisidal) ya da büyümeyi durdurucu etkisi (bakteriostatik) test edilmek istenmiştir.
Çinko ve gümüş kırılgan bir metal olup, biyokimyasal reaksiyonlarda önemli role sahiptir. Özellikle enzimin yapısına katılmasından dolayı, heterotrofik bakterilerin büyümesi ve çoğalması için elzemdir. Bunun yanı sıra çinkonun ve gümüşün belli bir dozundan fazlası bakteri kolonileri için toksiktir ve mikrobiyal aktiviteleri inhibe etmektedir. Test uygulamasında Escherichia coli bakterisinin patojenik olmayan bir suşu (DHSα) kullanılmıştır. E.coli heterotrofik bir bakteridir. Gerekli besin şartları sağlandığında rahatlıkla üreyebilir.
Antibakteriyel test uygulamalarında bakteri için toksik etki yaptığını ve bakteri büyümesini inhibe ettiğini gözlemlemek için farklı dozlarda schiff baz katkılı diskler kullanılarak disk difüzyon testi uygulanmıştır. Gümüş katkılı tozlar ise toz halde koloni sayma metoduna gore test edilmiştir.
Deneysel çalışmada kullanılan numuneler
Katkısız olarak hazırlanan numuneler;
1. Ticari Hidroksiapatit tozu (Disk haline getirilmiş, 1.4 cm çap)
2. Kemikten üretilen Hidroksiapatit tozu (Disk haline getirilmiş, 1.4 cm çap)
İlk olarak katkısız olarak ticari ve doğal hidroksiapatitin antibakterial test numuneleri disk difüzyon yöntemine göre hazırlanmıştır.
Gümüş ilaveli hidroksiapatite toz halde yapılan koloni sayma metodu test numuneleri; 1. Hidroksiapatit toz (Kontrol)
2. %0.5 Ag ilaveli Hidroksiapatit 3. %1 Ag ilaveli Hidroksiapatit 4. %1.5 ilaveli Ag Hidroksiapatit 5. %2 Ag ilaveli Hidroksiapatit
Çalışmada test mikroorganizması olarak kullanılan Escherichia coli DHSα Microbiologics’den temin edilmiştir. Besi ortamı olarak kullanılan LB Broth sıvı besiyeri ve LB Agar katı besiyeri Merck’den sağlanmıştır.
Bakteri kültürünün çoğaltılması için gerekli LB broth sıvı besiyeri hazırlanmasında 40 gr toz besiyerine 1000 ml distile su lave edilmiştir. Besiyer karışımı erlenmeyerde manyetik karıştırıcı yardımıyla homojenize hale getirilmiştir. Daha sonra ağzı pamuk ve gazlı bez yardımıyla kapatılan tüpler otoklav aleti ile 121˚C’de, 1 atm basınç altında 15 dakika steril edilmiştir. Otoklav işlemi biten besiyerin ağzı sıkı bir şekilde kapatıldıktan sonra ekim işlemine kadar +4 ˚C’de buzdolabında saklanmıştır.
Antibakteriyal testin uygulanması için gerekli LB agar katı besiyeri hazırlanmasında 40 gr toz besiyerine 1000 ml distile su lave edilmiştir. Besiyer karışımı erlenmeyerde manyetik karıştırıcı yardımıyla homojenize hale getirilmiştir. Daha sonra ağzı pamuk ve gazlı bez yardımıyla kapatılarak otoklav aleti ile 121˚C’de, 1 atm basınç altında 15 dakika steril edilmiştir. Otoklavdan sonra besiyeri 50˚C’ye kadar soğutulmuştur. Aseptik şartlarda steril petri kaplarına 4 mm (~20 ml) kalınlığında dökülerek katılaşması beklenmiştir. Katılaşan besiyerleri ekim işlemine kadar +40 ˚C’de buzdolabında saklanmıştır.
Şekil 5.26. Toz hidroksiapatitlerin eklendiği tüpler.
Çalışmada test mikroorganizması olarak Escherichia coli DHSα suşu kullanılmıştır. Çizgi ekim yöntemi ile saf koloni elde edilmiştir. Bütün tüplere 10 ml LB broth sıvı besiyeri koyulduktan sonra birinci tüp (negatif kontrol) ve ikinci tüp hariç (pozitif kontrol) diğerlerine Hap tozları tartılıp eklenmiştir. Sonrasında ağzı pamuk ve gazlı bez yardımıyla kapatılarak otoklav aleti ile 121˚C’de, 1 atm basınç altında 15 dakika steril edilmiştir. Aseptik koşullar altında saf koloniler seçilmiş ve birinci tüp haricinde diğerlerine öze yardımıyla ekim işlemi uygulanmıştır. 24 saat 37±1˚C’de inkübe edilmiştir.
İnkübasyon sonunda spektrofotometre ile 600 nm’de ölçüm yapılmıştır. Daha sonra ölçümü yapılan bakteri kültürleri steril koşullarda LB agar bulunan petri kaplarına ekilmiştir ve 48 saat 37±1 ˚C’de inkübe edilmiştir.
Şekil 5.27. koloni sayma metodunda kullanılan spektrometre cihazı.
Schiff baz katkılı (Çinko SAE) hidroksiapatit disk difüzyon test numuneleri; 1. Katkısız hidroksiapatit disk
2. %0.1 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 3. % 0.2 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 4. %0.5 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 5. %0.7 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 6. E.coli DHSα suşu
7. Luria-Bertani broth sıvı besiyeri (LB broth) 8. Luria-Bertani agar katı besiyeri(LB agar)
Çalışmada test mikroorganizması olarak kullanılan Escherichia coli DHSα Microbiologics’den temin edilmiştir. Besi ortamı olarak kullanılan LB Broth sıvı besiyeri ve LB Agar katı besiyeri Merck’den sağlanmıştır.
Bakteri kültürünün çoğaltılması için gerekli LB broth sıvı besiyeri hazırlanmasında 40 gr toz besiyerine 1000 ml distile su lave edilmiştir. Besiyer karışımı erlenmeyerde manyetik karıştırıcı yardımıyla homojenize hale getirilmiştir. Daha sonra ağzı pamuk ve gazlı bez yardımıyla kapatılarak otoklav aleti ile 121˚C’de, 1 atm basınç altında 15 dakika steril edilmiştir. Otoklav işlemi biten besiyerin ağzı sıkı bir şekilde kapatıldıktan sonra ekim işlemine kadar +4˚C’de buzdolabında saklanmıştır.
Antibakteriyel testin uygulanması için gerekli LB agar katı besiyeri hazırlanmasında 40 gr toz besiyerine 1000 ml distile su lave edilmiştir. Besiyer karışımı erlenmeyerde
manyetik karıştırıcı yardımıyla homojenize hale getirilmiştir. Daha sonra ağzı pamuk ve gazlı bez yardımıyla kapatılarak otoklav aleti ile 121˚C’de, 1 atm basınç altında 15 dakika steril edilmiştir. Otoklavdan sonra besiyeri 50˚C’ye kadar soğutulmuştur. Aseptik şartlarda steril petri kaplarına 4 mm (~20 ml) kalınlığında dökülerek katılaşması beklenmiştir. Katılaşan besiyerleri ekim işlemine kadar +4˚C’de buzdolabında saklanmıştır.
Çalışmada test mikroorganizması olarak Escherichia Coli DHSα suşu kullanılmıştır. Daha önce çizgi ekim yöntemi ile saf koloni elde edilmiş, saf kolonilerden bir tanesi seçilerek LB broth besiyerine ekilmiştir. Mikroorganizma kültürü elde edilmesi için 24 saat boyunca 37±1˚C’ de inkübe edilmiştir.
Katkısız ve çinko SAE ekli Hap disklerin her iki yüzü 30 dakika boyunca UV (Philips Ultra Violet TUV 30w) ışınına maruz bırakılmış ve yüzeyindeki bütün mikroorganizmalar öldürülmüştür.
Antibakteriyel testte disk difüzyon metodu kullanılmıştır. LB agar besiyeri üzerine E.Coli kültüründen alınan numune baget yardımıyla yaygın ekim yöntemi ile ekilmiştir. UV ışınına maruz bırakılarak steril hale getirilen hidroksiapatit diskler (katkısız Hap, %0.1, %0.2, %0.5 ve %0.7 Zn SAE katkılı HAp)aseptik koşullar altında bakteri ekili petri üzerine yerleştirilmiştir. 48 saat 37±1˚C’de inkübe edilmiştir Sonrasında, diskler aseptik koşullarda petri kabından ayrılmış ve tekrar 48 saat 37±1˚C’de inkübe edilmiştir.
BÖLÜM 6. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMA
6.1. Giriş
Bu bölümde, tez çalışmasında Doğal yollardan üretilen hidroksiapatit tozunun karakterizasyon mekanik ve antibakteriyel özelliklerinin belirlenmesi için yapılan deneylerin sonuçları sunulmuştur.