Doğal hidroksiapatitin antibakteriyal özelliğinin tayini için Sakarya Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünde tüm testler aynı ortam ve parametrelerle yapılıp sonuçlanmıştır.
Katkısız doğal ve ticari hidroksiapatitin disk difüzyon yöntemi ile antibakteriyel test sonucu;
1. Ticari Hidroksiapatit tozu (Disk haline getirilmiş, 1.4 cm çap)
2. Kemikten üretilen Hidroksiapatit tozu (Disk haline getirilmiş, 1.4 cm çap)
Şekil 6.23. 48 saatlik inkübasyon ardından ticari hidroksiapatit disk yüzeyinde veetrafında meydana gelen E. coli
Şekil 6.24. 48 saatlik inkübasyon ardından kemikten üretilen Doğal hidroksiapatit disk yüzeyinde ve etrafında meydana gelen E. coli bakteri üremesi.
Şekil 6.25. Sentetik yolla üretilen hidroksiapatit disk, besiyerinden kaldırıldıktan sonra 48 saatlik inkübasyonun.
. . ardından gözlemlenen E. coli bakteri üremesi.
Şekil 6.26. Kemikten üretilen hidroksiapatit disk, besiyerinden kaldırıldıktan sonra 48 saatlik inkübasyonun. . .
. ardından gözlemlenen E. coli bakteri üremesi.
Sonuç olarak uygulanan disk difüzyon testi sonucu kemikten ve ticari üretilen her iki hidroksiapatit disk numunenin antibakteriyel aktivite göstermedikleri belirlenmiştir. Her iki disk numunenin besiyerine temas eden yüzeylerinde ve etraflarında yoğun bakteri üremesi meydana geldiği gözlemlenmiştir.
Gümüş ilaveli hidroksiapatite toz halde yapılan koloni sayma metodu test numuneleri;
1. Hidroksiapatit toz (Kontrol) 2. %0.5 Ag ilaveli Hidroksiapatit 3. %1 Ag ilaveli Hidroksiapatit 4. %1.5 ilaveli Ag Hidroksiapatit 5. %2 Ag ilaveli Hidroksiapatit
Bakteriler Hap Kontrol Tozu
%0,5 Ag HAp %1 Ag HAp %1,5 Ag HAp %2 Ag Hap E.Coli +63 +147 0 +7 +2
Tablo 6.8. % Antibakteriyel aktivite sonuçları.
%R: Antibakteriyel Aktivite
Bakteriler %0,5 Ag Hap %1 Ag HAp %1,5 Ag HAp %2 Ag Hap E.Coli 69.2 100 94,4 98,4
Spektrofotometrede absorbans ne kadar düşükse içerisinde üreyen bakteri sayısı o kadar düşüktür sonucuna varılır. HAp tozu katılarak ve katılmadan oluşturulan bakteri kültürlerinin spektrofotometre sonuçları incelendiğinde, gümüş katkılı HAp tozu eklenen kültürlerin, katkısız HAp eklenen kültürlere göre daha az absorbans verdiği görülmüştür. Bu duruma aykırı olarak, negatif kontrol olarak kullanılan LB broth ile hazırlanan bakteri kültürünün absorbansı, HAp tozu ekli olan örneklerden daha düşük absorbans vermiştir. Spektrofotometre sonuçları alındıktan sonra yaygın ekim yöntemiyle ekilen bu kültürlerden elde edilen sonuçlara göre, katkısız HAp tozu ekli LB brotha ekilen koloni sayısıyla %0,5-1,5-2 gümüş katkılı HAp tozu ekli LB broth koloni sayısı arasında büyük bir fark oluşmazken, %1 gümüş ilaveli kültürden ekilen örnekte gözle görünür bir bakteri azalması oluşmuştur. Testin de sonucuna göre, gümüş eki Hap’ın antibakteriyel özelliği olduğu tespit edilmiştir ve bu özellik gümüşün nin dozu arttıkça değil sadece %1 oranında eklendiğinde antibakteriyel etki gösterdiği görülmektedir. Gümüş ilavesinin %1 in altında veya üstünde kaldığında bakteri üremesi görülmüştür. Beklendiği gibi, kontrol grubu olarak kullanılan katkısız Hap’ın bakteri üremesi üzerinde olumsuz etkiye sahip olmadığı sonucuna varılmıştır.
E.Coli Hap
E.Coli Hap% 0,5 E.Coli Hap %1
E.Coli Hap % 1,5 E.Coli Hap %2
Şekil 6.27. 24 saatlik inkübasyon sonunda meydana gelen E. coli kolonileri, 1) Hap(kontrol), 2) %0.5 Ag Hap,3)
. %1 AgHap 4) %1.5 AgHap, 5) %2 Ag Hap.
Schiff baz katkılı (Çinko SAE) hidroksiapatit disk difüzyon test sonuçları; 1. Katkısız hidroksiapatit disk
2. %0.1 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 3. % 0.2 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 4. %0.5 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 5. %0.7 çinko SAE ekli hidroksiapatit disk 6. E.coli DHSα suşu
7. Luria-Bertani broth sıvı besiyeri (LB broth) 8. Luria-Bertani agar katı besiyeri(LB agar)
1
2 3
Antibakteriyel testte disk difüzyon metodu kullanılmıştır. LB agar besiyeri üzerine E.coli kültüründen alınan numune baget yardımıyla yaygın ekim yöntemi ile ekilmiştir. UV ışınına maruz bırakılarak steril hale getirilen hidroksiapatit diskler (katkısız Hap, %0.1, %0.2, %0.5 ve %0.7 Zn SAE katkılı HAp)aseptik koşullar altında bakteri ekili petri üzerine yerleştirilmiştir. 48 saat 37±1˚C’de inkübe edilmiştir. Sonrasında, diskler aseptik koşullarda petri kabından ayrılmış ve tekrar 48 saat 37±1˚C’de inkübe edilmiştir. Sonuçlar aşağıdaki şekillerde görülmektedir.
Şekil 6.28. Doğal yolla üretilen katkısız Hap tozundan sağlanmış diskin bakteri ekilmiş petri kabındaki 48 saatlik
.
inkübasyonundan sonraki görüntüsü. A) disk kaldırılmadan önce B) disk kaldırıldıktan sonra.
Şekil 6.29. Doğal yolla üretilen üretilen 0,1 Zn SAE katkılı HAp tozundan sağlanmış diskin bakteri ekilmiş .
.
petrikabındaki 48 saatlik inkübasyonundan sonraki görüntüsü. A) disk kaldırılmadan önce B) disk. . . .
. kaldırıldıktan sonra 48 saat inkübasyon sonucu.
A B
Şekil 6.30. Doğal yolla üretilen 0,2 Zn SAE katkılı HAp tozundan sağlanmış diskin bakteri ekilmiş petri kabındaki 48 saatlik inkübasyonundan sonraki görüntüsü. A) disk kaldırılmadan önce B) disk kaldırıldıktan sonra 48 saat inkübasyon sonucu.
Şekil 6.31. Doğal yolla üretilen 0,5 Zn SAE katkılı HAp tozundan sağlanmış diskin bakteri ekilmiş petri kabındaki 48 saatlik inkübasyonundan sonraki görüntüsü. A) disk kaldırılmadan önce B) disk kaldırıldıktan sonra 48 saat inkübasyon sonucu.
Şekil 6.32. Doğal yolla üretilen 0,7 Zn SAE katkılı HAp tozundan sağlanmış diskin bakteri ekilmiş petri kabındaki 48 saatlik inkübasyonundan sonraki görüntüsü. A) disk kaldırılmadan önce B) diski kaldırıldıktan sonra 48 saat inkübasyon sonucu.
A A A B B B
Disk difüzyon testi uygulamasında, tüm yüzeye yaygın ekim yöntemi ile bakteri ekilir ve tüm yüzeyde bakteri üremesi sağlanır. Aseptik koşullarda petri kabına yerleştirilen disk antibakteriyel özelliğe sahip olduğunda etrafındaki bakterilerin üremesini engeller ve bir boşluk oluşturur. Bu duruma inhibisyon zonu denir.
Antibakteriyel özellik ne kadar yüksekse zon o kadar büyük çaplı olur. Sonuçlar incelendiğinde Şekil 6.28.’de doğal yolla üretilen Hap diskte zon oluşmamıştır ve antibakteriyel bir etkisi olmadığı gözlenmiştir. Şekil 6.29. ve Şekil 6.30.’da %0.1 Zn SAE katkılı Hap ve %0.2 Zn SAE katkılı Hap diskte inhibisyon zonu gözlenmemiştir. Şekil 6.31.’de %0.5 Zn SAE katkılı diskin bulunduğu petride küçük çağlı bir zon gözlenmiştir. Şekil 6.32.’de %0.7 Zn SAE ktkılı Hap diskte oluşan inhibisyon zonu %0.5 Zn SAE katkılı Hap disklerden daha büyük çaplıdır. Sonuç olarak, çinko SAE ekli Hap disklerde antibakteriyel etki gözlenmiş ve bu etki en yüksek dozda en fazla inhibisyon zonu oluşturmuştur.
Diskler kaldırıldıktan sonra hiçbir bakteri kolonisi gözlenmemiştir. Buradan çıkarılacak sonuç, diskin temas ettiği yüzeyler bakteriler üzerinde bakterisidal etki yaratmıştır. Fakat kontrol grubu olarak kullandığımız katkısız HAp ve 0.1, 0.2, 0.5 Zn SAE katkılı diski çıkarılıp, 48 saat inkübasyon yapıldığında diskin çıkarıldığı yere yakın bakteri büyümesi gözlemlenmiştir.