Outra fonte possível de modulação da função gênica pode ser atribuída a variações genéticas existentes nos genes. O sequenciamento do genoma humano permitiu a identificação de variações genéticas em importantes genes, os quais através de estudos epidemiológicos do tipo caso-controle sugerem a participação destas variações como genes de baixa penetrância para o desenvolvimento de doenças.
Para compreender a base mecanistica através da qual um polimorfismo pode estar associado com um fenótipo em particular é necessário saber se que o polimorfismo é funcional (ou seja, se altera a função de um gene ou conjunto de genes). Na maioria dos casos, a função de um polimorfismo não está definida e deve ser imaginada ou extrapolada como um efeito sobre o gene que contém este polimorfismo. Em casos raros, o polimorfismo pode ser uma variação não sinônima em regiões de codificação de aminoácidos que altera a estrutura da proteína. Polimorfismos mais comuns são potenciais polimorfismos regulatórios localizados em regiões não codificadoras, incluindo regiões promotoras downstream/upstream e também em regiões intronicas, que podem afetar a transcrição (Chorley et al., 2008). Em introns e regiões UTR, polimorfismos podem alterar processos de transcrição, splicing e tradução (Sadee et al., 2011).
Polimorfismos individuais podem ter impacto funcional mínimo, mas podem estar em desequilíbrio de ligação com um conjunto de polimorfismos que formam um haplótipo associado a um resultado funcional na expressão ou função do gene. Considerando que um polimorfismo pode ter um efeito demonstrado na função de um gene, existem diferentes maneiras de demonstrar a função de uma variante genética. Estes vão desde estudos in vitro até estudos que buscam determinar o impacto funcional de um determinado polimorfismo sobre a expressão gênica em humanos como a mais clara indicação de um "polimorfismo funcional." Assim, para fins de geração de discussão sobre esta questão, um potencial sistema para classificar a função de uma variante ou polimorfismo de sequência pode ser apresentado (Albert, 2011):
Classe 0: Função não determinado. Ou (A), a função é conhecida, ou (B) a função teórica é pode ser prevista, mas não foi demonstrada experimentalmente;
Classe 1: Funcional in vitro. O efeito funcional do polimorfismo de um elemento de DNA-alvo ou mecanismo de regulação tem sido demonstrado através de ensaios in
vitro (por exemplo, shifting in gel, ensaios repórter, ensaios de ligação e interação a
alvos); no entanto, a função do polimorfismo na expressão do gene endógeno ou in vivo é desconhecida;
Classe 2: Funcional in vivo. Em adição aos requisitos da classe 1, (A) Efeito da função do polimorfismo no gene endógeno foi testado no modelo de sistemas celulares (por exemplo, linhagens de células humanas transformadas, linfócitos humanos, culturas de células primárias) usando métodos tais como expressão alélica e imunoprecipitação da cromatina, e (B) em função in vitro correlaciona-se com uma mudança funcional em tecido humano;
Classe 3: Fenocópia Funcional. Em adição aos requisitos da classe 1, função (A) tem sido demonstrada in vivo utilizando modelos de organismos, tais como camundongos knock-out, e a função (B) está correlacionada com uma mudança funcional em tecidos humanos.
Nota-se que, dentro de cada classe, o grau de perturbação funcional pode variar. Assim, a classificação de classe não indica a magnitude do impacto funcional do polimorfismo. Em vez disso, ele só indica o grau em que o impacto tem sido investigado. Além disso, a classe de um polimorfismo não implica a sua importância em uma dada população: um polimorfismo pode ter um grande impacto sobre a função in
vivo, mas é muito raro e não é útil como um marcador na população em geral.
Diversos genes de reparo apresentam variantes polimórficas, incluindo XPC. Dos diferentes polimorfismos existentes, os mais frequentes e estudados são: uma inserção de 83 pares de bases de repetições AT no intron 9 (polimorfismo conhecido como PAT+), uma substituição de citosina para adenina no sitio de splicing do intron 11 (polimorfismo conhecido como IV11-6C/A) e a troca de uma Lisina por Glutamina no códon 939 da proteína (K939Q)(Khan et al., 2000; Khan et al., 2002). Além disso, os três polimorfismos apresentam forte desequilíbrio de ligação, sendo assim, herdados juntos no formato de um haplótipo.
Diversos estudos têm analisado os possíveis impactos destes polimorfismos de
XPC na susceptibilidade a diversos tipos de câncer, de onde estudos de meta-análise a
partir de dados epidemiológicos casos-controle têm sugerido a participação destas variantes em alguns tipos específicos de tumores, como por exemplo pulmão, bexiga e cabeça e pescoço (Francisco et al., 2008). Quanto ao envolvimento destes polimorfismos com melanoma, diversos estudos foram feitos, com resultados diferentes.
Os primeiros estudos conduzidos em populações européias (Blankenburg et al., 2005; Millikan et al., 2006; Povey et al., 2007) e norte-americanas (Li et al., 2006) não demonstraram participação dos polimorfismos de XPC na susceptibilidade a melanoma. No entanto, estudos posteriores de regiões com maiores índices de UV demonstraram que polimorfismos em XPC podem contribuir para o aumento do risco (Gonçalves et
al., 2011; Oliveira et al., 2013; Torres et al., 2013). Em especial, no estudo de
Gonçalves e colaboradores (2011), estudo este conduzido pelo grupo, os polimorfismos de XPC se mostraram associados com demais fatores de risco no desenvolvimento de melanomas, demonstrando assim uma relação importante entre a existência de variantes genéticas de XPC e demais fatores de risco, como por exemplo, o padrão de exposição solar.
Já com relação a atividade funcional destes polimorfismos, alguns estudos procuraram investigar seus possíveis efeitos na atividade de XPC e consequentemente de reparo. Alguns estudos sugeriram menor capacidade de reparo conferida a estes polimorfismos, principalmente em relação aos polimorfismos PAT+ e K939Q, no entanto tais estudos são baseados em linfócitos de pacientes, método que pode estar sujeito a outras variações genéticas que não foram analisadas (Qiao et al., 2002). O outro polimorfismo de XPC estudado funcionalmente é a mudança da base citosina por adenina no nucleotídeo – 5 do sitio aceptor de splice do íntron 11. Com esta alteração, a chance de um processamento do RNA perder o exon 12 é aumentada, pois a afinidade de ligação e reconhecimento do spliceossomo é diminuída. Esta hipótese foi verificada e os resultados indicaram que indivíduos com genótipo AA tinham um aumento significativo de perda do exon 12 em comparação aos indivíduos CC, enquanto os heterozigotos (CA) também tinham um aumento significativo, mesmo sendo este
intermediário, onde esta maior perda do exon 12 do genótipo AA correlacionava-se com menor atividade de reparo (Khan et al., 2002). Já a análise funcional desta deleção do exon 12 resultou em perda da função de um cDNA de XPC em corrigir a atividade de reparo de células XP-C. Além disso, os resultados demonstraram um efeito dominante negativo da função de reparo em células normais (Khan et al., 2002). A perda deste exon leva consequentemente a perda do sítio de interação de XPC com hHR23B (Li et
al., 1997).
No entanto, uma maior análise do impacto destes polimorfismos, seja na estabilidade do mRNA, uma vez que dois dos polimorfismos estão localizados em regiões intrônicas (sendo uma delas no sitio de splicing), seja na atividade da proteína mediante a troca de lisina por glutamina no códon 939 ainda não foram devidamente exploradas, principalmente para neoplasias tais como o melanoma. Neste caso, o estudo das possíveis modulações que estes polimorfismos de XPC possam causar na função da proteína e consequentemente no processo de reparo de DNA, pode contribuir para o entendimento do papel de XPC no desenvolvimento de melanoma.
Desta maneira, agora com a descrição de variantes polimórficas que podem interferir com atividade do gene/proteína, há um cenário de investigação para o possível estudo dos fatores que influenciam na atividade de XPC. Dada a importância que a atividade de XPC e de reparo de DNA em si tem mostrado no desenvolvimento de melanomas, o estudo das atividades que possam modular essas atividades, contribuindo para a aquisição de mutações carcinogênicas, tem grande importância no entendimento da biologia do desenvolvimento de melanomas, e consequentemente é o objetivo desta tese.
2. OBJETIVOS