AKDENİZ / YUNAN ADALARI / TÜRKİYE

As reações foram realizadas em termociclador 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) com o sistema SYBR Green. Nossas amostras foram compostas do controle, (sem tratamento); submetidas à indução da inflamação pelo LPS, na concentração de 10 µg/mL (PAIMELA et al., 2007) por 24 horas (MIMURA, 2012) e submetidas à indução e tratadas com o peptídeo ANXA1Ac2-26 na concentração de 5 µg/mL e 100 µg/mL. Os iniciadores

específicos para cada trancrito foram desenhados com a ferramenta Primer3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi), conforme a seguir na tabela 1.

Tabela 1. Iniciadores para os genes de interesse

Oligonucleotídeo Sequência

LRAT right 5’ AGATGCCATAGTGGGTCAGG 3’

LRAT left 5’ CGAAGACAAAGGGAGGAACA 3’

CTGF right 5’ TGGAGATTTTGGGAGTACGG 3’

MAP1B right 5’ CAGGATGGGTGGTGCTTAGT 3’

MAP1B left 5’ AGTCCGGCTCTTTCTCCTTC 3’

ALDH1A3 right 5’ GTCCGATGTTTGAGGAAGGA 3’

ALDH1A3 left 5’ GAATACGCTTTGGCCGAATA 3’

SETD7 right 5’ ACATACGTGCCCTGGAGAAC 3’

SETD7 left 5’ GCACCCTGGAGGGGTATTAT 3’

As reações foram preparadas em triplicata, incluindo o controle endógeno, gliceraldeído 3 fosfato dehidrogenase (GAPDH), beta actina (ACTB) e beta tubulina (TUBB) e processadas em volume final de 20 PL contendo 100 a 500 ng de cDNA, SYBR® Green PCR Master Mix e 100 nM de cada primer, segundo protocolo da Applied Biosystems. Como controle de qualidade, as reações para amostras com valores de desvio significativos (> 2%) foram repetidas utilizando sempre o mesmo cDNA estoque.

As condições de termociclagem compreenderam uma incubação de 2 min a 50°C, seguida por desnaturação inicial de 10 min a 95°C. Em seguida, o programa continuou com 40 ciclos de 15 seg a 95°C, 1 min a 60°C para anelamento de primers e extensão das cadeias, seguidos de 35 seg a 65°C para coleta do sinal. A curva de dissociação foi gerada após amplificação e compreendeu um passo de 15 seg a 95°C seguido de 1 min a 60°C.

A quantificação da expressão foi realizada comparando-se os valores obtidos com curvas padrões, desenhadas pela diluição seriada, a partir de um pool de amostras de cDNA. O fator de normalização utilizado foi a média geométrica dos genes contitutivos, utilizado como controle interno (controle endógeno). Finalmente, os valores de expressão gênica, obtidos nas análises, foram novamente normalizados pelo resultado da quantificação da amostra controle, escolhida como calibrador de todas as amostras.

Dessa forma, a partir dos valores do Ct (Cycle threshold)* de cada amostra, foram

calculadas as médias das triplicatas. Posteriormente, foi calculado o ΔCt a partir da subtração da média obtida para a sequência de interesse por aquela do controle interno. Para o cálculo do

Δ-ΔCt, foi escolhida a amostra estimulada por LPS como calibrador, sendo atribuído ao mesmo

o valor de zero como resultado da subtração com seu próprio ΔCt. Nas demais amostras

(tratadas com ANXA1Ac2-26), o resultado do Δ-ΔCt foi calculado a partir das diferenças dos

valores de ΔCt de cada um deles em relação ao calibrador. Em seguida, foi calculado o 2-Δ-

ΔCt, ou seja, o 2-(Δ-ΔCt)

. Finalmente, para uma melhor representação gráfica, os resultados foram apresentados em uma escala logarítmica de base 2 (Log2).

Foi considerado aumento ou redução significativa de expressão quando o valor de expressão foi duas vezes maior ou menor, respectivamente, em relação à amostra controle ou quando esteve acima ou abaixo de 1 quando apresentado na forma de Log2.

* Cycle threshold ou Ct é o ciclo no qual as amostras atingem o ponto de detecção da fluorescência pelo equipamento.

2.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas

A fim de quantificar as citocinas dos sobrenadantes das células ARPE-19, submetidas às diferentes condições experimentais descritas acima, utilizamos o kit MILLIPLEX MAP HCYTOMAG 60K e o equipamento LUMINEX xMAP MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) para a detecção multiplex quantitativa de múltiplos analitos, com rapidez e especificidade, por meio de beads magnéticas.

As células ARPE-19 foram semeadas com meio completo DMEM:F-12 na concentração de 5x104 células por poço (placa de 6 poços). Após esse período, o meio de cultura completo foi substituído por meio sem soro (DMEM:F-12 0%), a fim de deixar todas as células na mesma etapa celular. Após 24 horas, o meio sem soro foi substituído pelo meio completo e adicionado LPS [10 µg/ml] em um conjunto de poços correspondentes aos grupos LPS e em outro conjunto de poços, após a indução por LPS, houve o tratamento com o ANXA1Ac2-26 nas concentrações

de 5 µg/ml e 100 µg/ml.

O sobrenadante das células foi cuidadosamente retirado, centrifugado, aliquotado e mantido a -20ºC até o momento do uso. As beads magnéticas, soluções controles, tampão de lavagem, soro matriz e padrões foram preparados e homogeneizados conforme as intruções decritas no kit (HCYTOMAG-60K, Milliplex MAP Kit, Millipore). Inicialmente, foram adicionados

25 μL dos padrões, soluções controles e amostras na placa magnética de 96 poços, lavada

previamente com o tampão de lavagem. Em seguida, 25 μL de assay buffer foi adicionado às

amostras, 25 μL do soro matriz aos padrões e, 25 μL de beads magnéticas revestidas com anticorpos específicos (HCYTOMAG-60K, Milliplex MAP Kit, Millipore) à todos os poços (controles, padrões e amostras). A placa foi selada com selante próprio, revestida com papel alumínio e incubada overnight a 4˚C, sob agitação no shaker. No dia seguinte, a placa foi

lavada duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem e, incubada com 25 μL de anticorpo de detecção ligado a biotina à temperatura ambiente, por uma hora, no shaker. Para completar a

reação, 25 μL de ficoeritrina conjugada à estreptavidina foi adicionada e incubada por 30 minutos, protegida da luz à temperatura ambiente, sob agitação. A placa foi então lavada duas

vezes e incubada com 150 μL do fluido (Drive Fluid) por cinco minutos à temperatura ambiente, no shaker. Em seguida, a leitura da placa foi realizada pelo LUMINEX xMAP MAGPIX.

A concentração dos analitos foi determinada pelo software MAGPIX xPONENT (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Os ensaios foram realizados em quintriplicatas para confirmar os resultados. Os analitos estudados foram: Interleucina 6 (IL-6), Interleucina 8 (IL-8), Interleucina 1 beta (IL-1β), expressão e secreção de Células T reguladas e normais (Rantes), proteína quimiotática para monócitos (MCP-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (INF-γ), interleucina 10 (IL-10), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e fator de crescimento epidérmico (EGF).

2.8 Análises dos dados

A morfologia celular foi avaliada no microscópio invertido OLYMPUS, CKX41. No teste de proliferação celular foi observado em qual tempo o tratamento mostrou uma diferença estatística mais significante em relação ao crescimento celular. O programa GrapghPad Prism 5 (GraphPad Software) foi utilizado para análises estatísticas iniciais, primeiramente foi realizado o Teste de normalidade, após foi realizado, comparando todos os grupos, o teste de variância não-paramétrico Kruskal-Wallis e o Teste de comparação múltipla de Dunn’s. O teste de análise

da variância one-way foi utilizado para comparar os grupos em cada tempo experimental. A diferença significante foi assumida quando o valor de P ≤ 0,05.

No teste de migração celular as imagens foram fotografadas nos tempos 0, 8, 24, 32 e 48hs e a análise quantitativa da área de fechamento da ranhura foram analisadas utilizando o programa Axiovision Rel. 4.7 (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Após observação dos resultados da morfologia, índice de proliferação e ensaio de migração celular nos tempos propostos, foi escolhido aquele que deu a maior diferença estatística para realizar as técnicas de RaSH, MagPix e RT-qPCR.

As bibliotecas geradas na tecnologia de RaSH foram submetidas à análise pelo software Ingenuity Sistems©, com o objetivo de relacionar os genes encontrados como diferencialmente expressos com as funções biológias e os processos no qual eles estão envolvidos e avaliar quais as principais redes de interação entre eles. Esse programa é um banco de dados curado, construído com base em milhares de artigos científicos, livros e outras bases de dados disponíveis, por cientistas altamente qualificados.