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A metodologia empregada neste trabalho foi elaborada em concordância com a legislação vigente e aprovada pela Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA) da Universidade Federal de Viçosa (protocolo 014/2012).

- Pré-operatório

Para este estudo foram utilizados 12 cães adultos saudáveis, fêmeas, pesando entre 10 e 15 kg, alojados em baias individuais disponíveis no Canil Experimental da UFV. Ao longo do experimento, receberam ração comercial e água ad libitum com período de adaptação de no mínimo 30 dias, onde foram vacinados e receberam tratamento contra endoparasitas. Estes cães apresentavam no máximo gengivite (doença periodontal grau 1 de acordo com recomendações do American Veterinary Dental College), sendo este o critério de exclusão.

Os animais selecionados para a realização do experimento foram divididos em dois grupos, com seis animais em cada, sendo um grupo utilizado como controle e o outro grupo recebeu tratamento.

- Primeiro procedimento cirúrgico

O primeiro procedimento cirúrgico constou da indução de doença periodontal com a confecção de um defeito periodontal com dimensões padronizadas.

Para tal, os cães foram sedados com acepromazina (0,1 mg/kg)por via endovenosa, após jejum hídrico e sólido de 12 horas. A anestesia geral foi induzida com propofol (6 mg/kg) também por via endovenosa e mantida com mistura de isofluranoe oxigênio.

Os animais do grupo controle foram posicionados em decúbito lateral, expondo a gengiva bucal da mandíbula direita que foi higienizada, juntamente com toda a coroa dos dentes com solução de clorexidine a 0,12%. Foi criado um retalho mucoperiosteal, realizando-se uma incisão no sulco gengival do terceiro e quarto pré-molares da mandíbula no sentido caudo-rostral, e duas incisões na gengiva bucal, uma caudal ao quarto pré-molar e a outra rostral ao

terceiro pré-molar. O retalho foi deslocado apicalmente expondo o osso alveolar.

Um defeito no quarto pré-molar inferior foi provocado com o auxílio de uma broca cônica FG acoplada a um motor de alta rotação. O defeito obedeceu às seguintes medidas: 6 mm na direção corono-apical (medido desde a junção cemento-esmalte até a borda mais apical do defeito); 7mm no sentido mesio- distal e 3mm de profundidade (sentido vestíbulo-lingual) medido desde a superfície vestibular da raiz até a superfície mais lingual do defeito ósseo (Figura 1). Essas medidas foram realizadas com auxílio de sonda periodontal milimetrada.

Figura 1: Padronização do defeito ósseo realizado em 3º e 4º pré-molares da mandíbula de cão.

As raízes expostas foram curetadas utilizando-se cureta Gracey para remover as fibras de Sharpey e cemento. O mesmo defeito foi realizado sob o terceiro pré molar. Foram obtidas neste momento, radiografias das regiões operadas, utilizando filme intra-oral,com o filme posicionado na região lingual da mandíbula, ou seja, técnica do paralelismo, utilizando aparelho de raios X odontológico.

Em seguida, o defeito periodontal foi preenchido com poliéster de moldagem (Figura 2) para prevenir a regeneração espontânea do defeito agudo e promover sua cronificação com contaminação por bactérias da placa bacteriana (Macedo et al., 2006; Roriz et al., 2006).

Figura 2: Poliéster de moldagem para cronificação do defeito ósseo, em 3º pré molar do grupo controle.

O retalho foi reposicionado e suturado em padrão interrompido simples, também com poliglactina 910 (Figura 3).

No grupo tratado, os mesmos procedimentos descritos acima foram realizados, sendo que neste grupo o defeito sob o quarto pré-molar foi realizado no lado direito, enquanto o defeito sob o terceiro pré-molar foi realizado no lado esquerdo da mandíbula do animal, permitindo assim melhor cicatrização do flap gengival, diminuindo as chances de deiscência e perda da membrana.

Figura 3: Sutura de flap em padrão simples, realizado com Poliglactina 910 3.0, sobre os 3º e 4º pré-molares da mandíbula no grupo controle. - Pós-operatório

Os animais receberam morfina12 (2mg/kg)(Cruz, 2002) a cada seis horas durante 24 horas por via subcutânea para analgesia, e as feridas cirúrgicas foram limpas diariamente com solução de clorexidina a 0,12% até a cicatrização da ferida.

- Segundo procedimento cirúrgico

Durante os três dias anteriores ao segundo e ao terceiro procedimento cirúrgico, os cães receberam como antibioticoterapia profilática doxiciclina (10mg/Kg)¹, via oral, a cada 24 horas.

Após 21 dias de indução da doença periodontal, os animais foram anestesiados como descrito anteriormente e o poliéster de moldagem foi retirado, curetando-se o defeito. Em seguida os animais receberam profilaxia periodontal com raspagem da placa e cálculo se existentes (curetas e ultra-som odontológico) e polimento. Um programa de controle da placa foi instituído, com escovação diária e aplicação de clorexidine 0,12% duas vezes ao dia por duas semanas.

- Terceiro procedimento cirúrgico – Regeneração tecidual guiada

Duas semanas após o procedimento anterior, foi realizado o tratamento cirúrgico. O pré-operatório foi o mesmo realizado para o primeiro procedimento cirúrgico, assim como a sedação e anestesia dos animais. Com o mesmo acesso cirúrgico descrito anteriormente, os defeitos foram expostos e curetados para retirada de tecido de granulação, assim como as raízes expostas nos defeitos.

Nesse momento foi introduzida a técnica de regeneração tecidual guiada. Foi utilizada nesse trabalho a membrana composta por 60% de hidroxiapatita e 40% de policaprolactona. A utilização da membrana composta por 75% de hidroxiapatita e 25% de policaprolactona foi descartada apesar da mesma apresentar melhores características morfológicas quando comparada a membrana 60HAP/40PCL. Isso occoreu devido ao fato que, em estudo prévio realizado com a membrana 75HAP/25PCL, a mesma não apresentou facilidade no manuseio, sendo perdida quando avaliada in vivo.

Antes do posicionamento da membrana cobrindo o defeito, a mesma foi aquecida à 100 graus, para que se tornasse maleável, facilitando assim seu manuseio e permitindo que a mesma recobrisse todo o defeito. A membrana, após o aquecimento foi prensada no intuito de diminuir sua espessura e foi posicionada cobrindo o defeito realizado de modo que permanecesse uma borda de pelo menos 2 mm nas direções mesial, distal e apical além do defeito e fixada sobre o osso alveolar com parafuso de titânio (Figura 4). Fio de poliglactina 910 nº 3-0 com sutura em padrão simples foi utilizado para fixar a membrana na posição adequada.

Figura 4: Posicionamento da membrana composta por Hidroxiapatita (HAP 91 Plus®) e policaprolactona, fixada por parafuso de alumínio; sobre defeito ósseo realizado sobre o 4º pré molar inferior.

Com o animal ainda sob efeito da anestesia, foram obtidas radiografias das regiões operadas, utilizando filme intra-oral pela técnica do paralelismo.

- Pós-operatório

Os animais receberam morfina (2 mg/kg) por via subcutânea por 24 horas, a cada seis horas. Receberam também, doxicilina (10 mg/Kg) por via oral por 10 dias, uma vez ao dia, após a cirurgia e as feridas cirúrgicas foram limpas diariamente com solução de clorexidina a 0,12% até a cicatrização. Os animais foram alimentados com comida pastosa até a completa cicatrização da ferida cirúrgica. Foi instalado o controle da placa bacteriana logo após o procedimento cirúrgico por meio de escovação dentária a cada 48 horas até o final do experimento e aplicação de clorexidine 0,12% nos locais de implantação das membranas.

- Exame clínico

O exame clínico local constou de observação diária da ferida cirúrgica por duas semanas e aos 60 dias após a cirurgia, avaliando-se a presença ou ausência de hemorragia, secreção purulenta, deiscência e exposição da membrana. O dia em que a ferida cirúrgica foi considerada fechada foi destacado, ou seja, completa cicatrização gengival. A sensibilidade dolorosa foi avaliada pela reação do animal ao toque da ferida cirúrgica atribuindo-se os escores; 0 - quando o animal permitia o toque e não manifestar reação; 1 -

quando o animal permitia o toque, mas manifestava reação de dor como aumento da freqüência respiratória, vocalização ou tentativa de fuga; 2 - quando o animal não permitia o toque.

O nível clínico de inserção foi medido (medida desde a junção cemento- esmalte até ao local de aderência do epitélio juncional, ou seja, o fundo da bolsa periodontal) antes do tratamento (pré RTG) e aos 60 dias após a cirurgia. A proporção da regressão da doença foi obtida dividindo-se o valor final pelo inicial.

- Radiografias

Radiografias da região operada dos animais de cada grupo foram obtidas antes do início do tratamento (pré RTG) e aos 60 dias após a cirurgia, utilizando filme intraoral pela técnica do paralelismo.

Nas radiografias foram observadas a presença ou ausência da lâmina dura e o espaço do ligamento periodontal. As radiografias foram analisadas também quanto à radiopacidade, comparando a região do defeito com o osso alveolar na base do mesmo. O defeito foi classificado de acordo com os escores: 0 - radiopacidade do defeito menor que a do osso vizinho; 1 - radiopacidade semelhante à do osso vizinho; 2 - radiopacidade do defeito maior que a do osso vizinho. A regularidade das bordas do defeito foi observada, sendo cada borda classificada como regular ou não.

- Tomografia microcomputadorizada

Quantitativamente, os seguintes parâmetros foram avaliados pela microtomografia computadorizada: porcentagem do volume ósseo no defeito em relação ao volume total do defeito (BV/TV); espessura das trabéculas neoformadas (Tb.Th.); distância entre as trabéculas (Tb.Sp.) e número de trabéculas (Tb.N.)

Os parâmetros quantitativos foram avaliados pela microtomografia computadorizada (MicroCT40, Scanco, Switzerland) em 85 kV e 77 mA., e realizada na Universidade de Toronto, Canadá.

Uma amostra do terceiro pré-molar íntegro de um animal não portador de doença periodontal e que veio a óbito por causas naturais no Hospital Veterinário/UFV foi coletado e analisado como referência.

Após a reconstrução de uma imagem bidimensional (2D), sendo esta representada por cortes axiais de 10 mm de espessura, foi selecionada a região de interesse (ROI) para análise. Tal região foi delimitada 0,4 mm abaixo do limite coronal do defeito (acima da ROI), que corresponde à linha cemento- esmalte; e pelo limite apical (abaixo da ROI), que foi definido por um plano com uma distância de 1 milímetro inferior à altura pré definida do defeito de modo que apenas osso neoformado foi incluído na medição. Os canais radiculares foram utilizados como pontos de referência anatômica para os limites mesial, distal e lingual da ROI. Estes pontos de referência foram usados para desenhar a área do defeito em diferentes profundidades em duas dimensões, que em seguida foram reconstruídos para formar uma imagem tridimensional, que corresponde ao volume de interesse, onde foram avaliados os parâmetros quantitativos citados acima.

- Biópsias e análises histológicas

Aos 60 dias após a cirurgia, os seis animais de seus respectivos grupos, foram sedados e anestesiados como descrito para a realização da cirurgia. Após a indução anestésica, os animais foram eutanasiados utilizando-se sobredose de propofol e, após ausência de reflexo corneal, foi aplicado cloreto de potássio, de acordo com as normas exigidas pela Resolução 714 do CFMV.

Pelo mesmo acesso realizado nas cirurgias anteriores, foram coletados os fragmentos contendo os defeitos, os dentes a eles associados e a gengiva da região vestibular.

Os fragmentos coletados foram fixados em formol e, então, descalcificados em solução de ácido fórmico e citrato de sódio. Em seguida, as amostras foram submetidas a processamento histológico de rotina, sendo desidratadas em soluções crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina. Três seções longitudinais não sequenciais de 5um de espessura, com no mínimo 50um de distância entre si, foram obtidas de cada amostra e coradas em hematoxilina e eosina. As lâminas histológicas foram fotografadas em microscópio ótico nos diversos aumentos e as imagens analisadas em software apropriado.

O material foi analisado qualitativamente. Assim, os tecidos e células presentes em toda a amostra foram caracterizados, atentando-se para a

presença de infiltrado inflamatório e tipo, se existente, se houve formação de osso novo, cemento e ligamento periodontal.

- Análise Estatística

Os níveis de inserção, em milímetros, foram avaliados por teste t pareado. As proporções relativas foram comparadas entre os grupos por Kruskal-Wallis, visto que as observações não apresentaram homogeneidade de variâncias. As variáveis obtidas na análise tomográfica das amostras (BV/TV, Tb.N, Tb.Th e Tb.Sp) foram submetidas ao teste t de Student para comparação das médias. Todos os testes estatísticos foram realizados no programa SigmaPlot 11.0, considerando nível de significância de 5%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Exame Clínico

No pós-operatório, cinco animais do grupo controle apresentaram hemorragia discreta, durante dois dias. Considerando o grupo tratado, apenas um animal apresentou hemorragia também discreta, apenas nos dois primeiros dias de pós-operatório. Apesar da grande vascularização do osso alveolar, ao que se relaciona também a sua grande capacidade de regeneração (Figun & Garino, 1994), a presença de pequena hemorragia nos animais pode ser explicada pela justaposição correta do flap gengival no grupo controle. A presença da membrana no grupo tratado pode ter favorecido a retenção do coagulo, o que pode explicar a ausência de hemorragia em praticamente 100% dos animais do grupo em questão.

Nenhum animal apresentou secreção purulenta ao longo dos sessenta dias. No grupo controle apenas dois animais apresentaram deiscência dos pontos, sendo esta observada, em ambos os animais, no sexto dia de pós- operatório. A cicatrização do flap gengival nos animais ocorreu entre o 7º-10º dia de pós-operatório. A realização do segundo procedimento cirúrgico – profilaxia dental – não permitiu que ocorresse um processo infeccioso no local de implantação do biomaterial que alterasse o resultado final do experimento, explicando assim as variáveis citadas acima.

Já no grupo tratado, três animais apresentaram deiscência no pós- operatório imediato e, consequentemente, exposição da membrana (Figura 5), possivelmente devido á presença da membrana. Ao final das duas semanas de análise clínica, todos os seis animais apresentaram discreta recessão gengival e exposição de membrana. Três animais perderam uma das suas membranas aos 22º, 35º e 40º dia de pós-operatório. A perda do biomaterial nos animais em questão pode ter contribuído para a variação no resultado final do experimento, no qual a presença da membrana não permitiu que maior quantidade de tecido de sustentação se desenvolvesse no local do defeito.

Figura 5: Exposição de membrana (setas azuis) em grupo tratado, com recessão gengival (setas amarelas), avaliada aos 60 dias ápos a colocação da membrana, sobre 3º pré-molar esquerdo (A) e 4º pré-molar direito (B).

Tais sinais são diferentes daqueles encontrados por Reis et al. (2011), no qual foi realizado estudo com membranas compostas por PLGA/fosfato de cálcio. Em tal experimento apenas um animal apresentou exposição de membrana, e a recessão gengival apresentada por alguns animais, foi solucionada após alguns dias. Essas observações podem ser explicadas pela diferença física entre as duas membranas, sendo a utilizada no presente experimento, um biomaterial menos maleável do aquele utilizado por Reis et al. (2011). Kinochita et al. (2010) também não observaram exposição de membrana em estudo realizado com membranas compostas por policaprolactona e fosfato tricálcico. No entanto, Reis et al. (2011) ao utilizar membranas compostas por hidroxiapatita e polihidroxibutirato no tratamento da doença periodontal, apresentou resultado semelhante ao presente estudo,

onde a maioria dos animais apresentaram exposição de membrana, devido possivelmente ás características físicas semelhantes das duas membranas.

A sensibilidade dolorosa apresentada pelos animais de ambos os grupos foi considerada normal, apresentando escore 1, por apenas dois dias após a cirurgia, já que dor é esperada em qualquer procedimento cirúrgico, e escore 0, após tal período. A ausência de dor moderada também pode ser explicada pela aplicação de morfina no pós-operatório imediato.

O nível clínico de inserção foi medido imediatamente pré- regeneração tecidual guiada (RTG) e antes da retirada das amostras, aos 60 dias pós-RTG. Os valores mostraram regressão significativa em ambos os grupos, com p<0,001 para o grupo controle e p=0,002 para o tratado (Figura 6).

Figura 6: Média e desvio-padrão do Nível Clínico de Inserção (mm) dos grupos tratados e controle no pré-RTG (Antes da colocação da membrana) e 60 dias após RTG. Teste t pareado α=0,05; controleμ p<0,001; tratadoμ p=0,002.

Entretanto, a proporção de regressão do nível de inserção até os 60 dias, dada pela razão entre as medidas pré-RTG e 60 dias pós-RTG, não foi diferente entre os grupos ou os dentes analisados (p=0,430) (Tabela 1), o que indica que a membrana pode atuar de forma semelhante ao osso alveolar como um suporte para adesão da gengiva.

Tabela 1. Medianas da proporção de regressão do NCI segundo tratamento e dente analisado. Kruskal-Wallis α=0,05; p=0,430.

Grupo 3º PRÉ-MOLAR 4º PRÉ-MOLAR

Controle 0,417Aa 0,607Aa

Tratado 0,670Aa 0,534Aa

Letra maiúsculas iguais na coluna e minúsculas na linha não diferem entre si.

Radiografias

Os resultados radiológicos da peça dental, tanto do grupo controle quanto do grupo tratado, obtidos imediatamente após o 3º procedimento cirúrgico, revelaram radiopacidade grau 0 nas regiões do defeito, de acordo com a classificação proposta (Figura 7).

Figura 7: Radiografias obtidas imediatamente pós RTG (Regeneração Tecidual Guiada). Visualizar radiopacidade grau 0 comparada ao osso alveolar adjacente (setas azuis) sendo, (A) grupo tratato, e (B) grupo controle.

Nas radiografias de ambos os grupos aos 60 dias, observou-se radiopacidade na região do defeito igual aquela do osso alveolar adjacente, sugestivo de que o defeito estava completamente preenchido por tecido, aparentemente ósseo (Figura 8). Também em ambos os grupos não foi possível observar a presença do espaço do ligamento periodontal nem da lâmina dura. Todas as imagens avaliadas demonstraram um defeito preenchido, com furca exposta, sem presença de bordas.

Figura 8: Radiografias de osso integro (A) obtidas 60 dias pós RTG, nos grupos tratado (B) e controle (C). Observar radiopacidade do defeito semelhante ao osso adjacente tanto no grupo tratado quanto no grupo controle. Observar também a presença de exposição de furca em ambos os grupos (setas amarelas). A seta azul corresponde ao espaço do ligamento periodontal, não observado em enhum dos grupos (asterisco). Seta laranja corresponde ao parafuso de titânio utilizado para fixação da membrana no grupo tratado.

Tomografia microcomputadorizada (microCT)

Os valores obtidos na tomografia microcomputadorizada indicam um menor crescimento ósseo no grupo tratado. Entretanto, apenas BV/TV mostrou diferença estatisticamente significativa, com p=0,042 (Tabela 2). No entanto, o número de trabéculas e a espessura das mesmas foram maiores no grupo controle, e no mesmo grupo, o espaçamento entre trabéculas se mostrou menor. Esses valores não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos analisados (Tabela 2).

Esses resultados demonstram que a membrana não foi capaz de promover a regeneração óssea de forma mais eficiente que no grupo controle após 60 dias. Eles também indicam que a RTG pode ainda ter influenciado negativamente na regeneração, já que a utilização da técnica permitiu que ocorresse recessão gengival, e consequentemente exposição da membrana. Com isso, a região do defeito manteve-se em contato com o biofilme formado,

e portanto, também em contato com as bactérias responsáveis pela doença periodontal, tornando o defeito constantemente contaminado.

Esses efeitos podem ter ocorrido devido à apresentação da membrana utilizada, visto que Reis et al. (2011), com uma formulação diferente foram capazes de demonstrar regeneração óssea por tomografia computadorizada em defeitos semelhantes e ausência de recessão gengival. Iwata et al. (2009), utilizando células derivadas do ligamento periodontal em scaffolds de colageno e hidroxiapatita, apresentou regeneração óssea satisfatória no grupo tratado. O grupo controle apresentaram os mesmos resultados vistos no presente estudo, assim como Kinoshita et al. (2010). Em seu trabalho os autores utilizaram-se de uma membrana composta por policaprolactona e fosfato tricálcico, além da aplicação de fatores de crescimento sobre um dos defeitos analisados.

Tabela 2. Médias, desvios-padrão e valores de p para a comparação estatística das variáveis BV/TV (Porcentagem do volume ósseo no defeito em relação ao volume total do defeito), Tb.N (número de trabéculas), Tb.Th (espessura das trabéculas neoformadas) e Tb.Sp (distância entre as trabéculas).

Parâmetros Amostra íntegra Controle Tratado p*

BV/TV 0,83 0,36±0,08 0,20±0,15 0,042

Tb.N 3,82 1,63±0,91 1,00±0,75 0,215

Tb.Th 0,47 0,26±0,07 0,18±0,07 0,087

Tb.Sp 0,15 1,24±0,72 1,82±0,76 0,207

(* valores de p para comparação entre os grupos controle e tratado)

Verificando-se valores para BV/TV da Tabela 2, pode-se inferir ainda que o coeficiente de variação, dado pela razão entre o desvio-padrão e a média no grupo tratado é 3,5 vezes maior que no grupo controle (respectivamente, 0,748 e 0,213), o que pode ser resultado da influência de fatores individuais, seja na resposta do animal ao tratamento ou em variações técnicas relacionadas à metodologia do implante. A exposição da membrana, como falado anteriormente, também pode explicar a grande diferença no coeficiente de variação vista entre os dois grupos avaliados. Deliberador et al (2006) também observaram variações no resultado do experimento, no qual os

autores consideraram tais alterações uma resposta da variabilidade biológica entre os animais. Essa variabilidade pode ser comportamental, genética, bioquímica ou fisiológica (Selvig, 1994). Além disso, os valores para BV/TV apresentados por ambos os grupos foram bem aquém do obtido na amostra íntegra (0,83). Essa observação deve-se ao fato de que, nesta amostra, toda a área do defeito era preenchida por osso alveolar, enquanto nos dois grupos trabalhados, a maior parte da área de interesse considerada no cálculo desta