O Projeto inicial foi intitulado: “Avaliação de polimorfismos genéticos associados ao metabolismo do ácido fólico e ao desenvolvimento facial em crianças portadoras de fendas orais no estado do RN”. O objetivo principal era avaliar o risco de ocorrência das fendas orais não-sindrômicas em crianças do Estado do Rio Grande do Norte, através do estudo dos polimorfismos das enzimas envolvidas no metabolismo do ácido fólico como MTHFR, MTR, MTRR, RFC1 e TC2, e da correlação dos mesmos com as concentrações de folato, vitamina B12 e homocisteína. Além disso, realizar a pesquisa de novos sítios polimórficos dos genes MSX1, TGF-α, TGF-β3, RARA e BCL3.
Este projeto inicial foi desmembrado em quatro trabalhos, sendo um de doutorado e três de mestrados. O doutorado foi intitulado inicialmente de “Pesquisa de novas mutações nos genes MSX1, BCL-3, TGF- β3 e RARA em pacientes portadores de fendas orais” e os 3 de mestrado: 1- “Estudo de polimorfismos em genes relacionados ao metabolismo do ácido fólico e sua associação com o desenvolvimento de fendas orais não-sindrômicas”, 2- “Avaliação dos genes TGF-alfa e TCN2 em pacientes portadores de fissuras labiopalatinas não sindrômicos”, 3- “Expressão dos genes das enzimas MTHFR, MTR e do transportador de folato RFC-1 em portadores de fendas orais do Rio Grande do Norte”. A intenção era analisar polimorfismos, mutações e expressões de determinados genes (MSX1, BCL-3, TGF- β3, RARA, TGFα, TCN2, MTHFR, MTR, MTRR, RFC1) envolvidos com o surgimento das fendas orais e selecionados a partir da literatura. Adicionalmente, também poderíamos traçar um perfil deste paciente quanto ao gênero, classificação da fenda, naturalidade, história familiar, consumo materno de álcool, cigarro e medicamento durante a gestação. Apesar de nosso foco não ser um estudo epidemiológico, estaríamos contribuindo para um posterior estudo epidemiológico no Estado e na região do Nordeste (Apêndice 1).
O avanço das discussões e estudos propiciou a mudança de foco, ou seja, a pesquisa de polimorfismos (Single Nucleotide Polymorphisms – SNPs) tornou-se a prioridade ao invés de novas mutações. Baseado nos estudos mencionados anteriormente na Introdução, selecionamos o gene MSX1 para a pesquisa de polimorfismos. Assim, um conjunto final de 6 SNPs para o MSX1
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foi escolhido. E o título do doutorado foi alterado para: “Polimorfismos do MSX1 e fenda labio e/ou palatina não-sindrômica”. Diante disso, a análise por SSCP (Single Strand Conformation Polimorphism) foi substituída pela técnica de discriminação alélica. O SSCP é uma técnica de triagem que seria utilizada para a pesquisa de novas mutações. A PCR em Tempo Real através da técnica de discriminação alélica (TaqMan® SNP Genotyping Assays) é um ensaio com alto rendimento, exatidão, precisão, rapidez e um bom custo- benefício, correspondendo as nossas expectativas. Ao iniciar o doutorado, o laboratório também começava a implantar a biologia molecular, nosso grupo de pesquisa estava em constante discussão com o Laboratório de Biologia Molecular Aplicado ao Diagnóstico (USP/SP), além de promovermos seminários e debates nos quais eram discorridos os princípios e a aplicabilidade de técnicas. Dessa forma, a discussão e o intercâmbio de idéias foram necessários para se avaliar as vantagens e desvantagens dos métodos e assim ser traçada uma logística para a consolidação dos estudos. Destaco três grandes desafios para a realização do doutorado: o conhecimento da biologia molecular, visto que, não havia trabalhado nesta área nem na iniciação científica nem no mestrado; padronização das técnicas de biologia molecular ainda inéditas no laboratório e atingir o número de 158 pacientes e 200 controles.
Quanto à contribuição científica, do projeto inicial obteve-se três defesas de mestrado, além de um artigo aceito, um artigo submetido e três em preparação. Além disso, doze resumos de trabalhos publicados em congressos, dentre eles, três prêmios de menção honrosa. Atualmente, um pós- doutorado, dois doutorados e uma iniciação científica estão em andamento. Todos estes trabalhos estão pontuados logo abaixo. Destaca-se também a participação do grupo no Curso de Educação Continuada, com o módulo “Diagnóstico Pré-natal, Abordagem Genética e Bioquímica dos Portadores de Fissuras Labiopalatinas”, promovido pelo Departamento de
Pediatria da UFRN, em Fissuras Labiopalatais.
A nossa publicação contribuiu de forma grandiosa para o entendimento sobre os fatores etiológicos da FL/PNS. Há um esforço mundial na tentativa de elucidar quais são esses fatores, pois, a compreensão dos mecanismos etiológicos poderá contribuir na elaboração de estratégias preventivas de novos
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casos. Os resultados de associação entre os genes candidatos e a FL/PNS são controversos, podendo resultar da variação da contribuição genética na população estudada, variando significativamente a depender da origem étnica e geográfica (67-70), o que revela a importância deste estudo inédito em nossa região. Ressaltamos também a contribuição para a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, com implantação de técnicas, expansão da biologia molecular e o ganho de aparelhos de tecnologia de ponta disponíveis para estudos diversos.
O doutorado resultou em um aprofundamento científico e intelectual construído sob vários pilares: o aprendizado de técnicas, desde a extração do DNA até o estudo e a aplicação de vários métodos (SSCP, RFLP, discriminação alélica por TaqMan, HRM); o estudo em disciplinas como Bioética, Elaboração de artigos científicos, entre outras que nos proporcionou um amadurecimento científico e a discussão de artigos no nosso grupo de pesquisa. Destaco o amadurecimento pessoal, resultado da convivência com os pacientes fissurados e suas mães, com os profissionais do HOSPED e com toda a equipe do LABMULT.
Substituímos técnicas, selecionamos e delimitamos os genes. Contudo, todas as metas foram alcançadas devido ao comprometimento e dedicação dos alunos de iniciação científica, mestrandos e doutorandos integrantes do LABMULT/LABIOMOL da UFRN e do LABMAD (Laboratório de Biologia Molecular Aplicado ao Diagnóstico) da USP/SP. As constantes discussões e trocas de experiência, entre esses dois grupos de pesquisa, resultaram no êxito desse Projeto. Nossa perspectiva, quanto ao projeto, é continuar o estudo do gene MSX1 em pacientes com fendas orais não-sindrômicas, investigando a associação com novas variantes através da triagem por HRM e confirmação por sequenciamento (Apêndice 2). Além disso, com a recente aquisição da Plataforma Affymetrix pela UFRN sediada no LABMULT/LABIOMOL, iniciou-se o estudo com a tecnologia de microarrays que contempla um pós-doutorado já em andamento e diante disso, podemos estabelecer novos objetivos com o estudo de outros genes e polimorfismos envolvidos com as fendas orais. Quanto à graduação, pretendo lecionar, orientar bolsistas de iniciação científica, orientar trabalhos de conclusão de curso, bem como coordenar e/ou participar de projetos de pesquisa ou de extensão com aprovação e/ou
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financiamento por órgãos de fomento. Em relação à pós-graduação, iniciei atividades de docência, orientação e coordenação na Pós-graduação em Hematologia da Faculdade de Excelência Educacional do Rio Grande do Norte – FATERN/ESTÁCIO DE SÁ, com a experiência adquirida posso desenvolver co-orientações de mestrado junto a minha orientadora. Dessa maneira, pretendo fazer o estágio post-doctoral no Brasil ou no exterior e concorrer ao ingresso em uma instituição de ensino superior federal como professora universitária. Em consequência, poderá ser constituída uma Base de Pesquisa que englobe a Biologia Molecular e as Análises Clínicas.
Segue a Produção técnico-científica que foi gerada pelo Projeto de Pesquisa:
- Lista de publicações
- Participação em congressos e premiações
1- Bessa, AB, Bezerra, JF, Cardoso, ML, Oliveira, SR, Rezende, AA, Jatoba, CA. Estudo Epidemiológico da ocorrência de fendas orais em crianças atendidas no Hospital de Pediatria/UFRN. XIX Congresso de Iniciação
Cientifica da UFRN - Pesquisa e diversidade, 2008, Natal-RN.
2- Soares, CD, Bezerra, JF, Oliveira, GHM, Cardoso, ML, Ururahy, MAG, Freire Neto, FP, Silva, HPV, Souza, KSC, Oliveira, SR, Lima Neto, LG, Fajardo, CM, Almeida, MG, Hirata, RDC, Hirata, MH, Rezende, AA. Frequência do polimorfismo C677T da MTHFR em pacientes portadores de fendas orais no RN. I Simpósio Nacional em Ciências Farmacêuticas
Básicas e Aplicadas, 27 novembro de 2009. Promoção: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas- PPgCF / Centro de Ciências da Saúde/UFRN.
3- Bezerra, JF, Cardoso, ML, Oliveira, GHM, Soares, CD, Oliveira, SR, Luchessi, AD, Lima Neto, LG, Hirata, MH, Hirata, RDC, Almeida, MG, Rezende, AA. Study of polymorphisms C677T and A1298C Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) in patients with
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nonsyndromic oral clefts. XXXIX Annual Meeting of SBBQ, 2010, Foz do Iguaçu - PR.
4- Bezerra, JF, Cardoso, ML, Oliveira, GHM, Soares, CD, Ururahy MAG, Oliveira RS, Luchessi AD, Hirata RDC, Almeida MG, Hirata MH, Rezende AA. Estudo de polimorfismos relacionados ao metabolismo do acido fólico em pacientes portadores de fendas orais não sindrômica. II SIMPOSIO
INTERNACIONAL DE GENETICA CLINICA DA UFRN, 08-09 de novembro
de 2010. Promoção: Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Ferreira
Bezerra-HOSPED e Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas- PPgCF / Centro de Ciências da Saúde/UFRN.Menção Honrosa.
5- Cardoso, ML, Bezerra, JF, Oliveira, GHM, Soares, CD, Souza KS, Oliveira
RS, Silbiger, VN, Luchessi AD, Hirata RDC, Almeida MG, Hirata MH, Rezende AA. Lack of association of MSX1 polymorphism and non-sindromic cleft lip and palate. INTERNATIONAL WORKSHOP ON GENOMICS OF
HEALTH AND DISEASES. March 12-15, 2011, Natal-RN, Brasil. Promoção: Sociedade Brasileira de Genética.
6- Oliveira, GHM, Cardoso, ML, Bezerra, JF, Soares, CD, Souza KS, Oliveira RS, Silbiger, VN, Luchessi AD, Hirata RDC, Almeida MG, Hirata MH, Rezende AA. No association between C766G polymorphism on the TCN2 on non-sindromic cleft lip and palate. AA. INTERNATIONAL WORKSHOP
ON GENOMICS OF HEALTH AND DISEASES. March 12-15, 2011, Natal-
RN, Brasil. Promoção: Sociedade Brasileira de Genética.
7- Soares, CD, Oliveira, GHM, Cardoso, ML, Bezerra, JF, Souza KS, Silva HPV, Oliveira RS, Luchessi AD, Hirata RDC, Almeida MG, Rezende, Hirata MH. Analise de variantes alélicas do gene TGFalfa em pacientes com fendas orais. III SIMPOSIO INTERNACIONAL DE GENETICA CLINICA DA
UFRN, 19-21 outubro de 2011, Natal- RN, Brasil. Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Ferreira Bezerra-HOSPED / Centro de Ciências da Saúde / UFRN Menção Honrosa.
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8- Oliveira, GHM, Cardoso, ML, Bezerra, JF, Soares, CD, Silva HPV, Oliveira RS, Silbiger, VN, Luchessi AD, Oliveira AML, Barbosa ACS, Farjado CM, Hirata RDC, Almeida MG, Rezende AA, Hirata MH. Study of Taq-TGFa polymorphism in nonsyndromic cleft lip and or palate. II Internacional
Symposium of Phamaceutical Sciences, 3-5 November 2011. Promoção: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas- PPgCF / Centro de Ciências da Saúde/UFRN.
9- Soares, CD, Oliveira, GHM, Cardoso, ML, Bezerra, JF, Souza Santos FM, Souza KS, Morais LVF, Silva HPV, Oliveira RS, Farjado CM, Silbiger, VN, Luchessi AD, Oliveira AML, Barbosa ACS, Hirata RDC, Almeida MG, Rezende AA, Hirata MH. Expression study of genes involved on folic acid metabolism in association with oral cleft development. II Internacional
Symposium of Phamaceutical Sciences, 3-5 November 37 2011. Promoção: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas- PPgCF / Centro de Ciências da Saúde/UFRN. Honorable mention.
10- G. G. H. Oliveira, A. A. Rezende, M. L. Cardoso, J. F. Bezerra, C. D. Soares, R. D. C. Hirata, S. R. Oliveira, V. Silbiger, A. D. Luchessi, C. M. Fajardo, K. S. C. Souza, H. P. V. Silva, M. G. Almeida, M. H. Hirata. Association between TGF-α and MSX-1 polymorphisms and presence of non-syndromic cleft lip and/or palate. American Association for Clinical
Chemistry (AACC) Annual Meeting 2012, Los Angeles, CA, July 15 - 19,
2012.
11- Down regulated folate metabolism genes in individuals represents a higher risk of oral clefts. 12th International Congress on Cleft Lip/Palate and
Related Craniofacial Anomalies, to be held May 5-10, 2013 at the Hilton
Orlando Lake Buena Vista, Florida, USA. (Aceito)
12- MTHFR, MTR, MTRR and RFC1 polymorphisms and the susceptibility to nonsyndromic cleft lip ⁄ palate in patients of Rio Grande do Norte, Brazil.
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Craniofacial Anomalies, to be held May 5-10, 2013 at the Hilton Orlando
Lake Buena Vista, Florida, USA. (Aceito)
- Dissertações defendidas
1. João Felipe Bezerra, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. PPgCF / UFRN. 23 de fevereiro de 2010. Estudo de polimorfismos em genes relacionados ao metabolismo do ácido fólico e sua associação com o desenvolvimento de fendas orais não-sindrômicas.
2- Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. PPgCF / UFRN. 26 de janeiro de 2012. Estudo de novas mutações e polimorfismos nos genes TGFΑ e TCN2 em pacientes com fendas orais.
3 - Clélio Diogo Soares, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas .PPgCF/UFRN. 06 de setembro de 2012. Estudo da expressão dos genes do metabolismo do acido fólico e associação com o desenvolvimento de fendas orais.
- Iniciação Científica em andamento
1. Anne Caroline Silva Barbosa, Graduação em Farmácia/UFRN. Estudo de Polimorfismo do gene TCN2 em pacientes portadores de Fendas Orais Não Sindrômicas no Estado do Rio Grande do Norte.
- Doutorados em andamento
1. João Felipe Bezerra, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. PPGCSa / UFRN. Pesquisa de novas mutações nos genes RARA e BCL3 em pacientes portadores de fendas orais.
2. Gustavo Henrique de Medeiros Oliveira, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. PPGCSa / UFRN. Pesquisa de novas mutações e análise haplotípica nos genes TGFα e TGFβ3 em pacientes com fendas orais.
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- Pós-Doutorado em andamento
1. André Ducati Luchessi, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. PPgCF/UFRN – PNPD-CAPES. Estudo genético em pacientes com fendas lábias e/ou palatais e de fatores de risco associados: ações preventivas à população do estado do Rio Grande do Norte.
- Lista de trabalhos submetidos e em preparação - Artigo submetido
Expression study of the genes involved on folic acid metabolism in association with oral clefts development.
Clélio Diogo Soaresa, Gustavo Henrique M Oliveiraa, Maria Leila Cardosoa, João Felipe Bezerraa, Sandra R Oliveirab, Karla Simone C de Souzaa, Heglayne Pereira V da Silvaa, Vivian N Silbigera, Andre Ducati Luchessic, Cristina Moreno Fajardoc, Rosario DC Hiratac, Maria das Graças Almeidaa, Mario H Hiratac, Adriana A Rezendea*
aDepartment of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
bCare program to children with Cleft Lip and Palate, Pediatrics Hospital Professor Heriberto Bezerra, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
cDepartment of Clinical and Toxicological Analyses, School of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brazil.
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- Artigos em preparação
1 - Polymorphisms in folate pathway and their implications in the development of oral clefts.
João Felipe Bezerraa, Adriana Augusto de Rezendea, Gustavo Henrique M Oliveiraa, Clélio Diogo Soaresa, Maria Leila Cardosoa, Marcela Abbott G
Ururahya, Francisco Paulo F Netoa, Lidio Gonçalves Netob, Andre Ducati Luchessia; Vivian N Silbigera, Cristina Moreno Fajardob, Sandra Regina de Oliveirac, Rosario Dominguez C Hiratab, Maria das Graças Almeidaa, Mario Hiroyuki Hiratab.
a Department of Clinical and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmacy, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
b Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo, SP, Brazil.
c Care Program to children with Cleft lip and Palate, Pediatrics Hospital Professor Heriberto Ferreira Bezerra, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2 - Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternative tool to
screen for SNPs associated with Oral Cleft in TGFα.
Gustavo Henrique M Oliveiraa, Adriana A Rezendea, Maria Leila Cardosoa, João Felipe Bezerraa, Clélio Diogo Soaresa, Sandra R Oliveirab, Karla Simone C de Souzaa, Heglayne Pereira V da Silvaa, Vivian N Silbigera, Andre Ducati Luchessic, Cristina Moreno Fajardoc, Rosario DC Hiratac, Maria das Graças Almeidaa , Mario H Hiratac*
a Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
b Care program to children with Cleft Lip and Palate, Pediatrics Hospital Professor Heriberto Bezerra, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
c Department of Clinical and Toxicological Analyses, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
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3 - Estudo de Polimorfismo do gene TCN2 em pacientes portadores de Fendas Orais Não Sindrômicas no Estado do Rio Grande do Norte.
Anne Caroline Silva Barbosaa, Gustavo Henrique M Oliveirab, Maria Leila
Cardosob, João Felipe Bezerrab, Clélio Diogo Soaresc, Sandra R Oliveirad, Karla Simone C de Souzac, Heglayne Pereira V da Silvac, Vivian N Silbigere, Andre Ducati Luchessif, Rosario DC Hiratag, Maria das Graças Almeidae, Mario H Hiratag, Adriana A Rezendee*.
aAcadêmico de Farmácia da UFRN
bAluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, UFRN
cAluno de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, UFRN
d Fonoaudióloga, Hospital de Pediatria Professor Heriberto Bezerra, UFRN eProfessor, Doutor, Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, UFRN fAluno de Pós-Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, UFRN
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