Ġktisadi Islahat

Os reveladores utilizados foram luz UV a 254 e 366 nm (método físico), sulfato cérico e anisaldeído sulfúrico seguidos de aquecimento, KOH-5% em etanol, reagente Natural Products, Dragendorff, reagente de ninidrina, p-nitroanilina diazotada (métodos químicos). Os reagentes foram preparados conforme descrito por Wagner e Zgainski, 1984; Miller, Smith¸1973 e Majak, Bose, 1974.

Cromatografia em coluna

Sephadex LH-20

Neste trabalho, utilizou-se metanol como fase móvel. As amostras foram submetidas a um “clean-up”, o qual consiste na sua solubilização em 10 ml de metanol, e posterior centrifugação a 3000 rpm, por 20 min, sendo o sobrenadante eluído na coluna.

Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG-EM)

Esta técnica foi empregada na tentativa de identificação estrutural de substâncias presentes nos extratos das lavagens foliares e nas frações hexânicas, baseado na comparação dos espectros de massas das bibliotecas Willey 7.0, NIST e padrões do laboratório. Nas análises de esteroides e triterpenos, foram também utilizados o tempo de retenção de padrões do laboratório relativo ao 5-α-colestano. Foram obtidos osíndices de retenção de Kovats (IK), sendo que para a determinação dos IK foi necessária a injeção de hidrocarbonetos n-alcanos (C9-C42). Também foi empregada na avaliação da presença de alcaloides poli-hidroxilados em

I. chiliantha, cuja técnica está descrita no item 3.3.7, página 30.

Condições de análise CG 1:

Foi realizada em um sistema operando em impacto eletrônico (70 eV) equipado com injetor split (250 oC) e com proporção slipt 1/40. A coluna utilizada foi do tipo sílica fundida com fase estacionária DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), utilizando hélio como gás carreador. O fluxo na coluna foi 1,10 ml/min., pressão de 81,5 kPa e aquecimento com a programação de temperatura de de 100 ºC a 290 ºC a 3 ºC/min.; 290 ºC por 20,0 min.

Condições de análise CG 2:

Foi realizada em um sistema operando em impacto eletrônico (70 eV) equipado com injetor split (250 oC) e com proporção slipt 1/20. A coluna utilizada foi do tipo sílica fundida com fase estacionária DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), utilizando hélio como gás carreador. O fluxo na coluna foi 1,03 ml/min., pressão de 114,8 kPa e aquecimento com a programação de temperatura de 200ºC por 12,0 min., de 200 ºC a 290 ºC a 10 ºC/min.; e 290 ºC por 30,0 min.

Condições de análise CG 3:

Foi realizada em um sistema operando em impacto eletrônico (70 eV) equipado com injetor split (250 oC) e com proporção slipt 1/10. A coluna utilizada foi do tipo sílica fundida com fase estacionária DB-1 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m), utilizando hélio como gás carreador. O fluxo na coluna foi 1,00 ml/min., pressão de 96,1 kPa e aquecimento com a programação de temperatura de 160°C por 2,0 min., de 160 °C a 240 °C a 5 °C/min.; 240 °C por 15,0 min.; de 240 °C a 300 °C a 10 °C/min.; e 300 °C por 10,0 min.

Cromatografia líquida de alta eficiência – UV (DAD)

Esta técnica foi empregada na avaliação química de extratos etanólicos brutos, e frações provenientes de partições ou de fracionamento em colunas, frente a constituintes químicos que absorvem na região do UV. A partir destas análises tornou-se possível averiguar alguns tipos de esqueletos presentes, tais como flavonoides e derivados fenilpropanoides, e selecionar frações de menor complexidade para posterior separação em CLAE-semi- preparativo ou até mesmo para análises por RMN de 1H, para a identificação estrutural.

Nas análises comparativas, foram utilizadas colunas analíticas C-18 (Shimadzu), e gradientes de MeOH: H2O e MeOH-1% ácido acético: H2O-1% ácido acético; MeCN: H2O.

Nas análises semi-preparativas, foi utilizada coluna semi-preparativa C-18 (Shimadzu), e gradientes de MeOH-0,03 % TFA: H2O-0,03 % TFA; MeOH: H2O e MeCN: H2O.

Condições de análise CLAE 1:

Utilizou-se coluna analítica ODS (4,6 mm x 250 mm d.i., 5 m, Shimadzu), fluxo 0,8 ml/min.; FM (A) H2O-TFA (0,03%): (B) MeOH-TFA (0,03%) em gradiente (0,01 a 40,0 min

– 35% a 50% de B; 40,0 min a 45,0 min – 50% a 100% de B; 45,0 a 50,0 min – 100% de B; 50,0 a 53,0 min – 100% a 35% de B; 53,0 a 60,0 min – 35% de B).

Condições de análise CLAE 2:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 8,0 ml/min. FM: MeOH em sistema de eluição isocrática.

Condições de análise CLAE 3:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 8,0 ml/min. FM (A) H2O-TFA (0,03%): (B) MeOH-TFA (0,03%) em gradiente (0,01 a 80 min. –

35% a 50% de B; 80 min. a 90 min. – 50% a 100% de B; 90 min. a 100 min. – 100% de B; 100 min a 106 min. – 100% a 35% de B; 106 min. a 120 min. – 35% de B.

Condições de análise CLAE 4:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 8,0 ml/min. FM (A) H2O-TFA (0,03%): (B) MeOH-TFA (0,03%) em gradiente (0,01 a 30

min. – 50% a 60,7% de B; 30 min. a 35 min. – 60,7% a 100% de B.

Condições de análise CLAE 5:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 8,0 ml/min. FM (A) H2O (B) MeOH em gradiente (0,01 a 80 min. – 30% a 60% de B; 80 min. a

90 min. – 60% a 100% de B; 90 min. a 100 min. – 100% a 30% de B; 100 min. a 110 min. – 30% de B.

Condições de análise CLAE 6:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 9,0 ml/min. FM (A) H2O (B) MeCN em gradiente (0,01 a 90 min. – 25% a 100% de B; 90 min. a

110 min. – 100% de B; 110 min. a 116 min. – 100% a 25% de B; 116 min. a 130 min. – 25% de B.

Condições de análise CLAE 7:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 8,0 ml/min. FM (A) H2O (B) MeOH em gradiente (0,01 a 45 min. – 35% a 65% de B; 45 min. a

Condições de análise CLAE 8:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS Shimadzu (20 x 250 mm, 5 m), fluxo 9,0 ml/min. FM (A) H2O (B) MeCN em gradiente (0,01 a 20 min. – 20% de B; 20 min. a 25 min.

– 20% a 100% de B; 25 min a 35 min – 100% de B.

Condições de análise CLAE 9:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS (20 x 250 mm), fluxo 8,0 ml/min.; FM (A) H2O-TFA (0,03%): (B) MeOH-TFA (0,03%) em gradiente (0,01 a 80,0 min – 25% a 50% de

B; 80,0 min a 90,0 min – 50% a 100% de B; 90,0 a 100,0 min – 100% de B; 100,0 a 106,0 min – 100% a 25% de B; 106,0 a 120,0 min – 25% de B).

Condições de análise CLAE 10:

Utilizou-se coluna semi-preparativa ODS (20 x 250 mm), fluxo 8 ml/min. FM (A) H2O

(B) MeOH em gradiente (0,01 a 100 min – 35% a 100% de B; 110 min a 114 min – 100% a 35% de B; 114 min a 120 min – 35% de B.

Espectrometria de Massas – Ionização por “Electrospray”

Utilizou-se esta técnica como auxílio na identificação de algumas substâncias. Foi realizada injeção direta no aparelho, após a solubilização da amostra em MeOH: H2O, seguido

de filtragem em membrana Millipore (0,45 µm).

Condições de análise: Utilizou-se bomba de infusão, fluxo 300 µl/h, e o modo de detecção negativo e positivo, dependendo das características químicas da amostra. O aparelho é de alta resolução, necessitando de calibração interna e externa antes de realizar as análises. Usou-se para calibração interna uma solução de Na-TFA a 10 mg/ml e na calibração externa uma solução de formiato de sódio, a 10 mM.