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A mutação C1042T (Q348X) foi confirmada pela técnica de PCR-Tsp45I-RFLP. A enzima Tsp45I reconhece a seqüência GTCAC no alelo KEL selvagem, mas não a seqüência GTCAT no alelo KELnull com a mutação C1042T. As pacientes MCPS de Manaus-AM e CMS de Vila Velha-ES apresentaram apenas a banda de 310 pb, padrão homozigoto para a mutação C1042T. A irmã e o filho da paciente CMS de Vila Velha- ES apresentaram o padrão heterozigoto com a presença das bandas de 90, 220 e 310 pb, enquanto as quatro netas desta paciente apresentaram o padrão homozigoto para o alelo selvagem com as bandas de 90 e 220 pb (Figura 20).

Figura 20. Foto da eletroforese em gel de agarose 2%, coloração de Gelred, da pesquisa da mutação C1042T pela técnica de PCR-Tsp45I-RFLP. A coluna 1 apresenta o marcador de 100 pb. Coluna 2: produto de PCR sem digestão, banda de 310 pb. Colunas 3 e 4: pacientes MCPS de Manaus-AM e CMS de Vila Velha-ES apresentando apenas a banda de 310 pb, padrão homozigoto para a mutação C1042T. Colunas 5 e 6: irmã e filho da paciente CMS de Vila Velha-ES apresentando o padrão heterozigoto, bandas de 90, 220 e 310 pb. Colunas 7-10: quatro netas da paciente CMS de Vila Velha-ES, apresentando o padrão homozigoto KEL selvagem, bandas de 90 e 220 pb.

5.6. Identificação da mutação IVS6-13C>T responsável pelo padrão anômalo observado na genotipagem KEL*3,4 pela técnica de PCR-NlaIII-RFLP.

Três indivíduos, um do grupo negróide (N12, Tabela 9) do estudo piloto e dois do grupo de doadores de sangue (D204 e D205, Tabela 21), apresentaram um padrão anômalo no resultado da genotipagem do polimorfismo KEL*3,4 pela técnica de PCR- NlaIII-RFLP. A Figura 21 apresenta a foto da eletroforese do polimorfismo KEL3,4 com os padrões clássicos dos genótipos KEL*3/KEL*4 (bandas de 266, 184, 112, 82 e 42 pb) e KEL*4/KEL*4 (bandas de 266, 112 e 42 pb), e o padrão anômalo com as bandas de 266, 154, 112 e 42 pb observado nos três indivíduos. A técnica sorológica revelou que as hemácias expressavam o seguinte fenótipo KEL:-1,2,-3,4,7 [K-,k+, Kp(a-b+), Js(b+)]. A reação de seqüenciamento do produto do PCR (fragmento de 420 pb) mostrou que os dois alelos eram KEL*4, em concordância com a fenotipagem, mas um dos alelos KEL*4 apresentava uma mutação C>T no intron 6, nucleotídeo -13 (upstream exon 7), que denominamos IVS6-13C>T (Figura 22). A Figura 23 apresenta o padrão normal, observado no seqüenciamento da mesma região, no alelo selvagem sem a mutação IVS6-13C>T.

Figura 21. Foto da eletroforese em gel de agarose 2%, coloração de Gelred, do polimorfismo KEL3,4, produto da PCR e digestão com NlaIII. As colunas 1 e 6 mostram marcadores de 100 pb e 50 pb, respectivamente. A coluna 2 mostra o produto de PCR, sem digestão, com 420 pb. A coluna 3 apresenta o padrão do genótipo KEL*4/KEL*4 com as bandas de 266, 112 e 42 pb. A coluna 4 apresenta o padrão de genótipo KEL*3/KEL*4 com as bandas de 266, 184, 112, 82 e 42 pb. A coluna 5 apresenta um padrão anômalo com as bandas de 266, 154, 112 e 42 pb.

Figura 22. Eletroferograma da reação de seqüenciamento da região final do intron 6 mostrando a mutação C>T (nt-13 upstream exon 7), em heterozigose, em um dos alelos KEL*4. Y pode ser C ou T. O alelo selvagem apresenta a seqüência CATG, enquanto o alelo mutante apresenta a seqüência TATG.

Figura 23. Eletroferograma da reação de seqüenciamento da região final do intron 6 mostrando a seqüência selvagem CATG no alelo KEL*4 sem a mutação IVS6-13C>T.

O Quadro 9 mostra a seqüência dos 420 nucleotídeos amplificados pela técnica de PCR. Uma vez que a mutação IVS6-13C>T está numa região não codificadora, ela provavelmente não interfere na proteína Kell e na expressão dos antígenos Kell. Por outro lado, a mutação IVS6-13C>T abole o primeiro sítio de ação da enzima NlaIII, o qual serve como controle da digestão do fragmento de 420 pb, interferindo com o padrão esperado na genotipagem do polimorfismo KEL*3,4 pela técnica de PCR-NlaIII- RFLP, pois a nova seqüência TATG (ao invés de CATG), não sofre ação da enzima e modifica o padrão final do produto da digestão. Desta maneira, após a digestão do fragmento de 420 pb com a enzima NlaIII, o alelo KEL*4 com a mutação IVS6-13C>T apresenta as bandas 154 e 266 pb, enquanto o alelo KEL*4 selvagem apresenta as bandas 42, 112 e 266 pb. Caso a mesma mutação, IVS6-13C>T, fosse encontrada no alelo KEL*3, os produtos da digestão com a enzima NlaIII seriam de 184, 154 e 82 pb, em contraste com o alelo KEL*3 selvagem: bandas 184, 82, 112 e 42 pb.

Quadro 9. Seqüência dos 420 nucleotídeos amplificados pela reação de PCR na genotipagem do polimorfismo KEL*3,4 pela técnica de PCR-NlaIII-RFLP, detalhando os sítios de ação da enzima NlaIII.

ATATTCCCCACCTCCCCACACCTGCCCTCTCCATCCGCYATGCTCCCTGCTTCTCTCCAGTCT

CTCTTGTGCCCAGATAGACCAGCCAGAGTTTGATGTTCCCCTCAAGCAAGATCAAGAACAGA AGATCTATGCCCAGGTAAGATGGCACATGGACAAAGGCCCTGCCCTCTGAGGCCAGGAGA

AAAGCAGGGACCTCTGGCACCTGTGACTGACATTTCCTTCCTCCAGATCTTTCGGGAATACC

TGACTTACCTGAATCAGCTGGGAACCTTGCTGGGAGGAGACCCAAGCAAGGTGCAAGAACA CTCTTCCTTGTCAATCTCCATCACTTCACGGCTGTTCCAGTTTCTGAGGCCCCTGGAGCAGC GGCGGGCACAGGGCAAGCTCTTCCAGATGGTCACTATCGACCAGCTCAAG

Regiões dos primers: extremidades sublinhadas; Seqüência de nucleotídeos em azul: exon 7; Seqüência de nucleotídeos em vermelho: exon 8;

YATG: sítio de ação da enzima NlaIII localizado na região do intron 6; Y pode ser C no alelo selvagem ou Tno alelo com a mutação IVS6-13C>T;

CATG: sítio de ação da enzima NlaIII localizado no exon 7;

CACG: seqüência do exon 8 responsável pelo polimorfismo KEL*3,4. O alelo KEL*4, com a seqüência CACG, não sofre ação da enzima NlaIII. O alelo KEL*3, com o polimorfismo C961T, tem a seqüência CACG modificada para CATG, introduzindo um novo sítio de ação da enzima NlaIII.

O sistema de grupo sangüíneo Kell se distingue pela sua complexidade, sendo o terceiro mais polimórfico entre os 29 sistemas de antígenos eritrocitários humano, ficando atrás apenas dos grupos sangüíneos Rh e MNSs (Lee, 2007). Atualmente, o sistema Kell é composto por 28 antígenos reconhecidos pela ISBT - Sociedade Internacional de Transfusão de Sangue (ISBT). Além destes, dois novos antígenos foram identificados recentemente e aguardam nomenclatura definitiva e reconhecimento da ISBT (Velliquette et al., 2007). Os antígenos do sistema Kell podem ser divididos em antígenos de alta e baixa freqüência populacional. Os antígenos de baixa freqüência decorrem de SNPs nos exons KEL e alguns deles apresentam especificidade étnica ou racial. Exemplos proeminentes são os antígenos KEL1, presente em 9% da população caucasóide e em 2% da população negróide, e KEL6, que é expresso em 19,5% dos indivíduos negróides e em menos de 0,01% dos caucasóides (Westhoff, Reid, 2004; Lee, 2007). Os antígenos Kell são importantes na medicina transfusional por apresentarem alta capacidade imunogênica. Aloanticorpos contra antígenos Kell podem causar tanto reações transfusionais graves, em casos de transfusões incompatíveis, quanto anemia fetal em gestações com incompatibilidade materno-fetal. A maioria destes aloanticorpos é direcionada contra o antígeno KEL1, mas aloanticorpos contra outros antígenos Kell de baixa freqüência também têm sido reportados (Rosse et al., 1990; Vichinsky et al., 1990; Vichinsky et al., 2001; Aygun et al., 2002; Castro et al., 2002).

As bases moleculares do sistema Kell têm sido elucidadas desde que a organização do gene KEL foi descrita em 1995 (Lee et al., 1995c). Até o momento, todos os polimorfismos KEL já foram elucidados, exceto para os antígenos KEL5, KEL16 e KEL20 (Lee, 2007). Este conhecimento permitiu o desenvolvimento de métodos de biologia molecular úteis na identificação dos polimorfismos KEL. As técnicas moleculares têm sido usadas na medicina transfusional como uma ferramenta laboratorial alternativa aos métodos sorológicos em diferentes situações, incluindo a abordagem de pacientes que receberam transfusão recente ou quando as hemácias do paciente ou os reagentes comerciais são escassos ou não são disponíveis como, por exemplo, os anti-soros anti-Jsa e anti-Jsb (Reid, 2007).

Neste estudo, usamos a técnica de PCR-RFLP para determinar a freqüência de diferentes genótipos KEL em indivíduos brasileiros. Inicialmente, realizamos um estudo piloto em grupos de diferentes origens étnicas: caucasóide, negróide, oriental e ameríndio. Esta etapa inicial foi importante tanto na padronização e validação das

técnicas de PCR-RFLP, como na definição do foco principal do estudo. A técnica de genotipagem do polimorfismo KEL*1,2 por PCR-BsmI-RFLP foi validada pela fenotipagem KEL1 (K) e KEL2 (k) em amostras de 33 indivíduos dos grupos caucasóides, negróide e oriental, tendo sido observado 100% de concordância entre as duas técnicas. A técnica de genotipagem do polimorfismo KEL*3,4 por PCR-NlaIII- RFLP foi validada pela fenotipagem KEL3 (Kpa) e KEL4 (Kpb) em 32 amostras de indivíduos pertencentes aos grupos caucasóides, negróide e oriental, e também foi observado 100% de concordância entre as duas técnicas. A técnica de PCR-PvuII- RFLP empregada na detecção do polimorfismo KEL*21 não pode ser validada devido a indisponibilidade do reagente comercial, o anti-soro anti-Kpc. Da mesma maneira, devido à indisponibilidade comercial dos anti-soros anti-Jsa e anti-Jsb, a genotipagem do polimorfismo KEL*6,7 não foi validada no nosso laboratório, mas duas amostras de indivíduos KEL*6/KEL*6 e KEL*7/KEL*7 foram fenotipadas, respectivamente, como Js(a+b-) e Js(a-b+) pela ASEM-NPBI, São Paulo, SP, Brasil.

Os resultados do estudo piloto, apesar do tamanho limitado da amostragem populacional, mostraram um padrão monótono dos polimorfismos KEL*1,2, KEL*3,4,21 e KEL*6,7 nos grupos oriental e ameríndio, sendo 100% dos indivíduos homozigotos para os alelos selvagens KEL*2, KEL*4 e KEL*7 nestes dois grupos. Por outro lado, os resultados das freqüências dos genótipos KEL*1/KEL*2, KEL*3/KEL*4 e KEL*6/KEL*7 observados nos grupos de caucasóides e negróides foram semelhantes aos dados conhecidos na literatura (Lee, 2000a). Desta maneira, optamos por concentrarmos nossos esforços no estudo da freqüência dos polimorfismos KEL*1,2, KEL*3,4,21 e KEL*6,7 em pacientes com hemoglobinopatias, principalmente portadores de doenças falciformes, e doadores de sangue.

Sabidamente, os pacientes portadores de hemoglobinopatias, crianças e adultos, freqüentemente necessitam de transfusões de sangue no manejo de complicações clínicas como anemia, síndrome torácica aguda, acidente vascular cerebral isquêmico e seqüestração esplênica. Muitos destes pacientes acabam desenvolvendo anticorpos principalmente contra antígenos eritrocitários de baixa freqüência populacional (Aygun et al., 2002; Castro et al., 2002; Afenyi-Annan et al., 2007). O risco de produção de anticorpos eritrocitários depende de diversos fatores: doença de base, predisposição genética, capacidade de resposta imunológica, intensidade e duração da exposição ao antígeno, e incompatibilidade entre doador e

receptor (Eder, Chambers, 2007). A incidência da aloimunização, apesar da etiologia multifatorial, é particularmente alta em pacientes falciformes quando comparada com outras populações de pacientes politransfundidos, primariamente por causa da disparidade da distribuição do padrão fenotípico, o qual é parcialmente influenciado pelas diferenças étnicas entre a população de doadores de sangue e a população de pacientes portadora de doenças falciformes (Spanos et al, 1990; Issitt, 1994; Vichinsky et al., 2001).

A taxa global de aloimunização eritrocitária pode alcançar até cerca de 40% dos pacientes portadores de doenças falciformes que receberam transfusão em estudos realizados na América do Norte (Patten et al., 1989; Aygun et al., 2002; Castro et al., 2002). Os aloanticorpos contra antígenos Kell, especialmente anti-KEL1, têm sido observados como um dos mais freqüentes anticorpos em diferentes séries estudando pacientes falciformes politransfundidos. A Tabela 19 resume os resultados dos principais estudos dos últimos 30 anos analisando as taxas de aloimunização global e aloimunização anti-Kell. Dentre estes estudos, destacamos a seguir os mais recentes: Aygun et al., em 2002, relataram uma taxa de aloimunização global de 29% (23/78) nas crianças e 47% (29/62) nos adultos com doenças falciformes. Todos estes pacientes, crianças e adultos, tinham aloanticorpos contra antígenos dos sistemas RH e/ou Kell, isoladamente ou em associação com outros anticorpos de diversos sistemas. Entre os pacientes transfundidos, os anticorpos anti-KEL1 e/ou anti-KEL7 foram detectados em 78% (18/23) das crianças e em 75,8% dos adultos. Castro et al. (2002), em um período de 12 anos de estudo, reportaram uma taxa global de aloimunização eritrocitária de 39% (137/351) entre os pacientes falciformes adultos que haviam recebido transfusão. Neste estudo, o aloanticorpo anti-KEL1 foi observado em 38% (52/137) dos pacientes aloimunizados, sendo o segundo mais freqüente, atrás apenas do anticorpo anti-E. Outros aloanticorpos anti-Kell também foram detectados. Entre os 137 pacientes imunizados, os aloanticorpos anti-KEL6 (anti-Jsa), anti-KEL7 (anti-Jsb) e anti-KEL3 (anti- Kpa) foram detectados em 5,8%, 0,7% e 0,7%, respectivamente.

Existem poucos dados sobre a freqüência de aloimunização eritrocitária nos pacientes brasileiros portadores de doenças falciformes. Moreira et al., em 1996, observaram uma taxa de aloimunização global eritrocitária de 12,9% (11/85) e uma freqüência de anti-KEL1 de 18,2% (2/11) entre os pacientes aloimunizados. Fabron Jr et al., em 2004, detectaram uma taxa de aloimunização global eritrocitária de 20,8%

(26/125) e uma freqüência de anti-KEL1 de 11,5% (3/26) entre os pacientes aloimunizados. Mais recentemente, Murao e Viana (2005), reportaram uma taxa de aloimunização global eritrocitária de 9,9% (82/828) e uma freqüência de anti-KEL1 de 14,6% (12/82) entre os pacientes aloimunizados. Estes estudos têm sugerido um menor risco de aloimunização nos pacientes em acompanhamento nos Serviços de Hematologia e Hemoterapia do Brasil.

Tabela 19. Estudos analisando a taxa de aloimunização global em pacientes falciformes transfundidos e a freqüência de aloimunização anti-Kell em pacientes aloimunizados portadores de doenças falciformes.

Autor (ano) País n Taxa de

aloimunização global

Freqüência de aloimunização

anti-KEL1 Orlina et al. (1978) USA 50 36% (18/50) 27,8% (5/18) Coles et al. (1981) USA 99 23,2% (23/99) 21,7% (5/23) Davies et al. (1986) UK 34 17,6% (6/34) 16,7% (1/6) Sarnaik et al. (1986) USA 245 7,7% (19/245) 57,9% (11/19)

Luban (1989) USA 127 20,5% (26/127) 30,8% (8/26)

Patten et al. (1989) USA 68 38,2% (26/68) 19,2% (5/26) Rosse et al. (1990) USA 1.814 18,6% (338/1.814) 28,1% (95/338) Vichinsky et al. (1990) USA 107 29,9% (32/107) 56,2% (18/32)

Moreira et al. (1996) Brasil 85 12,9% (11/85) 18,2% (2/11) Aygun et al. (2002) USA 140 37,1% (52/140) 76,9% (40*/52) Castro et al. (2002) USA 351 39% (137/351) 38% (52/137) Fabron Jr et al. (2004) Brasil 125 20,8% (26/125) 11,5% (3/26) Murao, Viana (2005) Brasil 828 9,9% (82/828) 14,6% (12/82) n: número de pacientes transfundidos

USA: Estados Unidos da América UK: Reino Unido

Uma estratégia freqüentemente recomendada para reduzir a incidência de aloimunização nos pacientes com doenças falciformes é suplementar a fenotipagem de outros antígenos à tipagem pré-transfusional clássica dos antígenos A e B do sistema ABO e do antígeno D do sistema Rh. Este procedimento pode incluir apenas alguns poucos antígenos adicionais, como C, E, K ou C, c, E, e, K até a tipagem expandida a 8 antígenos adicionais, isto é, C, c, E, e, K, S, Fya, Fyb, Jkb (Vichinsky et al., 2001; Aygun et al., 2002; Castro et al., 2002) Estes protocolos de tipagem pré-transfusional expandida podem chegar a prevenir a aloimunização eritrocitária em até 52% a 70,8% de todos os pacientes aloimunizados. Esta estratégia pode também diminuir o risco de reação transfusional hemolítica tardia/síndrome de hiperhemólise e o desenvolvimento de auto-anticorpos. Por outro lado, estes protocolos demandam alto custo financeiro, acesso a unidades de hemácias com fenótipos incomuns e não eliminam totalmente o risco de aloimunização, assim como a reação transfusional hemolítica tardia/síndrome de hiperhemólise (Aygun et al., 2002; Castro et al., 2002).

Nossos dados demonstraram que a freqüência dos genótipos KEL*1/KEL*2 (6.5%) e KEL*6/KEL*7 (6.5%) encontrada nos pacientes brasileiros portadores de hemoglobinopatias foi diferente daquelas usualmente observadas em populações negróides; por exemplo, o antígeno KEL1 foi observado em 2,5% de 125 pacientes portadores de doenças falciformes por Vichinsky et al. (2001). Além do mais, as freqüências dos genótipos KEL*1/KEL*2 (6.3%) e KEL*6/KEL*7 (4.4%) observadas nos doadores de sangue foram diferentes das esperadas tanto para uma população caucasóide quanto para uma população negróide, e são muito similares aos resultados observados em nossos pacientes com hemoglobinopatias. Estes achados sugerem uma alta taxa de miscigenação nos pacientes brasileiros negróides portadores de hemoglobinopatias, assim como nos nossos doadores de sangue, e possivelmente explicam o menor risco de aloimunização Kell encontrado em pacientes brasileiros portadores de doenças falciformes descrito anteriormente (Moreira et al., 1996; Fabron Jr et al., 2004; Murao e Viana, 2005). Além disto, nossos dados também sugerem que a necessidade de transfusão de concentrado de hemácias com fenotipagem expandida pode não ter o mesmo custo-benefício nos pacientes politransfundidos no Brasil quando comparados aos pacientes transfundidos em países da Europa e América do Norte, onde a população de doadores é composta principalmente de indivíduos de origem caucasóide.

Além do estudo dos polimorfismos KEL*1,2, KEL*3,4,21 e KEL*6,7, ficamos atentos aos relatos de novos antígenos do sistema Kell. Os antígenos KEL29 (KALT) e KEL30 (KTIM) estão entre os últimos antígenos descritos e reconhecidos pela ISBT (Lee et al., 2006). O antígeno KEL29 foi identificado a partir da detecção do aloanticorpo anti-KEL29 (anti-KALT) em uma mulher mexicana que apresentava o polimorfismo 1988G>A em homozigose no exon 17, o qual codifica lisina ao invés de arginina na posição do aminoácido 623 da proteína Kell. O anticorpo anti-KEL29 (anti- KALT), de maneira inesperada, não aglutinava hemácias pré-tratadas com tripsina. O antígeno KEL30 (KTIM) foi identificado após a detecção de um aloanticorpo em uma mulher norte americana com história prévia de transfusão e gravidez. Ela apresentava o polimorfismo 1033G>A, em estado homozigoto, que codifica a asparagina no lugar do ácido aspártico na posição do aminoácido 305. O aloanticorpo anti-KEL30 (anti-KTIM), encontrado no seu soro, aglutinava hemácias tratadas com papaína, tripsina ou α- quimiotripsina.

Apesar de ambos os antígenos, KEL29 e KEL30, serem considerados de alta freqüência populacional, como não havia dados na literatura específicos sobre suas freqüências em diferentes populações, realizamos um estudo para determinar a freqüência dos alelos selvagens e variantes KEL*29 e KEL*30 em indivíduos brasileiros. Empregando as técnicas de PCR-TfiI-RFLP e PCR-TaqI-RFLP, estudamos 300 doadores de sangue e 68 pacientes brasileiros afro-descendentes portadores de hemoglobinopatias. Todos os indivíduos estudados apresentaram-se homozigotos para os nucleotídeos selvagens nas posições KEL*29 e KEL*30. Nenhum alelo variante KEL*29- (1988G>A) ou KEL*30- (1033G>A) foi identificado entre os 736 alelos analisados. Nossos dados sugerem que os antígenos KEL29 e KEL30 têm pouco impacto clínico, uma vez que a aloimunização a estes antígenos é, provavelmente, um evento raro restrito a poucos casos envolvendo indivíduos com fenótipo KEL:-29 ou KEL:-30 (Boturão-Neto, Bordin, 2007).

A aloimunização é sem dúvida o fenômeno clínico de maior importância relacionado com o sistema Kell. Geralmente a aloimunização envolve a produção de anticorpos contra antígenos Kell de baixa freqüência populacional (Rosse et al., 1990; Vichinsky et al., 1990; Vichinsky et al., 2001; Aygun et al., 2002; Castro et al., 2002). Entretanto, aloanticorpos contra antígenos Kell de alta freqüência têm sido reportados esporadicamente e podem causar dificuldade na abordagem transfusional destes pacientes (Mazzara, et al. 2001; Win et al., 2005). Durante o desenvolvimento do atual

estudo, identificamos um aloanticorpo (título 1:32) contra antígeno eritrocitário de alta freqüência populacional no soro de uma gestante multípara negróide. Os testes sorológicos imunohematológicos para identificação do anticorpo apresentaram reatividade para todas as hemácias do painel, a qual aumentava após tratamento com papaína e era inibida com o emprego dos reagentes ZZAP e AET, sugerindo a presença de aloanticorpo contra antígenos de alta freqüência do sistema Kell. As hemácias da paciente foram fenotipadas como KEL:-1,2,-3,4 [K-, k+, Kp(a-b+)]. Como os anti-soros anti-KEL6 (anti-Jsa) e anti-KEL7 (anti-Jsb) não eram comercialmente disponíveis, realizamos a genotipagem do polimorfismo KEL*6,7 na gestante e seus familiares. Os resultados obtidos (Figura 15 e Tabela 18) colaboraram na identificação do aloanticorpo anti-KEL7 (anti-Jsb). Chamava a atenção o antecedente obstétrico da paciente que apresentava quatro abortos prévios e um natimorto.

A DHPN causada pelo anticorpo anti-KEL7 é rara. Apenas quatro casos foram relatados previamente na literatura. O primeiro caso, reportado em 1969, descrevia um quadro clínico leve sem a necessidade de tratamento específico (Wake et al., 1969). Lowe et al., em 1978, descreveram um caso, identificado no sexto dia de vida, que demandou transfusão com hemácias da própria mãe, a qual teve um aborto na quarta gravidez. Gordon et al., em 1995, descreveram um caso grave de DHPN que necessitou de avaliação e tratamento intra-uterino precoce motivado pelo antecedente de cinco abortos, incluindo um caso de hidropisia fetal. Stanworth et al. (2001) descreveram um caso grave de DHPN causado por anti-KEL7 que requereu ex- sangüíneo transfusão seguida por transfusões e uso de eritropoetina humana recombinante até o completo controle da anemia neonatal. Em conclusão, auxiliado pela técnica molecular (PCR-RFLP), identificamos o quinto caso da literatura de DHPN associada à aloimunização anti-KEL7 em uma gestante brasileira negróide, que presumivelmente foi exposta ao antígeno KEL7 durante sua segunda gestação ou em transfusão prévia. O insucesso de todas as gestações com seu segundo parceiro (KEL*7/KEL*7) associado ao comportamento in vitro do anticorpo (índice do MMA = 8%) contribuíram para enfatizar a hipótese que o aloanticorpo anti-KEL7 (anti-Jsb) era clinicamente significante e associado às mortes fetais intra-uterinas (Boturão-Neto et al., 2006).

Em adição, padronizamos em nosso laboratório o seqüenciamento do gene KEL com o objetivo de identificar as mutações responsáveis pelo fenótipo KELnull (K0) nos

pacientes de Manaus-AM e Vila Velha-ES. A mesma metodologia foi empregada para a elucidação da alteração molecular responsável pelo padrão anômalo observado em três indivíduos não relacionados durante a genotipagem do polimorfismo KEL*3,4 por PCR-NlaIII-RFLP.

O fenótipo KELnull é uma condição rara, com uma freqüência populacional inicialmente estimada em 1:15.000 a 1:25.000 habitantes (Daniels, 2002). Contudo, estudo recente sugere uma freqüência bem inferior, onde a soma de todos os indivíduos com os fenótipos KELnull e KELel não ultrapassaria 1:570.310 habitantes (Körmöczi et al., 2007). Apesar de o fenótipo KELnull ser conhecido desde 1957