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doentes com Esclerose Sistémica difusa e limitada.

Verificaram-se alterações no ratio entre as integrinas CD29 e CD49e nos subtipos de ES. Houve um aumento do ratio nas células NK CD56dim _{dos doentes com ESD}

relativamente ao grupo controlo. Já as células NK CD56bright _{apresentaram um aumento}

do ratio em ambos os subtipos da doença relativamente ao grupo controlo (Figura 13).

Figura 13 – Ratio de CD29/CD49e nas 2 subpopulações NK (NK CD56dim _{e NK CD56}bright_{). Os resultados estão expressos}

A ES é uma patologia inflamatória auto-imune multisistémica. Uma das características centrais na ES é a presença de uma variedade de anomalias imunológicas que evidenciam mecanismos de desregulação que levam à evolução desta patologia. A rápida progressão desta patologia pode culminar na morte do doente, daí ser crucial entender os eventos que levam ao desenvolvimento da doença.(64)

Sabe-se que a desregulação imunológica, que ocorre nesta patologia, desempenha um papel importante na iniciação e desenvolvimento da doença. Adicionalmente, o aparecimento de infiltrados de células mononucleares na pele antes do aparecimento de alguma evidência de fibrose, indicia a actividade das células do sistema imune (SI) no estádio inicial da doença.(65, 66)

Curiosamente, estudos demonstraram que os fibroblastos de doentes com ES não apresentavam alterações no perfil genético, comprovando que a estimulação da síntese de colagénio é exógena e deste modo, a fase fibrótica poderá representar uma consequência da estimulação por células inflamatórias.

Neste contexto, torna-se importante conhecer qual o papel das células NK na inflamação crónica subjacente a esta patologia.

1. Quantificação das células Natural Killer totais, e das suas subpopulações Natural Killer CD56dim e Natural Killer CD56bright do sangue periférico de doentes com Esclerose Sistémica

As duas principais funções mediadas pelas células NK são a actividade citolítica e a produção de citocinas, funções estas normalmente atribuídas às células NK CD56dim _{e às}

células NK CD56bright_{, respectivamente. Efectivamente, ambas as subpopulações de}

células NK têm actividade citotóxica, embora as células NK CD56dim_{, sejam a}

subpopulação mais citotóxica, devido aos níveis mais elevados de perforinas e granzimas nos grânulos citolíticos. As NK CD56bright _{evidenciam também uma actividade citotóxica}

importante, no entanto, menos expressiva que as NK CD56dim_{.(67, 68)}

Neste estudo, verificou-se que as células NK de um modo geral tendem a estar diminuídas no sangue periférico de doentes com ES em comparação a indivíduos saudáveis, no entanto só observamos valores estatisticamente significativos em doentes em que a severidade da doença era superior, como no caso da presença de FP e UD. Estes valores vão ao encontro de alguns estudos no âmbito desta e de outras doenças autoimunes (69) como é o caso do LES.(70, 71) Correlacionando a função

desempenhada por estas células, nomeadamente na resposta inflamatória, com o facto de se encontrarem particularmente diminuídas no SP neste grupo de doentes com FP e UD, sugere uma possível relação com a severidade da doença, podendo ser bons indicadores de lesão tecidual. De facto, as UD são lesões necróticas resultantes da manifestação vascular, que se acredita ocorrerem precocemente na fisiopatologia da ES, e deste modo é considerada na literatura como um dos marcadores da severidade da doença. Da mesma forma, a presença de FP traduz-se em morte tecidual e deste modo pode ser associada a um agravamento do estado clinico do doente. A diminuição da frequência das células NK na presença FP pode dever-se possivelmente à maior infiltração destas células nos tecidos lesados.(72)

Contudo, considerando a diferença registada entre as contagens de glóbulos brancos no SP entre os dois subtipos de ES, (Difuso = 9,39 ± 2,15 x103_{cel/μl e Limitado= 7,93 ±}

2,28 x103_{cel/μl), seria de esperar que a frequência das células em estudo se distinguisse}

com significância entre os dois subtipos da doença, o que não se verificou. O número reduzido de doentes com ES do subtipo difuso (apenas 10) em comparação com grupo de doentes com ES do subtipo limitado (30) pode estar na origem desta situação.

Os doentes foram também agrupados consoante a duração da doença considerando que um indivíduo que apresenta a doença há menos de 1 ano encontra-se num ambiente imunológico diferente do de um indivíduo que apresenta a doença há mais de 10 anos. Após análise estatística dos resultados, ao longo da duração da doença, não se verificaram valores estatisticamente significativos no entanto há tendências evidentes que se salientam. Deste modo o número de células NK total, quer em percentagem, quer em valor absoluto, em circulação tende a aumentar ao longo dos anos da doença, comportando-se as células NK CD56dim _{de igual forma e, por outro lado, as células NK}

CD 56bright _{apresentam uma diminuição com a duração da doença, embora em ambos os}

casos sem significado estatístico. Este facto pode ser explicado pelas células NK CD56bright _{serem a subpopulação predominante nas lesões inflamatórias, e com o evoluir}

da doença essas situações estarem aumentadas.(33)

O aparecimento de valores normais de células NK em doentes com ES diagnosticada há mais de 10 anos parece sugerir um envolvimento distinto das células NK no início e durante a duração da doença.

2. Caracterização fenotípica e funcional de células Natural Killer totais, Natural Killer CD56dim e Natural Killer CD56bright do sangue periférico de doentes com Esclerose Sistémica

A expressão de integrinas está alterada em diversas condições patológicas. Na EM, a expressão endotelial da subunidade 1, por exemplo, está reduzida durante a fase aguda da doença, mas depois retoma os níveis normais na fase crónica. Além disso, a inflamação estimula o aumento da expressão vascular das subunidades α5, α6 e 1.(73)

Os receptores dos componentes da matriz extracelular são predominantemente integrinas que os ligam ao citoesqueleto das células, transmitindo sinais e forças mecânicas permitindo a motilidade celular. Este processo é altamente regulado, dinâmico e requer remodelação contínua do citoesqueleto através da ligação célula-célula ou célula-componente da matriz extracelular.

A expressão da integrina CD49e, neste estudo, encontra-se diminuída em ambas as subpopulações de células NK em ES independentemente do subtipo de doença e da duração da doença. No entanto, esta diminuição parece ser mais acentuada em doentes com parâmetros clínicos de severidade da doença, como é o caso da presença de FP ou UD.

As integrinas controlam aspectos fundamentais no comportamento das células através da sua capacidade para realizar a transdução de sinal, bidireccionalmente, através da membrana celular. Esta transferência de informação é manifestada através de alterações conformacionais que traduzem a activação e o estado de afinidade de ligação da célula ao receptor.(74)

A fibronectina, é o ligando específico desta integrina, que na ES se encontra presente em excesso, na matriz extracelular do soro destes doentes.(75)

Por outro lado, a expressão de CD29 e a frequência das subpopulações de células NK, a expressar esta proteína, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos em estudo.

As células NK podem, ainda, exibir actividade pró-angiogénica na ES uma vez que nesta patologia ocorre a lesão vascular. Esta capacidade remodeladora é-lhes cedida através de moléculas de adesão como a E-caderina e pelas suas integrinas.(76)

As integrinas anteriores funcionam como agonistas no processo de inflamação crónica que ocorre na ES. No entanto, a célula NK desenvolve mecanismos de regulação negativos que têm como papel a regulação negativa da inflamação e reposição da homeostase celular.

O LAIR-1 surge assim como um receptor inibidor da activação celular expresso nas células NK, desempenhando um importante papel na regulação do SI. (77) Neste estudo, o LAIR-1 evidenciou uma tendência de aumento da sua expressão em ambas as subpopulações de células NK mostrando esse aumento, significância estatística em ambas as subpopulações, em ESL.

Mediante acoplamento da porção extracelular de LAIR-1, os ITIM ligam-se ao domínio SH2 das fosfatases, conduzindo à inactivação de diferentes cinases sub- regulando, assim, a activação da célula NK. Estudos evidenciam que, para além de inibir a activação das células NK, o LAIR-1 inibe, também, as células T.

Os colagénios, presentes em concentrações elevadas no soro de pacientes com ES, são ligandos funcionais deste receptor, inibindo esta interacção, a activação de células imunes.(60)

A ligação do colagénio ao LAIR-1 nas células NK fornece um potente sinal inibidor que é capaz de impedir a lise das células alvo, através da inactivação das células NK activadas, reduzindo a sua citotoxicidade. A identificação dos colagénios como os ligandos de LAIR-1 evidencia um papel de relevo para os componentes da matriz extracelular como potenciais proteínas reguladoras do sistema imune. A interacção do LAIR-1 com os colagénios é de alta afinidade e dependente da presença de hidroxiprolina, com modificação pós-translacional que está exclusivamente presente nas repetições Gly-Pro-Hyp do colagénio.

O aumento de glicoproteínas citolíticas na ES é um dos mecanismos esperado visto a perforina ter como missão a formação de poros, nas membranas das células alvo, permitindo a entrada de granzimas resultando na morte celular por apoptose.(78)

De uma forma geral observou-se um aumento da frequência de células NK a expressar quer granzima B quer perforina, bem como da expressão destas proteínas em ES. Este facto evidencia uma maior actividade citotóxica nas células dos doentes. Este aumento parece ser mais evidente nos doentes com parâmetros clínicos de severidade de doença, como a FP e UD e ao longo da doença. Aumentos de granzima B solúvel tem sido, também, observado durante a inflamação prolongada e é implicado na patogénese de doenças inflamatórias crónicas como é o caso da ES.(79)

A granzima B é produzida por células com capacidade citotóxica, como é o caso da célula NK, e a sua libertação promove apoptose da célula infectada ou de células tumorais.(80)

A capacidade citotóxica das células NK está assim aumentada evidenciando um processo contínuo de inflamação crónica.

As células NK são também conhecidas pela sua função citotóxica, sendo esta, essencial na resposta contra tumores, vírus intracelulares e na imuno vigilância, de um modo geral. As IL-2 e IL-15 são responsáveis por sinais importantes que levam à proliferação, sobrevivência e activação citolítica das células NK. A actividade das células NK é controlada por um equilíbrio entre estimulação e inibição de receptores de superfície, sendo os receptores inibitórios responsáveis pela tolerância das células NK a antigénios do próprio. A produção de IFN- e TNF-α, pelas células NK, está funcionalmente ligada à sua actividade citolítica. As células NK CD56dim _{representam uma}

subpopulação única que combina a capacidade de produção de IFN- após serem estimuladas e proliferarem com a capacidade de matar células e produzir citocinas após a recepção de sinais de activação. A capacidade destas citocinas inflamatórias para induzir sinergicamente a citólise de células alvo, demonstrando assim, que são parte integrante da função efectora das células NK.(81)

O IFN- é uma citocina pró-inflamatória com actividade anti-angiogénica que intervém em várias patologias inflamatórias como é o caso da AR, do LES e da ES.(82) O TNF-α é uma importante citocina inflamatória que também intervém na angiogenese. (82) A principal função do TNF-α na ES é o bloqueio do colagénio, controlando assim a fibrose. Há evidências que mostram que níveis de TNF-α têm sido detectados na pele de doentes com ES na fase inicial da doença.(83)

Neste estudo não observamos alterações significativas para estas duas citocinas. Segundo a literatura, aumentos de TNF-α no soro encontram-se descritos em doentes com ES e são normalmente associados à fisiopatologia da doença, nomeadamente na inflamação e fibrose, pela estimulação da produção de colagénio.

Estudos anteriores revelam, ainda, que um aumento dos níveis de IFN- está associado a doentes com ES com um quadro clínico estável, enquanto que, os doentes com doença activa tendem a apresentar níveis de IFN- semelhantes aos indivíduos saudáveis.(84). No caso do IFN- o seu controlo terapêutico torna-se importante nestes doentes uma vez que esta citocina tende a agravar significativamente a sua função pulmonar, bem como a deterioração da pele, fenómeno frequente nesta patologia.(85)

Os nossos resultados sugerem uma diminuição da percentagem e valor absoluto de células NK totais e suas subpopulações, NK CD56dim e NK CD56bright, em doentes com ES, sobretudo na presença de UD e FP.

Observamos uma diminuição da expressão de CD49e e o aumento da expressão de LAIR-1 nas células NK em doentes com ES, principalmente na presença dos parâmetros clínicos referidos em doentes com ES, que poderá corresponder a alterações na capacidade de migração destas células, principalmente, mediado pelos componentes da matriz extracelular, como a fibronectina e o colagénio.

Verificamos um aumento da frequência de células NK a expressar granzima B e perforina, bem como um aumento da expressão destas duas proteínas, evidenciando uma maior capacidade citotóxica destas células, provavelmente devido a um maior limiar de activação periférica.

Deste modo, julgamos ter demonstrado que as células NK parecem ter um papel importante na fisiopatologia da ES, pelas alterações fenotípicas e funcionais detectadas neste estudo, podendo vir a ser aplicadas na monitorização da severidade desta doença debilitante, no futuro.

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