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No caso da monensina, há duas explicações para o decréscimo nas produções de gás e CH4 e DVMO (Tabela 3). Primeiramente, monensina aumenta a produção de

propionato (RUSSEL; STROBEL, 1988) e, de acordo com a estequiometria da produção de gases, a formação de propionato está associada com decréscimos nas produções de gás e CH4 (WOLIN, 1960). Em nosso trabalho, a produção de CH4 foi de 27,3 mL/g

MOdegradada para CTLcorrig e 21,5 mL/g MOdegradada para MON corrigida para BMON, o que

representa redução de 21% (Tabela 4). Reduções de CH4 de 48, 52 e 58% foram

observadas quando monensina foi adicionada in vitro nas concentrações de 2,5; 5,0 e 12,5 mg/L, respectivamente (RUSSEL; STROBEL, 1988). Em segundo lugar, monensina também reduz a degradação in vitro da MO, o que é sustentado pela maior (P < 0.01) MO residual do tratamento MON (145,1 mg) comparado ao CTL (119,3 mg; Tabela 3). Esta redução na degradação de MO é típica limitação de experimentos in

vitro de curta duração, pois monensina inibe bactérias gram-positivas relacionadas à

fermentação, o que inclui alguns Ruminococcus sp. celulolíticos (CHEN; WOLIN, 1979). Infelizmente, nós não mensuramos a concentração de FDN nos resíduos, o que poderia fortalecer a ideia de que monensina diminui a degradação in vitro de fibra. Em

contrapartida, os efeitos deletérios da monensina sobre a degradação de fibra não são observados sob condições in vivo, pois nestas condições bactérias celulolíticas tolerantes à monensina são capazes de substituir aquelas sensíveis (RUSSELL; STROBEL, 1989).

Para carvacrol e eugenol, a redução nas produções de gás e CH4, juntamente

com incremento na MO residual total (Tabela 5), ocorreu devido às propriedades antimicrobianas e antimetanogênicas dessas substâncias. Calsamiglia et al. (2007) e Benchaar et al. (2008) revisaram detalhadamente os efeitos do carvacrol e eugenol sobre a fermentação ruminal. Os efeitos do 1,8-cineol na fermentação foram menos evidentes (Tabela 5), demonstrando que este composto não possui potente atividade antimicrobiana. De maneira semelhante, ciclodextrinas de cineol apresentaram efeitos modestos sobre a fermentação ruminal in vitro, inclusive com aumento na produção de CH4 (TATSUOKA et al., 2008).

A redução (P < 0,05) nas produções de gás e CH4 dos brancos devido às

inclusões de monensina, carvacrol e eugenol indica que estes aditivos foram capazes de afetar a fermentação da MO oriunda do inóculo. É claro que, uma vez desenvolvidos para modificar a fermentação ruminal, aditivos podem tanto afetar a fermentação da MO do substrato como do inóculo. Todavia, é importante termos em mente que as partículas do alimento oriundas do inóculo já sofrem degradação mesmo antes do início da incubação in vitro. Isto ocorre pois os processos de colonização e fermentação iniciam-se no rúmen dos carneiros doadores. Consequentemente, a maioria do gás produzido pela fermentação da MO do inóculo é liberada nas primeiras horas após incubação. Logo, considerando-se a necessidade de certo intervalo de tempo para o início da ação do aditivo, era de se esperar que os aditivos fossem menos efetivos nos brancos do que nos frascos contendo substrato. Este padrão de resposta foi somente confirmado para o carvacrol, o aditivo que apresentou os efeitos mais pronunciados sobre a fermentação. Para o carvacrol, as produções de gás e CH4 diminuíram em 65,5

e 94,6% nos frascos contendo substrato e 30,2 e 81,0% nos brancos, respectivamente (Tabela 5). Entretanto, para os outros tratamentos os efeitos foram similares entre os frascos com substrato e os brancos. Por exemplo, a monensina reduziu as produções de gás e CH4 em 9,7 e 24,2% nos frascos contendo substrato e em 6,2 e 21,9% nos

brancos (Tabela 3). Para o eugenol, a produção de gás foi 15% menor tanto para frascos com substrato como para os brancos (Tabela 5). Estas discrepâncias são provavelmente reflexo das diferentes atividades antimicrobianas dos aditivos testados.

Os efeitos da monensina, do carvacrol e do eugenol sobre a fermentação dos brancos claramente confirmam que a correção das produções de gás e CH4 usando

BCTL (branco sem aditivo) é prática inapropriada. As Tabelas 4 e 6 mostram que a

correção com BCTL superestimou os efeitos dos aditivos quando comparada com a

correção feita com os brancos específicos. Como exemplo, a produção líquida de gás foi 225,8 e 194,8 mL/g MOdegradada para o CTLcorrig e MON corrigida para BCTL (P < 0,01),

respectivamente. Porém, quando MON foi corrigida com BMON, a estimativa da produção

líquida de gás aumentou para 209,4 mL/g MOdegradada, resultado que não diferiu do

CTLcorrig (P < 0,11; Tabela 4). De maneira semelhante, no Experimento 2 a produção

líquida de gás foi 213,0 e 222,0 mL/g MOdegradada para CTLcorrig e CIN ajustado para BCTL

(P < 0,17), respectivamente. Neste caso, a estimativa da produção líquida de gás aumentou para 231,0 mL/g MOdegradada quando CIN foi ajustado para BCIN, valor este

que foi maior do que CTLcorrig (P < 0,01; Tabela 6).

Aditivos incluídos sob doses elevadas ou que apresentem forte atividade biológica aumentam o erro associado à correção com BCTL. Em nosso caso, isso foi

claramente confirmado para CAR, o aditivo que dentre os testados apresentou a maior atividade antimicrobiana. A correção das produções de gás e CH4 do tratamento CAR

usando BCTL resultou em estimativas negativas e irreais (Tabela 6).

O uso de brancos específicos também apresenta outras vantagens adicionais, particularmente quando o aditivo, por si só, pode ser usado como substrato pelas populações microbianas. Como exemplo, extratos brutos de plantas podem conter açúcares fermentáveis. Logo, o uso de branco específico poderia ser usado para descontar as quantidades de gás e CH4 produzidas pela degradação desse substrato

adicional. Tal aplicação já foi feita ao se avaliar plantas moídas contendo substâncias capazes de modificar a fermentação ruminal (GOEL; MAKKAR; BECKER, 2008).

Em alguns casos, brancos específicos podem não ser necessários ou até mesmo viáveis. Como exemplo, em nosso estudo o 1,8-cineol apresentou pouco efeito sobre a fermentação, o que torna desnecessário o uso de branco específico. A inclusão

de brancos específicos aumenta drasticamente o número de frascos, o que é bastante relevante em estudos que visam avaliar simultaneamente diversos aditivos, como os apresentados por Bodas et al. (2008), García-González et al. (2008) e Soliva et al. (2008). Adicionalmente, é importante frisar que qualquer esforço no intuito de reduzir a quantidade de MO do inóculo também diminui a necessidade de brancos específicos.

Por fim, a Tabela 6 mostra que a produção líquida de gás para CAR corrigido para BCAR (7,5 mL) foi muito pequena ao ser comparada com sua DVMO (52,4%).

Consequentemente, a produção líquida de gás foi somente 27,3 mL/g MOdegradada, o que

é muito menor do que os 213 mL/g MOdegradada do CTL. Resultados similares também

ocorreram para a produção de CH4 expressa em mL/g MOdegradada. A degradação foi

muito maior do que a produção de gás porque o substrato não-degradado (dieta com 80% de concentrado e 20% de volumoso, contendo 62,7% de milho) foi parcialmente solubilizado pelo meio de incubação e pela solução de detergente neutro usada para a determinação da degradação verdadeira. A adição de 50 mg de carvacrol apresentou o efeito mais pronunciado dentre os aditivos testados. Como resultado, mais substrato não-degradado foi obtido após 16 h de incubação. A solução de detergente neutro foi desenvolvida para solubilizar o conteúdo celular dos vegetais, porém também solubiliza parcialmente o amido (VAN SOEST; ROBERTSON; LEWIS, 1991). Como resultado final, a DVMO foi superestimada para o tratamento CAR.