3.2. Yöntem
3.2.1. Stok Çözelti Hazırlama
Stok çözeltiler Sambrook vd., (1989)’a göre aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır.
3.2.1.1. CTAB Stok Çözeltisinin Hazırlanması
2x ‘lik 1 L’lik erlen meyerin içerisine yaklaşık 500 mL dH2O konduktan sonra 81.80 g
NaCl kimyasalı hassas terazide tartıldıktan sonra boşaltılmıştır. Daha sonra 20 g CTAB yine hassas terazide tartımı yapıldıktan sonra eklenmiş, hemen ardından 40 mL 0,5 M EDTA eklenmiştir. Tuzlar çözüldükten sonra PH’sı 8.0 olan 1M Tris çözeltisinden 100 mL konulmuştur. Ölçü silindirine aktarılarak hacmi 1 L oluncaya kadar üzerine dH2O
eklenmiştir. Daha sonra otoklavda 121oC’de 1.2 atmosfer basınçta 15 dk sterilize
edilmiştir. Sterilizasyon işleminden sonra 2 mL βeta-mercaptoetanol eklenmiştir.
3.2.1.2. 1M Tris (PH 8) Çözeltisinin Hazırlanması
Trizma basenin moleküler ağırlığı 121.3 g’dır. Bu kimyasaldan 1M yoğunlukta 500 mL hazırlanmak istenirse kullanmamız gereken miktarın 60.55 g olduğu bulunmuştur. Bir adet erlen meyer içerisine yaklaşık 400 mL dH2O konulmuştur. Daha sonra hassas
terazide 60.55 g Trizma base tuzu tartılarak erlen meyerin içerisine boşaltılmıştır. Tuzun suda çözünmesinden sonra, pH metre ile pH 8.0 oluncaya kadar HCL eklenmiştir (yaklaşık 2.21 mL). Sonrasında çözelti ölçü silindirine boşaltılarak; üzerine dH2O
eklenerek hacim 500 mL’e tamamlanmıştır. Daha sonra da otoklavda 121oC’de 1.2 Atm basınçta 15 dk sterilize edilmiştir.
3.2.1.3. 0,5 Molar EDTA, pH 8 Çözeltisinin Hazırlanması
EDTA’nın moleküler ağırlığı 372.24 g’dır. 0,5M 500 mL EDTA hazırlamak için bu kimyasaldan gereken miktar 84.05 g bulunmuştur. 750 mL’lik erlen meyerin içerisine yaklaşık 250 mL dH2O konulmuştur. Hassas terazide ölçümü yapılan EDTA’nın 84.05
g tartılıp erlene konulmuştur. Daha sonra pH 8,0 olana kadar 5M NaOH’tan yavaşça eklenmiştir. Bu işlemden sonrada çözelti ölçü silindirine boşaltılarak; 500 ml’e tamamlanmıştır. Daha sonra da otoklavda 121oC’de 1.2 Atm basınçta 15 dk sterilize
edilmiştir.
3.2.1.4. Tris-Borate 10X (TBE) Çözeltisinin Hazırlanması
Yaklaşık 500 mL dH2O erlen içerisine konduktan sonra 1 litre 10x’lik TBE (tris-borate-
edta) çözeltisi hazırlanmak için; hassas terazide ölçümü yapılan 54 g Tris base kimyasalı erlen meyerin içerisine boşaltılmıştır. Yapılan hesaplamalardan sonra 27.5 g borik asit tartılmıştır. Ve erlen meyerin içerisine boşaltılmıştır. Ardından 20 ml 0.5 M EDTA pH 8 eklenmiştir. Ölçü silindirinde toplam hacim dH2O ile 1 L’e
tamamlanmıştır.
3.2.1.5. DNA Elde Etme Yöntemi
DNA çıkartma işlemi MO-BIO Laboratories firmasından sağlanan UltraClean® Plant DNA Isolation Kit protokolü modifiye edilerek veya klasik CTAB yöntemi ile yapılmıştır. Taze yaprak örnekleri MO-BIO protokolüne göre yapılırken, yaşlı yapraklardan alınan örneklerde doku ezme işlemi elle yapıldıktan sonra kit protokolü takip edilmiştir. Metan şirketinin AR-GE sahasında 12 Nisan 2014 Cumartesi günü tüpler hazır hale getirilerek numaralandırma işlemi yapılmıştır. Cihazların tezgaha kurulumları da yine aynı gün içinde yapılmıştır. Örnekleri alınan soğan parselleri için etiket hazırlanmıştır. 13 Nisan 2014 bahar günü sabahı araziye gidilerek; örnek alınacak olan parsellere ilk olarak işaretleme işlemi yapılmıştır (Şekil 3.2.1.5.1).
Şekil 3.2.1.5.1. MTN şirketinin AR-GE arazisinde DNA izolasyonu için etiketleme işleminin yapılması
Araziden alınan soğan örnekleri (etiketli) sırasıyla tezgahta sıraya konulmuştur. Daha sonra her bir örneği temsil eden soğan yaprakları tek tek makas yardımıyla belli bir mesafeden (yaklaşık 5cm olacak şekilde) kesilmiştir (Şekil 3.2.1.5.2).
A B
Şekil 3.2.1.5.2. DNA izolasyonu için soğan fidelerinden yaprak örneklerinin alınarak tüplere konulması
2 mL Bead Solution Tube’ün içerisine konulmuştur. Her biri 12’li olan ilk 4 setin işlemi bu şekilde yapılmıştır. 4 setin sonrasındaki diğer setlerde her bir örnek yine belli bir mesafeden kesilmiş; küçük kilitli poşetlere konulmuştur. Ardından 60 µl P1 solüsyonu eklenmiştir. Daha sonra da sert bir cisim yardımıyla ne kilitli poşet yırtılacak şekilde ne de sıvı dışarı çıkacak şekilde bitki örneklerine ezme işlemi yapılmıştır (Şekil 3.2.1.5.3).
Şekil 3.2.1.5.4. Ezilen bitki parçalarının bead’li tüplere aktarımı ve vortexlenmiş hali Ezilen bu bitki doku parçaları 2 mL Bead Solution Tube aktarılmıştır. Ayrıca bu tüplerin içerisine 2 adet bead konulmuştur (Şekil 3.2.1.5.4). Ardından 60 µl P1 solüsyonu eklendi Alt üst edilen tüplerin homojen bir şekilde karışımı sağlandığına inanıldıktan sonra, 65oC’de yaklaşık 10 dk kadar bekletilmiştir. Hemen ardından tüpler
maximum (10) hızda 20 dk kadar vortex işlemi yapılmıştır. 2mL bead solution tubeler 10,000x g’de 60 sn santrifüj yapılmıştır. Bu işleminde ardından yaklaşık 500 µl olacak şekilde pipetin ucu tüpün en dibine yerleştirilerek; solüsyonun alımı sağlanmıştır ve yeni 2 mL Collection tüplere aktarımı yapılmıştır. Her bir soğan örneği için bu işlem tekrarlanmıştır. Daha sonra 250 µl P2 solüsyonu eklenmiştir.
Bu işlemden sonra da vortex touch kısmına getirilerek, her bir tüp birkaç saniye elde tutularak vortex yapılmıştır. Hemen ardından tüpler 4oC’de 5 dk inkübe edilmiştir. Daha
sonra 10,000x g’de 60 sn tüm tüpler santrifüj yapılmıştır. Bu işlemin sonunda tüplerin alt kısmında kalan pelet çözeltisi tüpte kalacak şekilde (Pipet kullanılmadan iki tüp birbirine aktarılmıştır.) süpernatant kısmı temiz 2 mL Collection tüplere aktarılmıştır. Daha sonra 1 mL P3 solüsyonu çekilerek, tek tek her bir tüpe aktarımı sağlanmıştır. Alt üst edilen tüplerin homojen bir şekilde karışımı yapılmıştır. (Solüsyonların karışımı için vortex kullanılmamıştır.) Ardından yaklaşık olarak 750 µl her bir tüpten çekilerek; 10,000x g’de 60 sn santrifüj işlemi yapıldıktan sonra Spin Filter tüplere aktarımı sağlanmıştır.
Şekil 3.2.1.5.6. DNA izolasyonunda santrifüjden çıkan tüplerdeki fazla sıvının boşaltma işlemi
Santrifüjden çıkan tüplerin içerisindeki sıvı döküldükten sonra bu işlem sadece 2 defa tekrarlanmıştır. Daha sonra santrifüjden çıkan Spin Filter tüplere 300 µl P4 solüsyonu eklendi. Ardından 10,000x g’de 60 sn santrifüj işlemi yapılmıştır. Bu işlemin sonunda da son olarak 50 µl P5 solüsyonu eklenmiştir. Hemen ardından 10,000x g’de 60 sn santrifüj işlemi yapılmıştır.
Santrifüjden çıkan Spin Filter tüplerin filtreleri atılmıştır ve bu sayede tüplerin alt kısmında DNA elde edilmiştir. Bu DNA elde etme işlemi 120 adet farklı soğandan yapılmıştır. Herhangi bir şüphe uyandıran tüpler tekrardan başa sarılarak tekrarlanmıştır. Nitekim 201 ile 210 tüpleri bu işlem sırasında yeniden tekrar edilmiştir.
3.2.2. Çıkartılan DNA’larda Yoğunluğun Belirlenmesi ve Agaroz Jelde