53 4.7: Biyolojik olarak sentezlenen AgNP'nin test edilen gram-negatif mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivitesi (+ Kontrol: Tetrasiklin (TE 10), a) Enterobacter aerogenes ATCC 13048 b) Klebsiella pneumoniae c) Salmonella enteritidis ATCC 13075 d) Saratia marrescens ATCC 13048). 54 4.8: Biyolojik olarak sentezlenen AgNP'nin test edilen gram pozitif mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivitesi (+ Kontrol: Tetrasiklin (TE 10), a) Listeria innocua b) Enterococcus mavis c) Staphylococcus aureus ATCC 25923 d) Bacillus subtilis DSMZ 1971).
GİRİŞ
Bitkilerin Tıbbi Açıdan Önemi
- Genel Özellikleri
Nanoteknoloji ve Nanopartiküller
- Nanopartiküllerin Sentezi
- Kimyasal Sentez
- Biyolojik Sentez
Nanoteknolojide bu terim, bitki özleri, mikroorganizmalar, mantarlar, maya, algler ve virüsler gibi canlı organizmalar veya kimyasal maddeler kullanılarak nanopartiküllerin sentezlenmesi anlamına gelir (Yıldız, 2011). Tek hücreli ve çok hücreli organizmalar hücre içi ve hücre dışı inorganik nanopartiküller üretebilmektedir (Vithiya ve Sen, 2011).
Nanopartiküllerin Antimikrobiyal Aktiviteleri
- Gümüş Nanopartiküllerin Antimikrobiyal Aktiviteleri
AgNP'lerin Gram-negatif bakteriler üzerindeki antimikrobiyal aktivitesinin AgNP konsantrasyonuna bağlı olduğu ve bakterilerin hücre duvarında 'çukurlar' oluşumuyla yakından ilişkili olduğu rapor edilmiştir (Sondi ve Salopek-Sondi, 2004). Gram-pozitif bakterilerin hücre duvarındaki peptidoglikan tabakası Gram-negatif bakterilerinkinden daha kalındır ve bu nedenle AgNP'lerin penetrasyonu daha zordur.
Nanopartiküllerin Antibiyofilm Aktiviteleri
- Biyofilm Yapısı ve Oluşum Basamakları
- Gümüş Nanopartiküllerin Antibiyofilm Aktiviteleri
- AgNP’lerin Antikanser Aktiviteleri
60 °C'de sentezlenen AgNP'lerin boyutu daha küçük olduğundan antibakteriyel aktivitenin etkisi 25 °C'ye kıyasla daha fazlaydı. Biyofilm oluşumuyla mücadeleye yönelik nanoteknolojik yaklaşımlar, biyomateryallerin yüzeyini kaplama yoluyla işlevselleştirmek için nanopartiküllerin kullanımına dayanmaktadır (Markowska ve diğerleri, 2013). AgNP'lerin yaygın kullanımı (örneğin dezenfektanların bir parçası olarak), gümüşe dirençli bakteri türlerinin kullanımının artmasına neden olmaktadır.
Biyosit olarak AgNP'ler bakteri hücreleri üzerinde veya içinde birden fazla bölgeyi hedef alır ve dolayısıyla geniş bir etki spektrumuna sahiptir. AgNP'lerin antibiyofilm aktivitesi birçok çalışmada gösterilmiştir. İyi ölçülmüş ve karakterize edilmiş bakteriyel biyofilmler ile AgNP'ler arasındaki etkileşimleri ele alan ilk raporda (2009); 24 saatlik Pseudomonas putida biyofilmlerinin biyokütlesinde küçük ama önemli azalmalar gözlemlendi. Sonuç olarak, AgNP'ler biyofilm oluşumunu etkili bir şekilde önler ve yerleşik biyofilmlerdeki bakterileri öldürür; bu da AgNP'lerin biyofilmle ilişkili enfeksiyonları önlemek ve tedavi etmek için kullanılabileceğini düşündürür (Martinez-Gutierrez ve diğerleri, 2013).
Bitkiler tarafından üretilen AgNP'ler kan dolaşımındaki hücre döngüsünü ve enzimleri düzenler (Alt ve diğerleri, 2004). 2013) yaptıkları çalışmada AgNP'lerin yeşil sentezinin diğer kimyasal bazlı sentetik ilaçlarla karşılaştırıldığında HeLa hücre hattında önemli sitotoksik etki gösterdiğini bildirmişlerdir. 2010) yaptıkları çalışmada kolloidal gümüşün MCF-7 meme kanseri hücre hattında apoptozun indüklenmesi yoluyla antitümör aktiviteye sahip olduğunu bulmuşlardır.
LİTERATÜR ÖZETİ
Araştırma sonuçlarında Ruscus ekstraktlarının ve izole edilmiş bileşiklerin antibakteriyel ve özellikle antifungal aktivitesinin standart ilaçlarla karşılaştırılabilir ve bazı durumlarda daha iyi olduğunu bulmuşlardır. 2013), Ceratonia siliqua yaprak ekstraktını kullanarak sulu gümüş nitrat çözeltisi ile gümüş nanopartiküllerinin (AgNP'ler) yeşil bir sentezini yaptı. Antibakteriyel aktivite disk difüzyon ve MIC yöntemiyle belirlendi ve Escherichia coli bakteri suşu kullanıldı. Coli mikrobiyal büyümesinin AgNP konsantrasyonundan bağımsız olduğunu ve Ceratonia siliqua yaprak ekstraktı kullanılarak sentezlenen AgNP'lerin standart antibiyotiklerden daha güçlü aktiviteye sahip olduğunu buldular. 2014) yaptıkları çalışmada Psidium guajava bitkisini kullanarak yeşil sentez yöntemini kullanarak AgNP'leri sentezlemişler ve AgNP'leri UV-vis spektroskopisi, TEM, XRD ve EDX kullanarak karakterize etmişlerdir.
AgNP'lerin karakterizasyonunu belirlemek için UV-vis spektroskopisi, TEM, XRD, XPS (X-ışını fotoelektron spektroskopisi) ve DLS (dinamik ışık saçılımı) ile belirlendi. Sentezlenen AgNP'lerin karakterizasyonu UV-vis spektroskopisi, SEM, EDX, XRD, FT-IR ve TEM ile belirlendi. Mevcut araştırma verileri, yeşil sentezlenen AgNP'lerin kanser tedavisinde alternatif tıp olarak değerlendirilebileceğini göstermiştir. Metanol ekstraktı kullanarak AgNP'lerin yeşil sentezini yaptılar.
AgNP'lerin antibakteriyel aktivitesi, bir agar kuyusunda difüzyon yöntemiyle ve test patojenleri olarak Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Citrobacter sp., Salmonella typhi ve Bacillus cereus bakteri suşları kullanılarak belirlendi. Bu sonuç, onu ısıya dayanıklı nanoürünlerin üretimi ve diğerlerinin yanı sıra nanokateterler gibi tıbbi cihazların üretiminde antibakteriyel madde olarak kullanım için umut verici bir nanomateryal haline getirecektir. 2019) yaptıkları çalışmada Berberis vulgaris'in yapraklarını ve kök kısımlarını kullanarak AgNP'lerin yeşil sentezini yaptılar.
MATERYAL VE YÖNTEM
Materyaller
- Bitki Materyali
- Kimyasal Maddeler ve Ekipmanlar
- Bitki Örneği ve Ekstraktının Hazırlanması
- Yeşil Sentez Yöntemiyle AgNP’ lerin Biyolojik Sentezi
- Sentezlenen AgNP’lerin Karakterizasyonu
Bakterilerin optik yoğunluk (OD) değerlerinin ölçülmesi, mikroorganizmaların absorpsiyon ölçümü, antibiyofilm ile ilgili ölçümler ve sentezlenen AgNP'lerin absorpsiyon ölçümü amacıyla kullanıldı. Biobase sterilizasyonu gerektiren tüm çalışmalarda (bakteri kültürü hariç), kontaminasyon riskini en aza indirmek için laminer kabin kullanıldı. Mikroplate Thermo Scientific, bitki ekstraktının ve sentezlenen AgNP'nin seyreltik konsantrasyonlarının antimikrobiyal, antibiyofilm ve antikanser aktivitelerini araştırmak için kullanıldı.
Şırınga, eşit miktarda sıvı Ayset besiyeri ortamını cam tüplere yerleştirmek ve bitki ekstraktını filtrelemek için kullanıldı. Bu çalışmada bitki ekstraktının ve sentezlenen AgNP'lerin antimikrobiyal ve antibiyofilm aktiviteleri 15 bakteri türü üzerinde test edilmiştir (Tablo 3.3). Manyetik ısıtıcı da 4-5 saat ekstraksiyon işlemine tabi tutuldu ve süre sonunda filtre kağıdı kullanılarak süzüldü.
Yeşil sentez yöntemiyle sentezlenen AgNP'lerin karakterizasyonunu belirlemek için UV-vis spektroskopisi, XRD (X-ışını kırınımı), SEM (taramalı elektron mikroskobu) ve FT-IR (Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi) kullanıldı. FT-IR analizinde AgNP'lerin biyolojik olarak indirgenmesinden ve stabilizasyonundan sorumlu moleküllerde yapının aromatik veya alifatik olmasına bakılmaksızın farklı fonksiyonel grupların varlığını, yapıdaki bağların durumunu ve bağlanma yerlerini belirledik. .
Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi
- Disk Difüzyon Yöntemi
- Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu (MİK)
- Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBK)
- İstatistiksel Analiz
- Hücre Kültürü
- MTT Yöntemi
- İstatistiksel Analiz
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Üniversite-Sanayi-Kamu İşbirliği Uygulama Geliştirme ve Araştırma Merkezi (USKİM) tarafından hizmet alımı olarak inşa edilmiştir. A) AgNP B) Bitki ekstraktı C) (Pozitif kontrol). Bakteriler 37oC sıcaklıktaki inkübatörde 16-18 saat bekletildi ve süre sonunda cetvel yardımıyla disklerin çevresinde oluşan inhibisyon zonunun çapları ölçüldü. Çalışma AgNP'ler ve bitki ekstraktı için üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiş ve sonuçların aritmetik ortalaması ve standart sapmaları hesaplanmıştır.
96 kuyucuklu mikroplakada 48 saat 37°C'de inkübe edilen bakterilerin tamamı, süre tamamlandıktan sonra tamamen tükendi ve tüm kuyucuklara dH2O eklenerek kuyucuklar 2-3 kez yıkandı. Daha sonra kuyucuklara 125 µl %0,1 kristal viyole solüsyonu eklenerek 10 dakika oda şartlarında bekletildi ve bu süre tamamlandığında mikroplaka dH2O ile 2-3 kez yıkanarak kurumaya bırakıldı. 80 °C'de dondurulmuş hücre çizgilerinin çözülmesine izin verildi ve ardından MCF-7 hücre çizgisi için %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin ve %1 insülin içeren DMEM ve MCF-7 hücre dizisi için DMEM, %10 FBS ve %1 penisilin içeren DMEM. HUVEC hücre çizgisi. / hızla streptomisin içeren şahin tüplerine alındı.
Mikroskop altında hücrelerin şişe yüzeyinden ayrıldığı belirlendikten sonra yaklaşık 3 ml tamamlanmış medyum içeren steril bir şahine aktarıldı ve 1000 rpm'de 5 dakika santrifüj edildi. Daha sonra, 96 oyuklu mikroplakaların her bir oyuğuna 10 hücre/ml ve 24 saat boyunca 37°C'de %5 CO eklendi.
ARAŞTIRMA BULGULARI
Ekstrakt ile Gümüş Nanopartiküllerin Sentez ve Karakterizasyonu
- Disk Difüzyon Sonuçları
- Minimum İnhibisyon Konsantrasyon (MİK) Sonuçları
- Minimum Bakterisidal Konsantrasyon (MBK) Sonuçları
Yeşil sentez yöntemiyle sentezlenen AgNP'nin boyutunu, faz tanımlamasını ve kristal yapısını analiz etmek için XRD (X-Işını Kırınımı) kullanıldı. Görüntüleme sonucunda biyolojik AgNP'nin küresel boyutta ve yaklaşık 32,56 nm boyutunda olduğu belirlendi. AgNP'nin 200 nm görüntü kalitesinde SEM'de alınan bitki ekstraktı ile hazırlanan nanopartikül oluşumu Şekil 4.3'te gösterilmektedir.
Çalışmada elde edilen bitki ekstraktı ile sentezlenen yeşil AgNP'nin FTIR spektrumlarına göre anlamlı ve beklenen farklılıkların olduğu görülmüştür (Şekil 4.4). Biyolojik olarak sentezlenen AgNP, 0,12 mg/ml konsantrasyonda test edilen mikroorganizmalardan biri olan Salmonella infantis'e karşı minimal bir inhibitör etki göstermiştir. Biyolojik olarak sentezlenen AgNP'nin Salmonella infantis'i %99,9 oranında inhibe eden en düşük bakterisidal konsantrasyonu 0,25 mg/ml olarak belirlendi.
Salmonella enteritidis ATCC 13075'i %99,9 oranında inhibe eden, biyolojik olarak sentezlenmiş AgNP'nin en düşük bakterisidal konsantrasyonu 0,06 mg/ml olarak ve Pseudomonas aeruginosa DSMZ 50071 ve Listeria innocua bakteri suşlarına karşı 0,12 mg/ml olarak belirlendi. Tablo 4.4 ve Tablo 4.5'te bitki ekstraktı ve AgNP'lerin farklı konsantrasyonlarda test mikroorganizmalarına karşı anti-biyofilm etkisinin sonuçlarına bakıldığında, S.
Antikanser Aktivite Sonuçları
Yeşil sentezlenen AgNP'nin IC50 değeri MCF-7 hücre hattı için 0,06 µg/ml iken, bitki ekstraktının IC50 değeri 6,91 µg/ml'dir. 10-3 µg/ml olup bu değerle karşılaştırıldığında 10-4 ve 10-5 µg/ml konsantrasyon değerlerinin daha az sitotoksik etkiye sahip olduğu görülmüştür. HUVEC hücre hattı için sentezlenen yeşil AgNP'nin IC50 değeri 0,04 µg/ml iken, bitki ekstraktının IC50 değeri 18,4 µg/ml'dir.
İstatistiksel Analiz Sonuçları
Bitki ekstraktının antibiyofilm oluşumunda mikroorganizmalardan elde edilen verilerden elde edilen tanımlayıcı istatistik bulgularına göre, S.aureus, S.epidermidis ve E.coli suşlarında varyans düşük, diğer suşlarda ise daha yüksek varyanslar elde edilmiştir. . . Bitki ekstraktının antibiyofilm oluşumunda mikroorganizmalardan elde edilen verilerin Pearson korelasyon testi bulgularına göre; Çalışmada uygulama yüzdeleri ile suşlar arasında incelendiğinde, S. Çalışmada sadece 1 mg/ml uygulama ile p<0,05 dozunda 0,0625 mg/ml (p=0,888) uygulama arasında anlamlı korelasyon olduğu tespit edildi. .
TARTIŞMA
Ayrıca AgNP'nin disk difüzyon sonuçlarına etkisinin olmamasının sebebinin nanopartiküllerin suda çözünmemesi ve diskler tarafından absorbe edilmemesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Sonuçlara göre bitki-AgNP kompleksinin MCF-7 ve HUVEC hücre hatlarında en düşük konsantrasyon değeri 10-3 µg/ml olarak belirlendi. AgNP'lerin karakterizasyonu UV-vis spektroskopisi, SEM, FT-IR, XRD ve atomik absorpsiyon spektroskopisi ile gerçekleştirildi.
Çalışmamıza göre yeşil sentez yöntemiyle hazırlanan AgNP'lerin UV-vis spektrumu 426 nm'de yüzey plazmon rezonansı vermiş ve nanopartiküllerin ortalama boyutu Debye-Scherrer formülüne göre 32,56 nm olarak hesaplanmıştır. Çalışmamıza göre sentezlenen AgNP'nin 15 farklı test mikroorganizmasına karşı MİK değerleri mg/ml arasında gözlenirken MBK değerleri 0,03-0,25 mg/ml arasında değişmektedir. Biyosentezlenen AgNP'lerin MCF-7 hücre hattında test edilen 10-9 µg/ml konsantrasyonları arasında en düşük konsantrasyon değeri 10-3 µg/ml olarak belirlenirken, diğer konsantrasyonlarda sitotoksik aktivite daha az gözlendi.
HUVEC hücre hattına uygulanan 10-3, 10-4 ve 10-5 µg/ml AgNP ve bitki ekstraktı konsantrasyonları kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, kullanılan AgNP konsantrasyonlarında belirlenen en düşük değer 10-3 µg/ml oldu. ml. Gelecek çalışmalarda hem bitki ekstraktlarının hem de AgNP'lerin farklı kanser türleri üzerindeki etki mekanizmasının aydınlatılması için moleküler düzeyde çalışmalara ihtiyaç vardır.
SONUÇLAR VE ÖNERİLER
KAYNAKLAR
Facile green synthesis of silver nanoparticles using aqueous extract of Berberis vulgaris leaves and roots and its antibacterial activity. Green synthesis of silver nanoparticles using oak fruit husk extract (jaft): synthesis and in vitro cytotoxic effect on MCF-7 cells. Waste grass-mediated green synthesis of silver nanoparticles and evaluation of their anticancer, antifungal and antibacterial activity.
Green synthesis of silver nanoparticles using Hydnocarpus pentandra leaf extract: In-vitro cytotoxicity studies against MCF-7 cell line. Synthesis of silver nanoparticles using Acalypha indica leaf extracts and its antibacterial activity against waterborne pathogens. Green synthesis, characterization and antibacterial activity of silver nanoparticles from Malus domestica and its cytotoxic effect on cell line (MCF-7).
Synthesis of silver nanoparticles using Solanum trilobatum fruit extract and its antibacterial, cytotoxic activity against human breast cancer cell line MCF-7. Green synthesis of silver nanoparticles using Argemone mexicana leaf extract and evaluation of their antimicrobial activities.
