REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE MOLEKÜLER KLONLAMA

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE MOLEKÜLER KLONLAMA

Bazen iyi bir fikir, siz onu aramadığınızda aklınıza gelir. 1983 yılının Nisan ayının bir cuma akşamında rastlantıların, saflığın ve şanslı hataların oluşturduğu olasılıksız bir kombinasyonla, arabamın direksiyonunu kavramış olarak Kuzey Kaliforniya’nın kızılağaç kırsalındaki mehtaplı dağ yolunda ilerlerken, bana böyle bir ilham geldi. O ilham ise günümüzde polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) olarak bilinen, genlerin sayısız kopyasını yapabilecek bir prosesi nasıl tesadüfen bulmamdır.

Kary B. Mullis, Scientific American (1990) 262:36.

8.1. Giriş

Öncelikli olarak bakteriyofaj lamda () üzerinde çalışan birkaç araştırma grubunun çabalarıyla, 1972-1975 yılları arasında çok sayıdaki farklı deneysel gözlemlerin sonuçları rekombinant DNA teknolojisinde birleştirilmiştir. Bu alanın tarihi, nihayetinde araştırmacıların kullanımı için mevcut olan çok sayıdaki aracın gelişmesiyle sonuçlanmış önemli keşifler açısından oldukça zengindir.

Bugün, moleküler biyoloji teknolojilerinin çoğunun olmazsa olmazı ise gendir. Gen çalışmalarını kolaylaştırmak için, genler izole edilmeli ve çoğaltılmalıdır. İlgilenilen bir genin izolasyonu ve çoğaltılması (amplifikasyonu) için kullanılan metotlardan biri, bu genin aracı ya da vektör olarak adlandırılan ve canlı hücrelerde replike olabilen, bir başka DNA molekülü içerisine sokularak (insört edilerek) klonlanmasıdır. Değişik orijinlerden gelen iki DNA’nın birleştirilmesiyle oluşan sonuç ise rekombinant DNA molekülüdür. Krossing-over (çapraz- geçiş) gibi genetik işlemler de teknik olarak rekombinant DNA üretmesine rağmen, bu terim BAŞLIKLAR

 8.1. Giriş

 8.2. Rekombinant DNA teknolojisinin başlangıcı

 8.3. DNA’nın kesilmesi ve eklenmesi

 8.4. Moleküler klonlama

 8.5. Kütüphanenin taranması ve proplar

 8.6. Restriksiyon haritalama ve RFLP analizi

 8.7. DNA dizileme

PZR’nin en gerekli malzemesi olan Taq polimeraz, Yellowstone sıcak su pınarında yaşayan Thermophilus aquaticus mikroorganizmasından izole edilmiştir. (Resim © 2005 James H. Bassett).

genellikle farklı biyolojik kaynaklardan elde edilen DNA segmentlerinin eklenmesi ile türetilen DNA molekülleri için kullanılmaktadır. Rekombinant DNA molekülü, ya ökaryotik ya da prokaryotik bir konak hücreye yerleştirilir. Bu konak hücre ise bir klon üretmek üzere replike olurken, yabancı DNA parçasını barındıran vektör de replike olur. Böylece yabancı DNA sayısal olarak çoğaltılmış olur ve ardından da daha ileri analizler için saflaştırılabilir. Bu bölüm, rekombinant DNA teknolojisinin nasıl ortaya çıktığını ve moleküler biyologların, bu güçlü araçları nerede ve nasıl kullandıklarını açıklamaktadır.

8.2. Rekombinant DNA teknolojisinin başlangıcı

Gen klonlamanın henüz daha keşfedilmediği 1960’ların başlarında, gen çalışmaları çoğunlukla bakteriyofajların bakteriyel genleri kendi genomlarına yerleştirebilme (inkorpere etme) yetenekleri gibi, dolaylı ya da tesadüfi keşiflere dayanıyordu. Örneğin, Lac represörünün özgül olarak DNA’nın lac operatörüne bağlandığını göstermek için, genomuna lac operatörü yerleştirilmiş olan phi 80 fajının bir suşu kullanılmıştır. Genlerin nasıl düzenlendiği konusunda çığır açan bu buluş, Bölüm 10’da tartışılmaktadır. Şimdi, laboratuvarda DNA’yı manipüle edebilmek için gerekli araçların geliştirilmesinde moleküler biyologlara yol göstermiş olan bakteriyofajlardan elde edilen bazı bulgulara odaklanalım.

Bakteriyofaj lamda (λ)’nın yapışkan uçlarından öğrendiklerimiz

1962’de, Allan Campbell, bakteriyofaj λ’nın lineer olan genomunun konak bakteri hücresine girdiğinde dairesel hale geldiğini belirtmiştir. Daha sonra ise rekombinasyon —kırılma ve yeniden eklenme— olayı ile faj DNA’sı konak kromozomuna sokulmaktadır. Daha ileri düzeydeki analizler ise lamda fajının lineer olan genomunun her iki ucunda, kısa tek-zincirli DNA bölgelerinin bulunduğunu ve bu iki bölgenin baz dizilerinin ise birbirine komplementer olduğunu göstermiştir. Bu tek-zincirli bölgeler “yapışkan” (cos) bölgeler olarak adlandırılmaktadır (Şekil 8.1). Lamda faj genomumun uçlarındaki cos bölgelerinin komplementer baz eşleşmesi yapması, lineer olan faj genomunun konak bakteride dairesel hale gelmesine izin vermektedir. Lizogenik replikasyon fazında ise faj DNA’sı, fajda ve bakteriyel kromozomda bulunan eklenti (att) bölgelerinden gerçekleşen rekombinasyonla konak genomuna yerleşmekte ve konak DNA’nın bir parçası gibi replike olmaktadır. Konak hücrenin mutajenik kimyasallara ya da UV radyasyonuna maruz kalması gibi, belirli koşullar altında ise bu rekombinasyon olayının tersi gerçekleşmekte ve faj DNA’sı konak genomundan kesilip çıkarılmaktadır. Faj DNA’sının konak genomundan kesilerek çıkarılması (eksizyon) esnasında, ender olarak da olsa farklı bölgelerden gerçekleşen kesimler,  fajının bakteriyel genleri almasını sağlar. Fajın yaşam döngüsünün litik fazında ise genomlarına bakteri genlerini yerleştirmiş olan faj λ dölleri, parçalanmış olan E. coli’den ortama salınırlar.

“Yapışkan uçlar” aracılığıyla DNA segmentlerinin eklenmesi fikri, genetik mühendisliğinin gelişmesinde yol gösterici bir prensip olmuştur. Bakterilerdeki restriksiyon ve modifikasyon sistemlerinin moleküler karakterizasyonundan kısa bir süre sonra, özgül DNA parçalarında yapışkan uçların oluşturulmasını sağlayan ideal mühendislik araçlarının ise restriksiyon endonükleazlar formunda doğada zaten hazır olduğu açık hale gelmiştir.

Bakteriyel modifikasyon ve restriksiyon sistemlerinden öğrendiklerimiz

Başlangıçta, “restriksiyon ve modifikasyon” olarak adlandırılan bir fenomen, Salvador Luria ve fajlarla çalışan diğer araştırmacıların ilgisini çekmiştir. Bir bakteriyel konak içerisinde büyüyebilen fajlar, genellikle başka bir bakteriyel suş içerisinde büyüyemiyordu; bu fajlar

“kısıtlanıyorlardı”. Buna rağmen, ender de olsa bazı faj dölleri ise bu restriksiyon (kısıtlama) sisteminden kaçabiliyordu. Bu fajlar kısıtlayıcı (restriktif) konakta birkez çoğalınca, bir şekilde

“modifiye” olmakta ve bu konakta normal şekilde çoğalabilmektedirler. Tüm döngünün tekrar edilebilmesi ise bu modifikasyonun geri dönüşümsüz olduğuna işaret etmiştir. Restriksiyon ve modifikasyonun moleküler esası ise 1962 yılında Werner Arber ve arkadaşaları tarafından tanımlanmıştır.

Restriksiyon sistemi: λ faj DNA’sının kısıtlayıcı konak bakteri içinde parçalandığının gösterilmesinden sonra, Arber ve arkadaşları bu restriktif ajanın, DNA’nın yerli mi yoksa yabancı mı olduğunu ayırt edebilme yeteneğinde olan bir nükleaz olduğunu öne sürmüşlerdir.

Arber ve arkadaşlarının bu hipotezinden 6 yıl sonra, Matt Meselson ve Bob Yuan tarafından böyle bir nükleaz E. coli K-12 suşunda biyokimyasal olarak karakterize edilmiştir. Saflaştırılmış enzim, λ C-modifiye DNA’yı 5 parçaya ayırmış fakat λ K-modifiye DNA’ya saldırmamıştır.

Restriksiyon endonükleazlar —kısaca restriksiyon enzimleri adıyla da bilinmektedirler— istilacı nükleik asitleri parçalayarak, viral enfeksiyonu sınırladıkları veya engelledikleri için bu şekilde adlandırılmışlardır.

Modifikasyon sistemi: O zamanlarda, bakteriyel DNA’nın sınırlı sayıdaki bölgelerine metil gruplarının eklendiği bilinmekteydi. Hepsinden önemlisi de metil gruplarının lokasyonlarının bakteri türleri arasında farklılık göstermesiydi. Arber ve arkadaşları ise modifikasyonun, DNA üzerinde bulunan ve restriksiyon endonükleazların saldırısına duyarlı olan bölgelere metil gruplarının eklenmesinden ibaret olduğunu göstermeyi başarmışlardır. E. coli’de adenin metilasyonu (6-metil adenin) ise sitozin metilasyonundan (5-metil sitozin) daha yaygındır.

Metil-modifiyeli hedef bölgeler ise artık restriksiyon endonükleazlar tarafından tanınamamakta ve böylece DNA da parçalanamamaktadır. Metil-modifikasyonu bir kez oluştuktan sonra, metilasyon motifi (deseni) replikasyon boyunca muhafaza edilmektedir. Konak DNA’sı replike olduğunda, eski zincir metilli kalırken, yeni zincir metilsizdir. Bu yarı-metilli durumda, yeni zincir hızlı bir biçimde özgül metilazlar tarafından metillenir. Bunun aksine, metillenmemiş veya konak hücre DNA’sından farklı bir motifde metillenmiş yabancı DNA ise restriksiyon endonükleazlar tarafından parçalanır.

Şekil 8.1. Bakteriyofaj lamdanın (λ) yapışkan uçları. E. coli konak hücresinde, lamda faj genomunun yapışkan uçları birleşerek dairesel hale gelmektedir. Lizojenik replikasyon fazında ise faj DNA’sı, Att bölgelerinden konak genomuna yerleştirilir. Eksizyon (kesip çıkarma) sırasında ise faj λ, bazen bakteriyel genleri de alır. Fajın hayat döngüsünün litik fazında ise genomuna bakteri genleri yerleşmiş olan λ fajları, E. coli hücresinin parçalanmasıyla ortama salınırlar.

Bu restriksiyon ve modifikasyon sistemlerinin nasıl çalıştığını anlamak için, özgül bir örneğe bakalım. E. coli K-12 konak suşu, faj λK tarafından enfekte edildiğinde ne olur? E.

coli’nin standart bir suşu olan K-12, birçok moleküler çalışmada kullanılmaktadır. Şekil 8.2A’da da görüldüğü gibi, E. coli konak genomu ile aynı metilasyon motifine sahip

olduğundan, bu faj DNA’sı yabancı olarak algılanmamaktadır. Faj DNA’sı replike olduğunda ise metilasyon motifinin korunmasını sağlamak amacıyla, yeni replike olan DNA özgül bir metilaz tarafından modifiye edilir. Metillenmiş DNA, restriksiyon endonükleazlar tarafından parçalanamamaktadır, bunun sonucu olarak da faj K dölleri üretilebilmektedir.

Şekil 8.2. Bakterilerde restriksiyon ve modifikasyon sistemleri. Restriksiyon endonükleazlar ve bunların karşılığı olan metilazlar, bakterileri bakteriyofaj enfeksiyonuna karşı korumaktadır. (A) Modifikasyon. (B) Restriksiyon.

λ fajı, E. coli’nin C suşunda (λC) büyütülür ve daha sonra da K-12 suşunu enfekte etmek için kullanılırsa ne olur? Şekil 8.2B’de görüldüğü gibi, E. coli K-12 konak suşu faj λC tarafından enfekte edildiğinde, faj λC DNA’sının metilasyon motifi konak genomunun metilasyon motifi ile aynı olmadığından, faj λC DNA’sı yabancı olarak algılanmaktadır. Faj λC DNA’sı özgül bir restriksiyon endonükleaz tarafından kırılmakta ve faj λC dölü

üretilmemektedir. Elbette, nadiren de olsa, bazı faj dölleri bu restriksiyondan kaçabilmekte ve böylece döngü devam etmektedir.

İlk klonlama denemeleri

Hamilton Smith ve arkadaşları, restriksiyon endonükleazların özgül bir DNA dizisini kırdığını kesin olarak göstermişlerdir. Daha sonra, Daniel Nathans ise Simian 40 virüsünün (SV40) genom haritasını çıkarmak ve replikasyon orijininin yerini belirlemek için restriksiyon endonükleazları kullanmıştır. Bu büyük keşifler, DNA çalışmaları için restriksiyon endonükleazların ne kadar önemli olduğunu göstermiştir. Bu araştırmacıların keşiflerinin üzerine, Herbert Boyer, Stanley Cohen, Paul Berg ve arkadaşlarının 1970’lerin başında inşa ettikleri klonlama denemeleri ise rekombinant DNA teknolojisi çağını başlatmıştır.

Tasarlanan ilk rekombinant DNA moleküllerinden biri, λ fajı ile SV40 memeli DNA virüs genomunun oluşturduğu bir hibrit olmuştur. 1974’te ilk ökaryotik gen klonlanmıştır. Bir Güney Afrika kurbağası olan Xenopus laevis’den elde edilen ve çoğaltılan ribozomal RNA (rRNA) genleri veya “ribozomal DNA” (rDNA), bir restriksiyon endonükleaz ile kesilmiş ve bakteriyel bir plazmide eklenmiştir. O zamanlarda rDNA’nın çok iyi karakterize edilmiş olması ve CsCl- gradiyent santrifügasyonu ile kolaylıkla ve çok miktarda izole edilebiliyor olması nedeniyle, ökaryotik DNA kaynağı olarak çoğaltılmış rDNA kullanılmıştır. Kurbağanın oositleri içinde, ekstrakromozomal bir nükleolar halkadan dönen daire mekanizmasıyla rDNA seçici olarak çoğaltılmıştır (bkz. Şekil 6.23B). Oositteki rRNA genlerinin sayısı ise aynı organizmanın somatik hücrelerindeki rRNA genlerinin sayısından 100 ila 1 000-kat daha fazladır. Bilim dünyasında heyacan uyandıran bir olay olarak, klonlanan kurbağa genleri aktif olarak E. coli’de rRNA’ya transkribe edilmiştir. Bu da göstermiştir ki hem ökaryotik hem de prokaryotik DNA’yı içeren rekombinant plazmidler, E. coli’de kararlı olarak replike olabilmektedirler.

Böylece, gen mühendisliği, rekombinant DNA çalışmalarının güvenliği üzerinde geniş çaplı şüphelere yol açan bir beceriyle, doğal çevrede asla bulunmayan yeni gen kombinasyonlarını üretebilir hale gelmiştir (bkz. Odak Kutusu 8.1).

ODAK KUTUSU 8.1

Rekombinant DNA korkusu

İlk klonlama denemelerinin ardından, rekombinant DNA çalışmalarının muhtemel tehlikeleri üzerine hem bilim adamlarının hem de halkın kaygıları bulunmaktaydı. Bu kaygıların odak noktasını ise daha çok

“doğayla oynamanın” etik olup olmadığı ve genetiği değiştirilmiş patojenik bakterilerin kontrollü bir laboratuvar ortamından çevreye kaçma ihtimali oluşturmaktaydı. Bu korkulardan biri de klonlanmış tümör virüs DNA’sını barındıran E. coli’nin insanlara transfer olabileceği ve küresel bir kanser epidemisini tetikleyebileceği olmuştur. Bu korkular ise herkes tarafından paylaşılmamıştır. 1993’te basılan Genetik ve Toplum (Genetics and Society) adlı kitapta ise James Watson, kendisine ait bölümde şöyle yazmaktadır:

Şeytan diyordu ki, Tüm Risk Kataloğu (Whole Risk Cataloque) adında bir kitap hazırla. Bu kitap, yaşlılar, gençler ve benzeri kişiler için olan riskleri içermeliydi. Kitap, yarı-paranoyak toplumumuzda oldukça popüler

olurdu. “D” harfi altına; dinamitleri, doktorları, dieldrini (bir insektisit), DNA’yı ve köpekleri (dog) koymalıydım.

Köpeklerden daha çok korktuğumu itiraf etmeliydim. Fakat herkesin endişeleneceği kendi korkuları vardır.

1975’te San Francisco yakınlarındaki Asimolar Konferans Merkezi’nde önemli bir toplantı yapıldı.

Bu toplantıya 100’ün üzerinde moleküler biyolog katıldı. Bu toplantıdan çıkan öneriler, Ulusal Sağlık Enstitüsü [National Institutes of Health (NIH)] tarafından geliştirilen resmi bir rehber için alt yapı oluşturmuştur. Zaman geçtikçe, rekombinant DNA teknolojisinin bir sonucu olarak herhangi bir felaket meydana gelmemiş ve çoğu bilim adamı, kurallara uyulduğu sürece, rekombinant DNA teknolojisinin insan sağlığı ve çevre için herhangi bir risk oluşturmadığı sonucuna varmıştır. Önlemler düzgün bir şekilde işlemekte ve genetiksel olarak tasarlanmış bakteriler ve vektörler doğal şartlarda çok zayıf kalmaktadırlar.

Günümüzde, rekombinant DNA moleküllerinin ve organizmalarının yer aldığı çalışmalar, NIH tarafından yayımlanan Rekombinant DNA Moleküllerini İçeren Araştırmalar İçin NIH Rehberi’ne (NIH Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules) uygun olarak yürütülmek zorundadır.

Bu rehberde düşükten yükseğe doğru 4 risk seviyesi tanımlanmıştır. Bu 4 risk seviyesi için önlemler (tehlikeli organizmaların kaçışına karşı biyolojik ve fiziksel engeller) ana hatları ile belirtilmiştir. Yüksek oranda enfeksiyon meydana getiren ajanlar ile ilgili deneyler ve ciddi ve ölümcül insan hastalıklarına sebep olan toksinler, en yüksek risk seviyesine alınmıştır. Bu hastalıklar için önleyici ya da tedavi edici müdahaleler mevcut değildir. Önlemler arasında laboratuvarlardaki negatif basınçlı hava kilitleri yer almakta ve deneyler, filtreli ya da egzos gazının yakıldığı laminar-akım kabininde (laminar-flow hood) gerçekleştirilmektedir. Moleküler biyolojide rutin olarak kullanılan E. coli’nin patojenik-olmayan suşları gibi bakteriler “Risk Grubu 1” ajanları olup, yetişkin insan sağlığını tehdit etmemektedirler. Rekombinant DNA çalışmalarında kullanılan standart vektörler ise rekombinant DNA’nın laboratuvar dışına yayılma ihtimalini azaltacak şekilde dizayn edilmişlerdir.

Günümüzde ise korkuların çoğu, teknolojinin kendisinden ziyade, rekombinant DNA teknolojisinin tarım, ilaç ve biyoterörizm alanlarındaki uygulamaları üzerinde yoğunlaşmaktadır. Örneğin, bu korkular arasında, marketlerde yer alan genetiği değiştirilmiş gıdaların güvenilirliliği, herbisit dirençlilik genlerinin transgenik tahıl bitkilerinden yabani otlara (zararlı) geçmesi, gen tedavisinin ögenik (suni insan seçilimi) için kullanımı ve rekombinant DNA tasarımlı silahların yapımı yer almaktadır. Rekombinant DNA tasarımlı silahların yapımı ise daha virülent, antibiyotiğe dirençli ve çevresel olarak daha kararlı enfektif mikropların tasarlanmasını ifade etmektedir. 13 Aralık 2002’de “U.S. Public Health and Security and Bioterrorism Preparedness and Response Act of 2002” adında yeni federal düzenlemeler yayımlanmıştır (http://www.fda.gov/oc/bioterrorism/bioact.html). Düzenlemeler ise potansiyel biyoterör ajanları olarak değerlendirilen Yersinia pestis (veba), Bacillus anthracis (şarbon) ve variola virüsü (çiçek) gibi bazı ajanların bulundurulması, kullanımı ve transferi ile ilgilidir.

8.3. DNA’nın kesilmesi ve eklenmesi

DNA izolasyonu ve rekombinant DNA yapımında iki ana enzim kategorisi oldukça önemli araçlardır: restriksiyon endonükleazlar ve DNA ligazlar. Restriksiyon endonükleazlar ise restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan, çift-zincirli DNA molekülü üzerindeki oldukça kısa ve özgül olan baz dizilerini tanırlar ve enzimin tipine bağlı olarak, DNA’yı bu tanıma bölgelerinden veya başka yerden kırarlar. DNA ligaz ise fosfodiester bağları oluşturarak iki DNA parçasını birbirine ekler.

Restriksiyon endonükleazların temel sınıfları

Restriksiyon endonükleazların üç büyük sınıfı vardır. Bu enzimlerin sınıflandırılmasında temel olarak, tanıdıkları dizilerin türü, DNA’yı kesme biçimleri ve enzimin yapısı dikkate alınmaktadır. Tip I ve tip III restriksiyon endonükleazlar, DNA’yı tanıdıkları bölgelerin dışından da kesmeleri ve bunun sonucu olarak da tesadüfi kesme motifleri oluşturduklarından, gen klonlama çalışmaları için kullanışlı değildirler. Bunun aksine, tip II restriksiyon endonükleazlar ise özgül dizileri tanıdıkları ve sadece bu dizilerden kesim yaptıkları için, haritalama ve in vitro DNA inşasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Tablo 8.1). Ayrıca, tip II endonükleaz ve metilaz aktiviteleri, genellikle birbirinden ayrı tek alt-birimli enzimlerdir.

Her ne kadar bu iki enzim aynı hedef diziyi tanısa da, bu enzimler birbirlerinden ayrı olarak saflaştırılabilirler. Tip II restriksiyon endonükleazların bazıları ise bu dar tanımlamaya uymamakta, bu yüzden de tip II enzimlerini daha ileri alt-gruplara ayırmak gerekmektedir.

Burada ise moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılan “uygun” tip II restriksiyon endonükleazlar tartışılacaktır.

Tablo 8.1. Restrikisiyon endonükleazların ana sınıfları.

Sınıf Yaygınlığı Tanıma bölgesi İçeriği

Rekombinant DNA araştırmalarında

kullanımı Tip I Tip II’den

daha az yaygın

Tanıma bölgesinin >1.000 bç’den daha uzağında özgül- olmayan bölgeden her 2 zinciri de keser

Üç alt-birimli kompleks:

bireysel tanıma, endonükleaz ve metilaz aktiviteleri

Kullanışlı değildir.

Tip II En yaygını Özgül tanıma bölgesinden (4-8 bç), genellikle palindromiktir, her 2 zinciri keser.

Endonükleaz ve metilaz aktiviteleri ayrıdır, tek alt- birimlidirler.

Çok kullanışlıdır.

Tip III Nadir Tanıma bölgesinin 3’ ucunun yaklaşık 24-26 bç aşağısından, zincirlerden sadece birini keser.

Endonükleaz ve metilaz aktiviteleri bir alt-birimi ortak olan, ayrı 2 alt- birimli komplekstir.

Kullanışlı değildir.

Restriksiyon endonükleazların isimlendirilmesi, harf ve rakamlardan oluşan bir sistemle, keşfedildikleri organizmaların adına uygun olarak yapılmaktadır. Örneğin, HindIII, Haemophilus influenza (d suşu)’dan elde edilmiştir. Bu isimlendirmede Hin, organizmanın cins isminin ilk harfi ile tür isminin ilk 2 harfinden; d ise suş tipinden gelmektedir; III ise bu enzimin, bu organizmada keşfedilen 3. enzim olduğunu göstermektedir. SmaI, Serretia marcescens’den;

EcoRI, Escherichia coli (R suşu)’den ve BamHI ise Bacillus amyloliquefaciens (H suşu)’den elde edilmiştir. Bugüne kadar 3.000’in üzerinde Tip II restriksiyon endonükleaz izole edilerek karakterize edilmiştir. Moleküler biyologların kullanımı amacıyla, 250’den fazla tip II restriksiyon endonükleaz ise ticari olarak bulunmaktadır.

Tip II restriksiyon endonükleazların tanıma dizileri

Her uygun tip II restriksiyon endonükleaz, homodimer oluşturan özdeş 2 polipeptid alt- biriminden meydana gelir. Bu homodimerler 4-8 baz çiftinden (bç) meydana gelen, kısa ve simetrik DNA dizilerini tanırlar. Moleküler biyoloji araştırmalarında en çok kullanılanı ise altı- baz-çifti kesicileridir. Genellikle, bir zincirin 5’→3’ yönündeki dizi okuması ile komplementer

zincirin 5’→3’ yönündeki dizi okuması aynıdır. Her iki yönden de aynı okunan diziler

“palindrom” olarak adlandırılmaktadır (Yunanca’da “geri koşmak” anlamındaki palindromos kelimesinden gelmektedir). Şekil 8.3, yaygın olan bazı restriksiyon endonükleazları ve bunların tanıdıkları dizileri göstermektedir. EcoRI gibi bazı enzimler, asimetrik (zigzaglı) kesim yaparlar. Asimetrik kesimin oluşturduğu tek-zincirli komplementer uçlar ise diğer DNA fragmentlerinin tek-zincirli komplementer kuyruklarına hidrojen-bağı ile bağlanabildikleri için

“yapışkan” ya da “kohezif uçlar” olarak adlandırılırlar. Şayet, değişik kaynaklardan elde edilen DNA molekülleri aynı palindromik tanıma dizilerine sahipse, aynı restriksiyon endünükleaz ile kesildiklerinde her iki DNA’da komplementer yapışkan uçlara (tek-zincirli kuyruklara) sahip olacaklardır. SmaI gibi diğer tip II enzimler ise DNA’nın her iki zincirini de aynı pozisyondan keser (simetrik kesim). Bunun sonucu olarak da DNA’nın kesilen uçlarında eşleşmemiş nükleotidler bulunmadığından “küt uç” oluşumuna yol açar.

Restriksiyon endonükleazların enzimatik reaksiyonlarında sergiledikleri dizi özgüllüğü, Lac represörünün DNA’ya bağlanmasında olduğu gibi (bkz. Bölüm 10), düzenleyici proteinlerin bağlanma özgüllüklerinden çok daha fazladır. Örneğin, kritik bir operatör dizisindeki bir baz-çiftinin değişimi, genellikle Lac represörünün bağlanma affinitesini 10 ile 100-kat azaltırken; bir restriksiyon endonükleazın tanıma bölgesindeki bir baz-çiftinin değişimi ise enzimatik aktivitenin tamamını ortadan kaldırmaktadır.

Bölüm 7’den hatırlayacağınız gibi, DNA tamir proteinleri DNA’ya bağlanır ve DNA üzerinde hasarlı bir baz ya da nükleotidle karşılaşana kadar ilerler. Aynı şekilde, bir restriksiyon endonükleazın DNA ile ilk etkileşimi de özgül değildir. Enzim DNA’ya bağlanır bağlanmaz, DNA’yı kesmekten nasıl alıkonuyor? Özgül-olmayan bağlanma, genellikle bazlar ile etkileşimi içermez, sadece DNA’nın şeker-fosfat omurgası ile etkileşimi içerir. Restriksiyon endonükleazlar gevşekçe bağlanırlar ve bu enzimlerin katalitik merkezleri fosfodiester omurgadan güvenli bir mesafede tutulur. Özgül-olmayan bağlanma ise hedef bölgeye ulaşım verimliliği için bir ön şarttır.

Şekil 8.3 Yaygın olarak kullanılan bazı restriksiyon endonükleazların kırma motifleri. HindIII, SmaI, EcoRI ve BamHI’in tanıma ve kesme bölgeleri ve kesme motifleri gösterilmektedir.

Şimdi, BamHI restriksiyon enziminin nasıl çalıştığına daha yakından bir göz atalım. Şekil 8.4’de gösterildiği gibi, özgül-olmayan bağlanma sonrasında bir BamHI dimeri, “kayma”

denilen bir işlemle DNA üzerinde doğrusal bir şekilde ilerler. Kayma, DNA oluğu boyunca gerçekleştiğinden, 50 baz çiftinden daha kısa mesafelerde sarmal bir hareketle gerçekleşmektedir. Bu durum ise proteinin bir-boyutlu araştırmaya ihtiyaç duyduğu boşluk hacmini azaltmaktadır. Fakat enzim, bu kadar uzun DNA’da keseceği bölgeyi her zaman nasıl buluyor?

Doğrusal difüzyonun “tesadüfi yürüyüş” tarzı, ileri ve geri basamaklara eşit olasılık sağlar, böylece özgül-olmayan bağlanma ile tanıma bölgesi arasındaki uzaklık fazlaysa (50 bç’den uzun) protein tekrar tekrar başladığı noktaya döner. Bu nedenle, çok uzun mesafelerdeki temel translokasyon mekanizması “sekme” veya “atlama” olmaktadır. Bu süreçte protein, aynı DNA zinciri üzerinde başka bir yere bağlanmadan önce, başlangıçta bağlanmış olduğu bölgeden ayrılarak, bağlanma bölgeleri arasında 3-boyutlu açıklık boyunca hareket eder.

Proteinlerin nispeten küçük olan difüzyon sabiteleri nedeniyle, yeniden bağlanma olaylarının

çoğu, başlangıç bağlanma bölgesine veya yakınına geri dönebileceği kısa-aralıklı “sekme”

olacaktır. BamHI örneğinde ise hedef restriksiyon bölgesinin belirlendiği tanıma işlemi, enzimin ve DNA’nın konformasyonunda büyük bir değişikliğin oluşmasını tetiklemekte — eşleşme olarak adlandırılır— ve bu değişiklik de katalitik merkezinin aktivasyonuna yol açmaktadır (bkz. Şekil 8.4). DNA omurgası ile dolaylı etkileşime ek olarak, özgül bağlanma, enzimin azotlu bazlarla doğrudan etkileşimiyle de karakterize edilmektedir.

Şekil 8.4 Tip II restriksiyom endonükleaz tarafından DNA bağlanmasının ve kesiminin basamakları. (İç resim) BamHI’in bir dimeri (mavi), DNA molekülüne (yeşil) özgül-olmayan bağlanma halinden özgül-bağlanmaya dereceli olarak geçtikçe, bu dimer DNA etrafında daha kapalı bir hal alır (Protein Data Bank, PDB:1ESG. Adaptasyon: Viadiu & Aggarwal. Molecular Hücre 5:889-895 Copyright

© 2000, Elsevier’in izni ile).

Şimdiye kadar X-ışını kristallografi ile yapısı karakterize edilmiş tüm uygun tip II restriksiyon endonükleazlar, korunmuş olan 4 adet -dizilimi ve bir -heliksten oluşan ortak

bir yapısal nüveye sahip olduklarını göstermişlerdir (bkz. Odak Kutusu 8.2). Zorunlu bir kofaktör olan Mg²⁺ varlığında enzim, DNA’nın her iki zincirini de tanıma dizisinin içinden veya yakınından aynı anda kesmektedir.

Enzim, bir nükleotidin fosfatı ile bitişikteki nükleotidin şekeri arasındaki kovalent bağ olan fosfodiester bağını kırarak, serbest 5’-fosfat ve 3’-hidroksil uçları oluşturur. Tip II restriksiyon endonükleazlar, nükleolitik aktiviteleri için ATP hidrolizine ihtiyaç duymazlar.

Her ne kadar fosfodiester bağına nükleofilik saldırının nasıl olduğuna dair pek çok model bulunsa da (bkz. Odak Kutusu 8.2), henüz tip II restriksiyon endonükleazların hiçbirisi için DNA’yı kesmelerinin tam mekanizması henüz deneysel olarak gösterilememiştir.

ODAK KUTUSU 8.2

EcoRI: DNA’yı bükme ve kesme

EcoRI, her birisi 31.000 mw olan iki adet özdeş altbirimden oluşan bir homodimerdir ve çift-zincirli DNA’nın d(GAATTC) dizisinden kesilmesini katalizler. EcoRI restriksiyon endonükleazın DNA ile olan etkileşimi, bu enzimin şekil ve yüzey karakteristiğinin DNA üzerindeki tamamlayıcı yüzeylerle nasıl mahirane bir ilişki sağlandığını gösterir.

DNA’nın 12 bç’lik bölgesiyle kompleks halindeki EcoRI’in kristal yapısı ise 1986 yılında tanımlanmıştır. Homodimer olan EcoRI’in bir dimeri, her iki taraftan birer -heliksle çevrili olan korunmuş yapıda 4-kordonlu -plaka içermektedir (Şekil 1). Endonükleazın aktif bölgesi, paralel olan bu - plakadaki C-ucunda uzanmakta ve bir katalitik merkez meydana getirmektedir. Bu katalitik merkezde ise Mg²⁺’nın bağlanması, altı amino asit kalıntısıyla (β2 ve β3 katalizde doğrudan görev alan amino asit kalıntılarını içermektedir) göstermiş olduğu etkileşimle sağlanmaktadır. Enzimin DNA’ya özgül olarak bağlanmasıyla birlikte 150 kadar su molekülü salınmaktadır; çözücü moleküllerinin ara-yüzeyden çekilmesi ise enzim ile DNA arasında daha yakın bir temasın olmasını sağlamaktadır. Proteinin N-ucu ise DNA’yı kısmi olarak saran bir kol oluşturur. Birbirine paralel olan 4 -heliksin oluşturduğu demet (her bir dimerde 2 -heliks) ise büyük oluklara girmekte ve doğrudan DNA baz dizisini tanımaktadır. Bu enzim tarafından sergilenen dizi özgüllüğünün büyük bir kısmı, seri haldeki 12 hidrojen bağının oluşmasında, proteinin yan-zincirlerinin donör ve akseptör olarak iş görmesiyle başarılıyor görünmektedir. Bu donör ve akseptörler, hegzanükleotid tanıma dizilerindeki baz çiftlerinin açıktaki kenarları tarafından sağlanan donör ve akseptörlere komplementerdir.

EcoRI’in kendi tanıma bölgelesine bağlanması, sadece enzimin kendi konformasyonel yapısının dramatik biçimde değişmesini değil aynı zamanda DNA’nın değişmesini de teşvik eder (indükler).

DNA’daki 20-40^o’lik merkezi bir kıvrımlama (ya da bükme) G ile A arasında kritik fosfodiester bağını aktif bölgenin içine yerleştirir. Bu bükülme ile DNA’nın çözülmesi birlikte meydana gelir. Üstteki 6 baz çiftinin çözülmesi, alttaki 6 baz çiftine oranla büyük oluğun yaklaşık 3,5 Å’luk genişlemesine sebep olur. Bu genişleme, dimerin herbir alt-biriminden 2 -heliksin büyük oluk içerisine tıpatıp uymasını sağlamaktadır. Bunun da ötesinde, bükülme ile meydana gelen baz çiftlerinin yeniden hizalanması, distorsiyonsuz DNA’da bulunmayan proteinlerle çoklu hidrojen bağlarının oluşacağı bölgeler üretir. Bu nedenle, DNA’nın protein teşvikli distorsiyonu, tanıma ve kataliz işlemlerinin sıkı bir parçasıdır.

Şekil 1. EcoRI’in yapısı. (A) DNA’ya (mavi) bağlı olan EcoRI’in iki alt-biriminin (yeşil ve açık turuncu) kristal yapısı.

Bir alt-birimde, sıkı sıkıya korunmuş olan 4 -kordon ve bir -heliksden oluşan yaygın nüve ise kırmızı olarak gösterilmiştir. (Protein Data bank, PDB:1ERI. Adaptasyon: Pingoud and Jeitsch 2001. Nucleic Acids Research 29:3705-3727. Copyright © 2001, Oxford University Press’in izniyle). (B) EcoRI-DNA kompleksinn katalitik merkezi.

(i) Katalitik merkezdeki 6 ligand ile Mg²⁺’nin koordinasyonu: 111. pozisyondaki glutamik asitin (E111) bir karboksilat oksijeni; asparajin 91’in (D91) iki karboksilat oksijeni; alanin 112 (A112)’nin ana-zincir karbonili; bölünebilir fosfat GpAA’nın O1P oksijeni (fosfatı polarize etmek ve nükleofilik atağı kolaylaştırmak için) ve nükleofilik saldırıyı oluşturan bir su molekülü, WA. (ii) Mg²⁺’sız EcoRI-DNA kompleksinin kristal yapısının katalitik ve tanıma elementleri.

Yan-zincir numaralarını takip eden harfler proteinin A ve B alt-birimlerini belirtmektedir. Tanıma bölgesi bölümü için sadece tek bir DNA zinciri (turuncu) gösterilmektedir. (iii ve iv) Mg²⁺ yokluğundaki (iii) ve mevcudiyetindeki (iv) EcoRI-DNA kompleksleri. (iv)’deki siyah ok, fosfora olan nükleofilik saldırının yönünü göstermektedir. Mg²⁺’nın mevcudiyeti, su molekülleri olan WA ve WC’nin oryantasyon ve pozisyonunun değişmesi, D91’in hareketi ve lizin 113’ün (K113) hidrojen bağ ortağı olan E111’den uzaklaşması gibi, birçok yapısal değişikliğe sebep olur. (Yeniden üretim: Kurpiewski et al. 2004. Structure 12:1775–1788. Copyright © 2004, Elsevier’in izniyle.)

DNA ligaz, lineer DNA parçalarını ekler

DNA replikasyonu ve tamir mekanizmaları ile ilgili çalışmalar, DNA’yı birleştrien ve adına DNA ligaz denilen bir enzimin keşfedilmesini sağlamıştır (bkz. Bölüm 6 ve 7). DNA ligaz, bir DNA fragmentindeki bir nükleotidin 5’-fosfat ucu ile diğer bir DNA fragmentin 3’- hidroksil ucu arasında, bir fosfodiester bağının oluşumunu katalizler. Lineer DNA fragmentlerinin bu şekilde kovalent bağlarla birbirine eklenmesi işlemine ligasyon denir. Tip II restriksiyon endonükleazların aksine, DNA ligazlar kofaktör olarak ATP’ye ihtiyaç duyarlar.

İki DNA parçasını birleştirebildiği için DNA ligaz, genetik mühendisliğinin anahtar bir enzimi olmuştur. Şayet, uygun restriksiyon enzimleri ile kesilen DNA fragmentleri, uygun şartlar altında bir araya getirilirse, iki kaynaktan elde edilen DNA fragmentleri sahip oldukları yapışkan uçların komplementer baz çiftleri arasındaki hidrojen bağları sayesinde bir araya gelerek rekombinant molekülleri oluşturmak üzere kaynaşabilirler (annealing). Bununla birlite, iki dizi birbirine fosfodiester bağlarıyla kovalent olarak bağlı değildir. İki zincirin birbirine

kovalent olarak bağlanması ve dairesel bir molekülün yeniden oluşturulması için ise zincir üzerindeki boşlukları kapatan DNA ligaz gerekmektedir. Laboratuvarlarda en yaygın kullanılan DNA ligazın kaynağını ise bakteriyofaj T4 oluşturmaktadır.

Küt uçlar oluşturan SmaI enzimi gibi restirksiyon endonükleazlar ile üretilen DNA fragmentleri kullanılarak da rekombinant DNA molekülleri oluşturulabilir. Buna rağmen, reaksiyonun verimliliği düşük olup, in vitro koşullarda T4 DNA ligazın genellikle yüksek derişimlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Reaksiyonun verimini artırmak için araştırmacılar, genellikle kör uçları modifiye eden terminal deoksinükleotidil transferaz kullanırlar.

Örneğin, şayet bir kaynaktan elde edilen DNA fragmentlerine tek-zincir poli(dA) kuyruğu eklenir ve diğer kaynaktan elde edilen DNA fragmentlerine de tek-zincir poli(dT) kuyruğu eklenirse, birbirine komplementer olan bu kuyruklar hidrojen bağı oluşturabilirler (Şekil 8.5).

Daha sonra, “kaynak 1” ve “kaynak 2” DNA’ları, DNA ligazla muamele edilerek kovalent olarak birbirlerine bağlanırlar ve böylece rekombinant DNA molekülünü oluştururlar. Bu işlemde SmaI bölgesinin tahrip edildiğine dikkat ediniz.

Şekil 8.5 Modifiye küt uç ligasyonu. Rekombinant DNA molekülleri, SmaI gibi küt uç meydana getiren restriksiyon endonükleazlar ile kesilen DNA ile oluşturulabilir.

8.4. Moleküler klonlama

Moleküler klonlamanın temel prosedürü, bir seri adımdan oluşur. Birincisi, restriksiyon endonükleazlar kullanılarak klonlanacak DNA fragmentleri üretilir. İkincisi, resrtiksiyon enzimleriyle kesilerek üretilen fragmentler, vektör olarak iş görecek diğer DNA moleküllerine eklenir. Vektörler, konak hücrede, konak genomunun replikasyonundan bağımsız olarak replike olabilirler. Bu “otonom” olarak replike olabilme yeteneği, yeni oluşturulan rekombinant DNA molekülünün manipulasyonunu kolaylaştırır. Üçüncüsü, rekombinant DNA molekülü konak bir hücreye transfer edilir. Konak hücre içinde, bu rekombinant DNA replike olarak, klon olarak adlandırılan düzinelerce özdeş kopya üretir. Konak hücreler çoğaldıkça, rekombinant DNA da yeni oluşan döllere geçer ve böylece klonlanmış dizileri taşıyan özdeş hücrelerin meydana getirdiği bir populasyon oluşur. Son olarak, klonlanan DNA segmenti konak hücreden geri alınabilir, saflaştırılabilir ve çeşitli yollarla analiz edilebilir. Şimdi gelin, klonlama vektörlerinin özelliklerine daha ayrıntılı göz atalım.

Vektör seçimi, sokuntu (insört) boyutuna ve uygulamaya bağlıdır

Klonlama vektörleri, taşıyıcı DNA molekülleridir. Tüm klonlama vektörlerinin sahip olduğu 4 önemli özellik ise şunlardır: (1) Bu vektörler kendilerini ve taşıdıkları yabancı DNA segmentlerini bağımsız olarak replike edebilirler. (2) Vektör üzerinde her birisinden sadece bir kez bulunan, çeşitli sayıda restriksiyon endonükleaz bölgeleri bulunur. (3) Vektör barındıran konak hücreleri vektör bulundurmayan konaklardan ayırt edebilmek için, genellikle antibiyotik dirençlilik geni ya da konak hücrede bulunmayan enzimleri kodlayan genler gibi seçilebilir belirteç (markör) taşırlar. (4) Vektörleri konak hücreden geri almak nispeten daha kolaydır.

Klonlama amacına bağlı olarak kullanılabilecek pek çok vektör seçeneği vardır. Klonlama vektörlerinin büyük bir çoğunluğu ise E. coli bakteri konağında kullanıbilecek şekilde geliştirilmiştir. Bu nedenle, moleküler biyologların genellikle ihtiyaç duydukları ilk pratik beceri ise saf bakteri kültürlerini büyütebilme yeteneğidir.

Klasik klonlama vektörleri plazmidler, fajlar ve kozmidler olup, bunların barındırabilecekleri sokuntu (insört) boyutu sınırlıdır ve sırası ile 10, 20 ve 45 kb’a kadardır (Tablo 8.2). Plazmidlerin ve fajların özellikleri ve bunların klonlama vektörleri olarak kullanılmaları ise ileriki kısımlarda ayrıntılı olarak ele alınacaktır. Bir kozmid ise λ fajının cos bölgesini taşıyan bir plazmid olup, bu sayede kozmidin bir fajın başının içerisine paketlenmesini sağlamaktadır. Kozmitler de fajlar gibi konak bakteriyi enfekte etmektedirler, fakat plazmidler gibi replike olmakta ve konağı lizize uğratmamaktadırlar. Memeli genlerinin boyutu ise genellikle 100 kb’dan daha büyüktür, bu nedenle de tüm bir gen dizisinin klonlanmasında orijinal olarak bazı sınırlamalar bulunmaktaydı. Son zamanlarda tasarlanan vektörler ise konak hücre kromozomlarının özelliklerinin taklit edilerek, bu problemin üstesinden gelmişlerdir. Bu yeni-nesil yapay kromozomal vektörleri ise bakteriyel yapay kromozomları (BAC), maya yapay kromozomları (YAC) ve memeli yapay kromozomları (MAC) oluşturmaktadır.

Tablo 8.2. Değişik klonlama vektör sistemlerinin ana özellikleri ve uygulama alanları.

Vektör Esası İnsört boyutu Uygulama alanı Plazmid Doğal olarak mevcut, çok

kopyalı plazmidler

≤ 10 kb Alt-klonlama ve aşağı-yönlü

manüpülasyon, cDNA klonlama ve gen ifadesi (ekspreyon) analizi

Faj Bakteriyofaj lamda () 5-20 kb Genomik DNA klonlama, cDNA

klonlama ve gen ifadesi kütüphaneleri Kozmid Bakteriyofaj λ cos bölgesi

içeren plazmid

35-45 kb Genomik kütüphane inşaası

BAC

(bakteri yapay kromozomu)

Escherichia coli F faktör plazmidi

75-300 kb Büyük genomlaron analizi

YAC (maya yapay kromozomu)

Saccharomyces cerevisiae sentromeri, telomeri ve otonom replikasyon dizisi

100-1000 kb (1 Mb)

Büyük genomların analizi, YAC transgenik fare

MAC

(memeli yapay kromozomu)

Memeli sentromeri, telomeri ve replikasyon orijini

100 kb >1 Mb Hayvan biyoteknolojisi ve insan gen terapisinde kullanım için geliştirilmekte

Bir vektör olarak plazmid DNA

Bölüm 5’ten hatırlayacağınız gibi plazmidler, bir replikasyon orjinine sahip olan ve bakteri hücresinde otonom olarak replike olabilen, doğal olarak oluşan çift-zincirli dairesel yapıdaki ekstrakromozomal DNA molekülleridir. 1974 yılında inşa edilmiş olan pBR322 plazmid vektörü, rekombinant DNA’da kullanılmak üzere genetik olarak inşa edilen ilk plazmidlerden birisiydi. Plazmidler, büyük harflerden ve numaralardan meydana gelen bir sistem ile isimlendirilmektedirler. Plazmid isimlerindeki küçük “p” harfi ise “plazmid”i temsil etmektedir. pBR322 ismine bakıldığında, “BR” harfleri bu vektörü ilk kez tasarlayan kişilerin isimlerinin (Bolivar ve Rodriquez) baş harflerini gösterirken, 322 ise özgül plazmidin tanım numarasıdır. Bu ilk vektörler genellikle düşük kopya sayısına sahiptiler. Bunun anlamı ise bu vektörlerin replike olarak her hücrede sadece 1 ya da 2 kopya meydana getirdikleridir. Şekil 8.6’da gösterilen pUC18 vektörü ise pBR322’nin bir türevidir. pUC18 vektörü yüksek kopya sayılı bir plazmid olup, her bakteri hücresindeki kopya sayısı tipik olarak 500’den fazladır.

Plazmid vektörler, özgül bir antibiyotik dirençlilik geni ve çoklu klonlama bölgesi (MCS: multiple cloning site) içerecek şekilde medifiye edilirler. Çoklu klonlama bölgesinde ise adından da anlaşılacağı üzere, çok sayıdaki restriksiyon enzimi için özgül tanıma bölgeleri bulunur, fakat bu özgül tanıma bölgelerinin her birisinden sadece birer tane vardır. Dairesel plazmid vektör, bu enzimlerin biri tarafından tanınan özgül ve tek olan tanıma bölgesinden kesildiğinde, lineer bir plazmid meydana getirilir. “Sokuntu (insört)” olarak nitelendirilen yabancı DNA molekülü de aynı restriksiyon enzimiyle kesilir ve daha sonra ligasyon reaksiyonuyla vektöre eklenir (bkz. Şekil 8.6). Lineer durumdaki plazmid vektörün iki ucunun kolaylıkla yeniden birbirine eklenebilmesi nedeniyle, sokuntunun vektöre eklenme verimliliği

%100 değildir. Vektör, terminal 5’-fosfat grubunu uzaklaştıran fosfataz enzimi ile muamele edilerek, plazmid vektörün kendi kendine eklenmesi (self-ligasyon) azaltılabilir. 5’-fosfat grubu plazmidden uzaklaştırıldığında, ligazın fosfodiester bağı yapabileceği fosfat olmadığından, plazmid vektör ligaz tarafından tekrar halkasal hale getirilemez. Fakat vektör, yabancı bir sokuntu ile birbirine eklenecek şekilde bir araya gelirse, bu durumda gerekli olan 5’-fosfatın teminini sokuntu sağlamaktadır. Diğer bir strateji ise birbirine komplementer-olmayan

yapışkan uçlar üreten 2 farklı restriksiyon endonükleaz kesim bölgesinin kullanılmasıdır. Bu durum, self-ligasyonu önlemekte ve yabancı DNA’nın vektör içerisinde istenen oryantasyonda kaynaşmasını sağlamaktadır.

Şekil 8.6. Plazmid vektör kullanılarak moleküler klonlama. Rekombinant bir DNA molekülü inşa edilir, ligasyon reaksiyon ürünleri konak bakterilere aktarılır ve plazmid DNA çoğaltılır.

Transformasyon: rekombinant plazmid DNA’nın bakteriyel bir konağa aktarımı:

Yukarıda sözü edilen rekombinant ve rekombinant-olmayan DNA’nın ligasyon reaksiyon karışımı, transformasyon adı verilen bir prosesle bakteri hücresine aktarılır (bkz. Şekil 8.6).

Geleneksel yöntemde, bakteri hücrelerinin membran geçirgenliğinin sızıntılı hale gitirilmesi için hücreler yoğunlaştırılmış kalsiyum tuz solüsyonunda inkübe edilir. Pozitif yüklü kalsiyum iyonları ile fosfolipit membrandaki negatif yüklü fosfatlar arasındaki etkileşim, membranın stabilitesini bozarak geçici porlar oluşturur. Böylece, permeabil “kompetent” hücreler DNA ile karıştırılarak, DNA’nın bakteri hücresine girişi sağlanır. Alternatif olarak, güçlü bir elektrik akımı ile DNA’ların hücrelerin içine girişinin sağlandığı elektroporasyon yöntemi de kullanılabilir.

Bakteri türleri, uygun bir motifde metillenmemiş olan plazmidler de dahil olmak üzere yabancı DNA’ları parçalayan bir restriksiyon-modifikasyon sistemi kullandıklarından, şu soru karşımıza çıkar: Transforme bakteri yabancı DNA’yı neden parçalamaz? Cevap ise şudur:

Moleküler biyologlar, yaygın laboratuvar suşu olan E. coli DH5α gibi, hem restriksiyon hem de modifikasyon sistemi kusurlu olan mutant bakteri suşlarını kullanarak, bu savunma sistemininin üstesinden akıllıca gelmişlerdir.

Başarılı bir şekilde transforme edilmiş bakteriler (transformantlar) ya rekombinant ya da rekombinat-olmayan plazmid DNA taşıyacaklardır. Plazmid DNA’ların çoğalması ise transforme edilmiş her bakteride gerçekleşecektir. Gerekli besinleri içeren agarlı besiyeri gibi, katı bir yüzey üzerine yerleştirilen tek bakteri hücresi ise çoğalarak milyonlarca özdeş hücreden oluşan görünür bir koloni oluşturur (Şekil 8.7). Konak hücre bölündükçe, plazmid vektör de yeni oluşan oğul hücrelere geçmekte ve burada da replikasyona devam etmektedirler.

Transforme olmuş tek bakteri hücresinin birçok kez bölünmesi sonucunda, tek ebeveynden üremiş hücre klonları oluşur. Bu hücre klonları da agarlı besiyeri yüzeyinde görünür olan koloniyi meydana getirir. Bu basamak, “klonlama” işlemine adını veren aşamadır. Klonlanmış olan DNA daha sonra bakteriyel hücre klonlarından tekrar izole edilebilir.

Rekombinant seçimi: Transforme olmayan hücrelerin büyümemesi için, hücrelerin ekildiği ortama ne ilave edilmelidir? Bu sorunun cevabı vektöre bağlıdır. Örneğin, Şekil 8.6’da gösterilen pUC18 vektörü amfisilin antibiyotiğine dirençlilik sağlayan seçici bir belirteç gen taşımaktadır. Penisilin türevi olan amfisilin, E. coli’nin iç ve dış membranı arasındaki peptidoglukan tabakasının sentezini engeller (Tablo 8.3). Amfisilin, intakt halde hücre zarfı bulunan mevcut hücreleri etkilemez, fakat bölünmekte olan ve bu nedenle de yeni peptidoglukan sentezleyen hücreleri öldürür. Rekombinant plazmidlerin taşıdığı amfisilin dirençlilk genleri ise β-laktamaz denilen bir enzim üretirler. Bu enzim ise antibiyotik aktivitesi için gerekli olan amfisilin molekülünün 4-üyeli halkasındaki (β-laktam halkası) özel bir bağı kırar. Şayet, bu plazmid vektörü, plazmidsiz ve antibiyotiğe duyarlı bir bakteri hücresine aktarılırsa, hücre amfisiline dirençli hale gelir. Transforme olmayan hücrelerde ise pUC18 DNA’sı bulunmayacağından, bu hücreler antibiyotiğe dirençli olamazlar ve amfisilin içeren agar besiyerinde bu hücrelerin büyümesi inhibe edilir (Şekil 8.7). Transforme olan bakteri hücreleri ise ya rekombinant-olmayan pUC18 DNA’sını (sadece self-ligasyon vektörü) ya da rekombinant pUC18 DNA’sını (yabancı DNA içeren vektör) içerirler. Her iki tipteki transforme bakteri hücresi de amfisiline dirençli olacaktır.

Tablo 8.3. Yaygın olarak kullanılan bazı antibiyotikler ve antibiyotik direnç genleri.

Antibiyotik Etki mekanizması Direnç geni

Amfisilin Peptidoglukan çapraz-bağlarını bozarak bakterilerin hücre duvarı sentezini inhibe eder.

β-laktamaz (amp^r) gen ürünü salgılanır ve amfisilini hidroliz eder.

Tetrasiklin Aminoaçil tRNA’nın 30S ribozomal alt-birimine bağlanmasını inhibe eder.

tet^r gen ürünü membrana bağlıdır ve dışa akış mekanizması ile tetrasiklin birikimini engeller.

Kanamisin Ribozomun fonksiyonuna karışarak translasyonu inaktive eder.

Neomisin ya da aminoglikozid fosfotransferaz (neo^r) gen ürünü, fosforilasyon ile kanamisini inaktive eder.

Şekil 8.7. Mavi-beyaz taraması ile rekombinant klonların seçimi. Rekombinant klonlar seçilir, müteakiben rekombinant plazmid DNA’lar çoğaltılır ve saflaştırılır. (Fotoğraflar: Vinny Roggero ve Spring 2006 Molecular Genetic Lab.’ın izni ile, William ve Mary Koleji).

Mavi-beyaz taraması: Rekombinant-olmayan transformantlar, rekombinant transformantlardan nasıl ayırt edilir? pUC18 gibi vektörler ile mavi-beyaz taraması ya da “lac seçimi” kullanılabilir (bkz. Şekil 8.7 ve Şekil. 8.8). Bakteri kolonileri, amfisilin ve kısaca X- gal olarak adlandırılan renksiz bir kromojenik bileşik içeren seçici besiyerinde büyütülürler. X- gal’in tam adı ise 5-bromo-4-kloro-3-indolil--D-galaktozid’dir. pUC18 vektörü, β- galaktozidaz enziminin ilk 146 aminoasidini kodlayan ve lacZ’ olarak adlandırılan, lacZ geninin bir kısmını taşır. β-galaktozidaz enzimi ise laktoz metabolizmasında yer alır ve bu konu ile ilgili bilgiler Bölüm 10’da ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Çoklu klonlama bölgesi, kodlama bölgesi içinde bulunmaktadır. Şayet lacZ’ bölgesine yabancı DNA girmemişse, β- galaktozidazın amino-uç kısmı sentezlenir. Önemli bir durum ise konak olarak E. coli’nin delesyonlu mutant suşunun (örn. DH5α) kullanılmasıdır. E. coli DH5α’da ise lacZ geninin

mutant sekansı bulunur ve bu suş β-galaktozidazın sadece karboksil ucunu (lacZ’ ΔM15) kodlar. Hem plazmid hem de konak hücredeki lacZ fragmentleri (genleri), fonksiyonel olmayan proteinler kodlar. Buna rağmen, α-komplementasyonu ile bu iki kısmi protein birleşebilmekte ve fonksiyonel bir enzim oluşturabilmektedir. Fonksiyonel bir β-galaktozidaz enzimi ise X- gal’in hidrolizini katalizlemekte ve renksiz olan substratı mavi renkli ürüne dönüştürmektedir (bkz. Şekil. 8.7 ve Şekil 8.8).

Şekil 8.8. Yabancı bir sokuntu (insört) DNA’nın varlığının indikatörü olarak β-galaktozidaz aktivitesi kullanılabilir. β-galaktozidazın N-terminal fragmentinin (lacZ 5’) ifadesini (ekspresyonunu) gerçekleştiren plazmidler, enzimin C-terminal (lacZ 3’ dizilimi) fragmentinin ifadesini gerçekleştiren E.

coli suşlarında kullanılabilir. N-terminal ve C-terminal fragmentler birleşir ve 4 alt-birim, fonksiyonel tetramerik bir enzim meydana getirmek üzere bir araya gelir. X-gal’in kırılması ise mavi renkli bir ürün oluşturur ve bu renk, agar üzerinde kolonilerin görülmesini sağlar. Şayet yabancı bir sokuntu (insört) lacZ 5’ kodlama dizisinin içine girerek bu dizinin bütünlüğünü bozarsa, bu durumda bakteri hücresinde sadece C-terminal polipeptid üretilir. Böylece, X-gal kırılamaz ve bakteri kolonileri beyaz kalır.

Rekombinant plazmid DNA’nın çoğaltılması ve saflaştırılması: Pozitif (beyaz) kolonilerin daha ileri taramaları, insörtün varlığını ve oryantasyonunu teyit etmek amacıyla restriksiyon endonükleaz kesimiyle gerçekleştirilebilir. Rekombinant plazmid DNA’yı içeren pozitif bir koloni, aseptik koşullarda sıvı bir besiyerine transfer edildiğinde, hücreler eksponansiyel olarak çoğalmaya devam eeceklerdir (bkz. Şekil. 8.7). Bir ya da iki 2 gün içinde, özdeş olan trilyonlarca hücre hasat edilebilir.

Moleküler klonlamanın son basamağı, klonlanan DNA’nın tekrar elde edilmesidir.

Plazmid DNA, uygun koşullarda nükleik asitleri tercihli olarak bağlayan, fakat proteinlerin ve karbonhidratların ise uzaklaştırılmasına izin veren silika jel veya anyon değiş-tokuş reçinesinin kullanıldığı kromatografik yöntemlerle (bkz. Araç Kutusu 8.1) ham hücre lizatlarından

saflaştırılabilirler. Saflaştırılan plazmid DNA’sı ise daha sonra kolondan elüe edilir ve monovalent katyonların varlığında etanol çökeltilmesi (presipitasyonu) ile geri kazanılır. Sulu solüsyonlardan plazmid DNA’nın etanolle çökeltilmesi sonucunda, uygun tampon solüsyonlarında kolayca çözünebilen temiz bir çökelti (pellet) oluşur.

Vektör olarak bakteriyofaj lamda (λ)

1974 yılında ilk viral klonlama vektörü olarak tasarlanmış olması nedeniyle, bakteriyofaj lamda (λ) rekombinant DNA teknolojisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. λ faj vektörleri, plazmid vektörlerin aldığı DNA parçasından daha büyük bir parçayı alabildikleri için genomik kütüphanelerin oluşturulmasında özellikle kullanışlıdırlar. Bugün çok çeşitli λ vektörleri vardır.

İnsersiyon vektörleri ise λ faj genomuna ilaveten küçük DNA fragmentlerinin klonlanmasına izin veren emsalsiz restriksiyon endonükleaz bölgelerine sahiptirlerdir. Bunlar ise genellikle cDNA ekspresyon kütüphanelerinin hazırlanması için kullanılmaktadırlar. Yer-değiştirme vektörleri ise merkezi gen kümesinin her iki tarafında çifte klonlanma bölgelerine sahiptirler.

Bu merkezi küme ise litik yaşam döngüsü için gerekmeyen lizogeni ve rekombinasyon genlerini içermektedir (bkz. Şekil. 8.1). Merkezi gen kümesi çıkarılabilir ve yabancı DNA bu genlerin yerine “kollar”arasına sokulabilir. Klonlama vektörü olarak kullanılan tüm faj vektörleri, güvenlik bakımından tehlikesiz hale getirilmişlerdir ve sadece özel laboratuvar şartları altında fonksiyon gösterebilmektedirler.

ARAÇ KUTUSU 8.1

Sıvı kromatografi

Moleküler biyolojide kullanılan önemli araçlardan biri de kromatografidir. Kromatografi tekniği ilk olarak 1900’lerin başında, botanikçi Mikhail Semenovich Tswett tarafından geliştirilmiştir. Tsweet, bir miktar absorbent reçinenin paketlenmiş olduğu düşey bir tüpten, yaprak özütünü geçirmiştir. Bu işlemle Tsweet, yaprağın ana yeşil pigmenti ile turuncu pigmentini ayırmayı başarmıştır. Klorofiller, ksantofiller ve karotenler kolonda birbirinden farklı renklerde bantlar olarak görünmüşlerdir. Bu gözlemlere dayanarak, Tsweet bu tekniği “kromatografi” olarak adlandırmıştır (Yunanca’da khroma “renk”, graphein ise “yazmak” anlamına gelmektedir).

Bugün, kromatografinin birçok çeşidi bulunmaktadır, fakat bunların hepsinin temeli ilk defa Tsweet tarafından gözlenen prensiplere dayanmaktadır. Bir solüsyonda çözünen moleküller, katı bir yüzey ile etkileşeceklerdir (bağlanır ve ayrılırlar). Solüsyonun yüzey boyunca akmasına izin verildiğinde, katı yüzey ile zayıf bir etkileşime giren moleküller kısa süre katı yüzeye bağlı kalacaklar ve yüzeyle sıkı bir etkileşime giren moleküllere göre daha hızlı hareket edeceklerdir. Sıvı kromatografi, nükleik asit ve protein karışımlarını sıkıca paketlenmiş boncuksu yapıların bulunduğu kolonlardan geçirilerek, bu molekülleri birbirlerinden ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu boncukların tabiatı ise proteinlerin ya da nükleik asitlerin ayrıştırılmasında kütlenin mi (jel filtrasyon kromatografisi), yükün mü (iyon değiş-tokuş kromatografisi) ya da bağlanma ilgisinin mi (affinite kromatografisi) etkili olacağını belirlemektedir (Şekil 1).

Şekil 1. Sıvı kromatografi tekniği. (A) Jel filtrasyon kromatografisi, boyut olarak farklı makromoleküllerin ayrıştırılması için kullanılır. Örneğin, bir protein karışımı, porlu boncuklar (agaroz ya da poliakrilamid) ile paketlenmiş kolonun üzerine yüklenir. Büyük proteinler, boncukların etrafından akar. Küçük proteinler ise boncukların içine girdiklerinden, kolon boyunca büyük proteinlere göre daha yavaş hareket ederler. Farklı büyüklükteki proteinler ise ayrı sıvı fraksiyonlar halinde toplanabilir. (B) İyon değiş-tokuş kromatografisi ise net elektriksel yükleri bakımından farklı olan makromolekülleri (proteinler ya da nükleik asitler gibi) ayrıştırmak için kullanılır. Örneğin, nötral pH’da ya pozitif (burada gösterildiği gibi) ya da negatif elektriksel yük taşıyan amino (NH3+) ya da karboksil gruplarıyla (COO^) kaplanmış boncukların paketlendiği kolona proteinler yüklenir.Zıt yüklü asidik proteinler (net negatif yüklü) pozitif yüklü boncuklara bağlanırlarken, aynı tip net yüke sahip bazik ya da nötr proteinler ise boncuklara bağlanmadan kolondan akarlar. Bağlanan proteinler, bu durumda negatif yüklü proteinler, ise kolondan bir tuz gradienti geçirilerek elüe edilirler. Negatif yüklü tuz iyonları boncuklara bağlanırken, proteinler serbest kalmaktadır. (C) Afinite kromatografisinin esası, protein ya da nükleik asitin özgül olarak bir başka moleküle bağlanma kabililiyetine dayanır.

Kolonlar, hedef protein ya da nükleik asite bağlanan ligandların kovalent olarak bağlandıkları boncuklar ile paketlenir. Ligandlar ise antikor, enzim substratı ya da makromoleküllere özgül olarak bağlanan diğer küçük moleküller olabilir. Örneğin, antikor-affinite kromatografisinde kolon, boncuklara kovalent olarak bağlanmış olan özgül antikorları içerir. Kütle ya da yüke bağlı olmaksızın, sadece antikora yüksek affinite gösteren proteinler kolonda alıkonurken, diğer proteinler ise kolondan akar. Kolona bağlanmış olan proteinler ise aşırı miktarda ligand eklenerek ya da tuz derişimini değiştirerek asidik bir solüsyon içerisinde elüe edilirler.

λ fajı yer-değiştirme vektörünün kullanımıyla ilgili tipik bir strateji Şekil 8.9’da betimlenmektedir. Bu örnekte, λ fajından DNA elde edilmekte ve merkezi gen kümesi, restriksiyon endonükleazlar ile kesilerek çıkarılmaktadır. Klonlanacak yabancı DNA da aynı enzim ile kesilir ve λ faj DNA’sının sağ ve sol “kolları” arasına eklenir. Daha sonra bu rekombinant DNA in vitro olarak faj proteinleri ile karıştırılır. Bu aşamada, DNA faj başına paketlenir ve kuyruk fibrilleri kendi kendine birleşme yolağıyla eklenir. Rekombinant viral partikül, “transdüksiyon” denilen prosesle agar besiyeri üzerindeki konak bakteri hücrelerini enfekte edebilir. Yabancı DNA sokuntusunu içeren faj genomu replike olur ve yeni virüs partikülleri oluşur. Bakteri kısa bir sürede yeni virüs partikülleri ile dolar, hücre parçalanır ve milyonlarca rekombinant faj ortama salınır. Viral partiküller, agar üzerini örten bakteri tabakası üzerinde temiz zonlar veya “plaklar” olarak görünür. Her bir plak, tek rekombinant fajın dölünden oluşmaktadır ve milyonlarca rekombinant faj partikülü içermektedir. Bugün mevcut olan çoğu vektör ise mavi-beyaz seçimine izin veren lacZ’ genini taşımaktadır.

Şekil 8.9. Bakteriyofaj lamdanın (λ) klonlama vektörü olarak kullanımı. Konak bakteri tabakasındaki her bir plak, tek rekombinant fajın döllerini temsil etmektedir.

Yapay kromozom vektörleri

Bakteriyel yapay kromozomları (BAC) ve maya yapay kromozomları (YAC), kompleks ökaryotik genomların haritalanması ve analizi için kullanılan önemli araçlardır. İnsan Genom Projesi ve diğer genom dizileme projelerindeki çalışmaların çoğu, 300 kb’dan daha büyük yabancı DNA moleküllerini taşıyabilmeleri nedeniyle BAC ve YAC’ların kullanılmasına bağlıdır. BAC’ların inşaasında başlangıç noktası olarak E. coli’nin fertilite plazmid faktörü (F faktör) kullanılmıştır. Bu plazmid tabii halde 100 kb boyutundadır ve konaktaki kopya sayısı ise çok azdır. Tasarlanmış BAC vektörleri 7,4 kb boyutlarında olup, yapısında bir replikasyon orijini, klonlama bölgeleri ve seçici belirteçler bulunmaktadır. Böylelikle, büyük bir yabancı sokuntu DNA’yı rahatlıkla barındırabilmektedirler.

İlk suni kromozomların inşaasının hemen ardından, çalışmalar bir memeli yapay kromozomunun (MAC) geliştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. İlk prototip MAC ise 1997’de tanımlanmıştır. MAC’ların özü, DNA replikasyonuna başlatan diziler olan sentromerik dizilerin ve telomerik dizilerin mevcudiyetine dayanmaktadır. MAC’ların geliştirilmesi, iki temel nedenden dolayı hayvan biyoteknolojisindeki ve insan gen terapisindeki gelişmeler açısından oldukça önemli kabul edilmektedir. Bu nedenlerin birincisi, diğer vektörlerde olduğu gibi kromozomların içerisine rastgele entegre olmanın aksine, bunların memeli hücreleri içinde otonom olarak replike olabilmeleri ve ayrı tutulabilmeleridir. İkincisi, sadece kodlama bölgelerinin değil, aynı zamanda bütün kontrol elementlerinin de dahil olduğu büyük genlerin ifade (ekspresyon) sistemleri olarak kullanılmak amacıyla, bu vektörlerin modifiye edilebilmeleridir. Bu noktada, uygulama açısından en önemli kısıtlayıcı faktör ise bu vektörlerin büyüklüğü sebebiyle idare edilmelerinin zor olması ve çok az miktarlarda geri elde edilebilmeleridir. Hazırlık metotlarından biri, in vitro olarak klonlanmış sentromerik, telomerik ve replikasyon orjinlerinin de novo olarak birleştirilmesini içermektedir.

Maya yapay kromozom (YAC) vektörleri: Maya, bir ökaryot olmasına rağmen, manipüle edilebilen ve laboratuvarda daha çok bakteriler gibi büyütülebilen küçük bir tek hücrelidir.

YAC vektörleri, kromozomlar gibi davranacak şekilde tasarlanırlar. Maya mutantlarının ve biyokimyasal yolaklarının genetik analizleri kadar, kromozom stabilitesi ve replikasyonu için gereken detaylı bilgiler olmadan, bu vektörlerin tasarlanması mümkün olmazdı. YAC vektörleri, bir replikasyon orijini (otonom replikasyon dizileri, ARS: autonomously replicating sequence) (bkz. Bölüm 6), yavru hücrelere dağıtımını garantilemek için bir sentromer, kromozomların uçlarını kapatmak ve stabiliteyi korumak için telomerler ve her kolda seçici büyüme belirteçleri içermektedir (Şekil 8.10). Bu belirteçler, arasına yabancı DNA’yı alarak birleşmiş olan kolların oluşturduğu moleküllerin seçimini sağlar.

Örneğin, Şekil 8.10’da gösterildiği gibi, URA3 ve TRP1 maya genleri genellikle belirteç olarak kullanılmaktadır. Pozitif seçim, ura3-trp1 mutant maya suşunun oksotrofik komplementasyonu ile gerçekleştirilmektedir. Bu maya suşu ise büyümek için urasil ve triptofan desteğine ihtiyaç duymaktadırlar. URA3, azotlu bir baz olan urasilin biyosentezi için gerekli bir enzimi kodlamaktadır. TRP1 ise triptofan amino asitinin biyosentezi için gerekli enzimi kodlamaktadır. YAC vektörleri, içerisine yabancı DNA sokulmadan önce dairesel

olarak muhafaza edilirler. BamHI ve EcoRI restriksiyon endonükleazlari ile kesildikten sonra, sağ kol ve sol kol lineer hale gelir ve bu kolların uç dizileri ise telomeri meydana getirirler.

Yabancı DNA da EcoRI ile kesilir ve YAC kolları ile yabancı DNA’nın ligasyonundan sonra, bu molekül maya konak hücresine aktarılır. Maya konak hücreleri ise sferoplast olarak muhafaza edilirler, yani bu maya hücrelerinin hücre duvarı yoktur. Maya hücreleri, kolların birleşerek URA3 ve TRP1 genlerini bir araya getirmiş olan molekülleri seçmek için, içerisinde urasil ve triptofanın bulunmadığı seçici besinsel rejenerasyon besi ortamlarında büyütülürler.

Peki, rekombinant YAC’lar rekombinant-olmayan YAC’lardan nasıl ayırt edilmektedir?

Şekil 8.10. Maya yapay kromozomu (YAC) klonlama vektörlerinin kullanımı. Bu örnekte gösterilen YAC, otonom replikasyonu sağlayan bir dizi (ARS), sentromer (CEN), telomerik diziler (TEL) ve seçici belirteçler (URA3 ve TRP1) taşır. EcoRI bölgesine DNA sokulması sebebiyle SUP4’ün inaktivasyonu, kırmızı kolonilerin oluşumuna sebep olur.

Kırmızı-beyaz seçimi: Şekil 8.10’da gösterilen örnekte, rekombinant YAC’lar “kırmızı- beyaz seçimi” yoluyla taranmaktadır. Bu örnekteki YAC’ın çoklu klonlama bölgesinde, bir başka belirteç daha bulunmaktadır, SUP4. SUP4 ise Ade2-1 UAA mutasyonunu baskılayan bir tRNA kodlar. ADE1 ve ADE2, adenin sentezinde görev alan enzimleri kodlamaktadır. Bu kritik enzimlerin olmaması durumunda, Ade2-1 mutant hücreleri kırmızı bir pigment üretmektedir.

Fakat SUP4 genini ifade eden Ade2-1 mutant hücreleri, Ade2-1 mutasyonu baskılandığından, yabani tip maya suşları gibi beyazdır. Çoklu klonlama bölgesine yabancı DNA sokulduğunda

ise SUP4 ifadesi sekteye uğramaktadır. SUP4 ifadesinin yokluğunda ise Ade2-1 mutasyonu artık baskılanmadığından, kırmızı pigment tekrar ortaya çıkar. Bunun aksine, rekombinant- olmayan YAC vektörleri aktif SUP4 süpresörünü muhafaza ederler. Böylece, kırmızı koloniler rekombinant YAC vektör DNA’larını taşırken, beyaz koloniler ise rekombinant-olmayan YAC vektör DNA’larını taşırlar.