NKUBAP.00.24.AR.13.20 nolu proje
Doğal Kum Zambağı (Pancratium maritimum L.) Populasyonlarında Genetik Yapının Moleküler
Belirteçler Yardımı İle Belirlenmesi
Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Behiye Banu BİLGEN Araştırmacı: Elif Ceren PEHLİVAN
2015
Doğal Kum Zambağı (Pancratium maritimum L.) Populasyonlarında Genetik Yapının Moleküler Belirteçler Yardımı İle Belirlenmesi
Proje No: NKUBAP.00.24.AR.13.20
Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. Behiye Banu BİLGEN Araştırmacı: Elif Ceren PEHLİVAN
Ağustos 2015 Tekirdağ
i ÖNSÖZ
Türkiye jeolojik çeşitlilik, farklı iklim tiplerine sahip olma, yükselti farklılıkları gibi nedenlerden dolayı farklı yaşam alanlarına ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca çok zengin floristik yapıya sahiptir. Türkiye biyoçeşitliliğinde önemli bir yere sahip olan soğanlı bitkiler birçok alanda yüksek bir kullanım potansiyeline sahiptir. Kullanım alanları arttıkça bu bitkilere olan ihtiyaç da artmaktadır. Soğanlı bitkilerin doğal populasyonları turizm, kaçak sökümler, kentleşme, yol yapımı, endüstriyel çalışmaların artması gibi çeşitli nedenlerin etkisi ile önemli ölçüde olumsuz etkilenmekte ve sonuç olarak bu bitkilerin büyük çoğunluğu nesli tükenme tehlikesi ile karşı karşıya kalmaktadır. Türkiye kıyılarında kumul alanlarda yayılış gösteren kum zambağı (Pancratium maritimum); biyolojik çeşitlilik bakımından ülkemizin önemli soğanlı bitkilerindendir. Bu proje kapsamında iki kum zambağı populasyonunun (İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Çamlıkoy Tabiat Parkı) genetik yapısının RAPD primerleri kullanılarak belirlenmesi amaçlanmış ve literatüre önemli katkılar sağlayacak bilgiler elde edilmiştir. Bu çalışmanın, kum zambağı gen kaynaklarının korunması konusunda halen yapılan ve yapılması planlanan çalışmalara, kum zambağı ve yakın akraba türleri ile ilgili yapılacak olan çeşitli genetik çalışmalara yararlı olmasını ve benzer yöndeki diğer araştırmalara ışık tutmasını dilerim.
Bu araştırma projesini NKUBAP.00.24.AR.13.20 proje numarası ile destekleyen Namık Kemal Üniversitesi Rektörlüğü, Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne (NKU BAP) teşekkürlerimi sunarım. Projede kullanılmak üzere kum zambağı populasyonlarından yaprak örneği toplamamıza ilgili yönetmelik gereğince izin veren T.C. Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Bitkisel Üretim Genel Müdürlüğüne ve T.C. Orman ve Su İşleri Bakanlığı, Doğa Koruma ve Milli Parklar Genel Müdürlüğüne teşekkür ederim.
Ayrıca, bu projenin yürütülmesinde destek ve yardımlarını esirgemeyen bölüm başkanımız Prof. Dr. Sezen ARAT’a ve Namık Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Öğretim Üyeleri ve Araştırma Görevlilerine, Ziraat Fakültesi Dekanlığına, laboratuvar çalışmalarında yardımlarını gördüğüm lisansüstü öğrencilerim Ahmet Kubilay BARUT ve Ceren ELİBOL’a, yine arazi çalışmaları sırasında örnek toplamada yardımlarını gördüğüm Doç. Dr. Türker BİLGEN’e teşekkür ederim.
Yrd. Doç. Dr. Behiye Banu BİLGEN Proje Yürütücüsü
Ağustos 2015
ii İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ ... i
İÇİNDEKİLER ... ii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... iii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... iv
SIMGELER VE KISALTMALAR ... v
ÖZET ... vi
ABSTRACT ... vii
1. GİRİŞ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 3
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 7
3.1. Bitkisel materyal ... 7
3.2. DNA izolasyonu ... 7
3.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA’nın çoğaltılması ... 8
3.4. Moleküler verilerin analiz ... 12
4. BULGULAR ... 13
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 15
6. KAYNAKLAR ... 19
7. EKLER ... 22
EK-1: Çalışılan populasyonlarda gözlemlenen 70 lokusa ait genetik çeşitlilik parametreleri ... 22
iii ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1.Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından 2013 yılı için doğadan toplanarak ihracatı yasak olan 20 çiçek soğanı ... 4 Çizelge 3.1. Çalışmada optimize edilen RAPD primerlerinin sekans
(dizi) bilgileri ... 8 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan RAPD primerleri için optimize edilmiş PCR koşulları ... 9 Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan RAPD primerleri için optimize edilmiş PCR döngüleri ... 9 Çizelge 4.1. Çalışılan iki kum zambağı populasyonundan elde edilen RAPD
bantlarına ait bilgiler ... 13 Çizelge 4.2. Çalışılan iki kum zambağı populasyonunda gözlenen allel sayısı (Na), etkili allel sayısı (Ne), beklenen heterozigotluk (He), Shannon sabiti (I),
polimorfiklokus sayısı (P) ve oranı ve standart hataları ... 14
iv ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 3.1. Çalışılan kum zambağı populasyonlarından genel bir görüntü ... 7 Şekil 3.2. Örneklerin, OPN-06 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ... 10 Şekil 3.3. Örneklerin, OPN-12 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ... 10 Şekil 3.4. Örneklerin, OPA-02 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ... 11 Şekil 3.5. Örneklerin, OPB-10 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ... 11 Şekil 3.6. Örneklerin, OPV-18 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA
parçalarına ait jel görüntüsü ... 12 Şekil 4.1. Çalışılan kum zambağı populasyonlarına ait RAPD lokusu bilgileri ve heterozigotluk düzeyi ... 14
v SİMGELER ve KISALTMALAR
Simgeler
A Adenin
C Sitozin
dk Dakika
G Guanin
µl Mikrolitre (10-6 Lt) µM Mikromolar (10-6 M) mM Milimolar (10-3 M) ng Nanogram (10-9 g) pmol Pikomol (10-12mol)
T Timin
U Ünite (enzim birimi) Volt Voltaj
% Yüzde
º Derece
ºC Santigrat derece Kısaltmalar
AFLP Arttırılmış fragmentlerin uzunluk polimorfizmi (Amplified Fragment Length Polymorphism)
AMOVA Moleküler varyans analizi
bç Baz çifti
Bkz. Bakınız
DNA Deoksiribonükleik asit dNTP Deoksi Nükleotid Tri Fosfat Gst Genetik farklılaşma katsayısı
He Nei’nin tarafsız haplotip çeşitlilik katsayısı Hs Populasyon-içi genetik çeşitlilik
Ht Toplam genetik çeşitlilik
I Shannon sabiti
MgCl2 Magnezyum Klorür Na Gözlenen allel sayısı Ne Etkili allel sayısı P Polimorfiklokus sayısı
P. Pancratium
PCR Polimeraz zincir reaksiyonu
RAPD Rastgele arttırılmış polimorfik DNA (Random Amplified Polymorphic DNA)
SE (±) Standart hata (Standart Error)
SSRs Basit dizi tekrarları (Simple Sequence Repeats) vd Ve diğerleri
vi ÖZET
Soğanlı bitkiler çeşitli sanayi alanlarında büyük bir kullanım potansiyeline sahip olmalarından dolayı Türkiye biyoçeşitliliğinde önemli bir yere sahiptir. Kumul alanlarda yayılım gösteren kum zambağı (Pancratium maritimum L.) önemli soğanlı bitkilerimizdendir. Kum zambağının dekoratif bir bitki olmasının yanı sıra bitkide bulunan alkaloidler ve flavonoidlerin tıbbi olarak özellikle kanser tedavisinde kullanılması bitkinin önemini daha çok artırmaktadır. Kum zambağı; Trakya bölgesi, İstanbul, Bolu, Bartın, Sinop, Samsun, Giresun, Trabzon, Antalya, Mersin ve Adana’nın kumul sahillerinde doğal olarak bulunmaktadır.Doğal yaşam alanları olan kumul sahillerin büyük bölümünün plaj olarak kullanılması, aşırı miktarda ve plansız turizme yönelik otellerin inşa edilmesi ve sahillerin kapatılması, bitkinin çiçeklerinin insanlar tarafından çiğnenmesi, koklamak ve evleri süslemek için koparılması ve soğanlarının toplanması bitkinin doğal yaşam alanındaki varlığını tehlikeye sokmaktadır.
Bu çalışmada Kırklareli’ne bağlı İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Tekirdağ iline bağlı Çamlıkoy Tabiat Parkında yer alan 2 doğal kum zambağı populasyonunun genetik yapısı 8 RAPD primeri kullanılarak belirlenmiştir. Çalışılan 8 primerin tamamı polimorfik olarak saptanmıştır. Analiz edilen iki populasyonda sekiz primer için 70 lokus bulunmuştur. Bütün populasyonlar ele alındığında toplam polimorfik lokus sayısı 67, oranı ise %95.71 olarak görülmüştür. Genetik çeşitlilik parametrelerinden;
lokus başına düşen ortalama allel sayısı 1.843, etkili allel sayısı 1.440, Shannon sabiti 0.411 olarak hesaplanmıştır. Analiz edilen populasyonlara ait genetik farklılaşma katsayısı ise (Gst) 0.0486 olarak hesaplanmıştır. Buna göre, populasyonların sahip olduğu genetik çeşitliliğin büyük bir kısmının (%95.14) populasyon içinde olduğu anlaşılmaktadır.
Elde edilen veriler kum zambağı ve yakın akraba türleri ile ilgili yapılacak olan çeşitli genetik çalışmalara ve gen kaynaklarını koruma stratejilerinin belirlenmesine yönelik çalışmalara önemli katkılar sağlayacaktır.
Anahtar Kelimeler: Genetik karakterizasyon, Pancratium maritimum L., polimorfik lokus, RAPD, soğanlı bitki
vii ABSTRACT
Bulbous plants have important role in Turkey’s biodiversity due to their great potential use in various industries. Sand daffodil (Pancratium maritimum L.), being one of the Turkey’s biological richness and important bulbous plant of our country, grows on coastal sands. In addition to being decorative plant, sand daffodil (P. maritimum L.) has increased importance due to having alkaloids and flavonoids that are used in medicine especially in cancer treatment. Sand daffodil grows naturally in sandy beaches of Thrace region, İstanbul, Bolu, Bartın, Sinop, Samsun, Giresun, Trabzon, Antalya, Mersin and Adana. Usage of majority of natural habitats as a beach, excessive and unplanned building of hotels for tourism and closure of coasts, collection of flowers for ornamental purposes by humans and collection of bulbs are some reasons that endanger existence of sand daffodil in their natural habitats.
In this study, the genetic structure of two natural sand daffodil populations from İğneada Longoz forests National Park (Kırklareli) and Çamlıkoy National Park (Tekirdağ) was determined by 8 RAPD primers. Eight primers were analyzed, and all, were polymorphic. A total of 70 loci were found in the analyzed two populations by eight primers. For all populations total polymorphic locus number is 67 and the mean proportion of polymorphic loci was 95.71%. Genetic diversity parameters; mean number of alleles for each loci was 1.843, effective allele number was 1.440, Shannon’s information index was 0.411. The genetic differentiation coefficient (Gst) is estimated as 0.0486. According to Gst results, high proportion of genetic diversity (95.14%) was within populations.
The data obtained from this project is valuable to provide important contributions to the national and international studies with sand daffodil and other related species, and the determination of genetic resources conservation strategies.
Keywords: Genetic characterization, Pancratium maritimum L., polymorphic locus, RAPD, bulbous plant
1 1.GİRİŞ
Türkiye jeolojik çeşitlilik, değişik iklim ve toprak tiplerine sahip olma, büyük yükselti farklılıkları gibi nedenlerden dolayı çeşitli yaşam alanlarına sahiptir. Ayrıca Asya ve Avrupa kıtaları arsında bir geçit oluşturması ve 3 ayrı bitki coğrafyası bölgesinin geçiş alanında bulunması sonucu zengin floristik yapıya sahiptir (Özhatay vd 2003). Fakat bu eşsiz ve zengin floristik yapıya rağmen bazen yasal boşlukların etkisiyle doğal bitkilerimiz ciddi anlamda korunamamaktadır. Amerika ve Avrupa Birliği ülkeleri başta olmak üzere birçok ülkede bitkilerin korunmasına yönelik çalışmalar büyük önem kazanmaktadır (Godt vd 1995; Rossetto vd 1995).
Türkiye biyoçeşitliliğinde önemli bir yere sahip olan soğanlı bitkiler hem süs bitkisi olarak hem de parfümeri ve ilaç gibi çeşitli sanayi alanlarında büyük bir kullanım potansiyeline sahiptir. Kullanım alanlarının artmasıyla bu bitkilere olan ihtiyaç da artmıştır. Soğanlı bitkiler Türkiye’nin hemen hemen tüm bölgelerinde doğal yayılış göstermektedir. Soğanlı bitkilerin doğal populasyonları kaçak sökümler, kentleşme, yol yapımı, endüstriyel ve turizme yönelik çalışmaların artması gibi çeşitli nedenlerin etkisi ile önemli ölçüde olumsuz etkilenmekte ve sonuç olarak bu bitkilerin büyük çoğunluğu nesli tükenme tehlikesi ile karşı karşıya kalmaktadır. Türkiye kıyılarında kumul alanlarda yayılış gösteren ve tıbbi amaçlı kullanım potansiyeli bulunan kum zambağı (Pancratium maritimum); biyolojik çeşitlilik bakımından ülkemizin önemli soğanlı bitkilerindendir ve ayrıca biyoçeşitlilik yönünden genetik çeşitlilik potansiyelinin belirlenmesi, korunması ve geliştirilmesi gereken bir türümüzdür.
Kum zambağı, Nergisgiller (Amaryllidaceae) familyasının Pancratium cinsine ait 21 türden biri olan soğanlı bir bitkidir. Kum zambağı tüm Akdeniz ülkelerine ait sahillerde, Karadeniz bölgesinde, Marmara bölgesinin Karadeniz kıyılarında ve Bulgaristan’ın güneyinde deniz kıyısının kumul alanlarında yayılış göstermektedir.
Türkiye için önemli bir gen kaynağı olan kum zambağının gelecekte milli ekonomiye büyük oranda katkı sağlamasından dolayı doğal yetişme alanlarında korunması ve çoğalması sağlanmalıdır. Kum zambağı nesli tehlike altında bulunan bir türdür. Kum zambağının, doğal yaşam alanı olan kumul sahillerinin plaj olarak kullanılması, plansız bir şekilde turizme yönelik sahillerin kapatılması, bitki soğanlarının toplanması nedeni ile doğal yaşam alanında gelişmesi tehlike altındadır.
‘Sürdürülebilir Kalkınma’ stratejisi, doğal kaynakların kullanılmasını yasaklamak yerine bu kaynaklara zarar vermeden uzun yıllar kullanma yollarının araştırılmasını hedeflemektedir. Hem ekonomik hem de çeşitlilik açısından büyük öneme sahip olan kum zambağında gen kaynaklarını koruma ve uygun üretim çalışmalarının yapılabilmesi için moleküler genetik çalışmaların yapılması gerekmektedir. Biyolojik çeşitliliğin önemli bileşenlerinden biri olan genetik çeşitliliğin belirlenmesi, ekosistemin sağlıklı olabilmesi ve sürdürülebilirliği için önemlidir. Bu bitkinin doğal populasyonlarının azalmasının önüne geçebilmek için hem geleneksel hem de biyoteknolojik yöntemlerle koruma ve üretim çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç duyulmakta ve yapılan çalışmaların moleküler çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. Genetik çeşitliliğin ortaya çıkarılmasının bir yolu moleküler belirteçler kullanılarak çalışılan türlere ait genetik yapının belirlenmesidir.
Farklı ülkelerde farklı araştırmacılar tarafından izoenzim (Sanaa vd 2010), RAPD (Zahreddine vd 2004; El-Hadidy vd 2012), AFLP (Grassi vd 2005), plastid DNA belirteçleri (De Castro vd 2012) gibi belirteçler kullanılarak kum zambağında
2
filogenetik, biyocoğrafik veya genetik yapıyı ve çeşitliliği belirlemeye yönelik çalışmalar mevcuttur; fakat yapılan literatür araştırmalarında ülkemiz populasyonlarından örneklenen moleküler düzeyde yapılmış sadece bir çalışmaya rastlanılmıştır. 2010 yılında yayınlanmış bu çalışmada sadece Mersin ilinden iki farklı bölgeden toplanan kum zambağı genotiplerinin genetik farklılıklarının SRAP ve RAPD belirteçleri kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır (Hocagil vd 2010).
Bu proje kapsamında Marmara bölgesinin Karadeniz kıyısında bulunan iki kum zambağı populasyonuna (İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Çamlıkoy Tabiat Parkı) ait 22’şer bitkinin yaprak dokusundan DNA izolasyonları yapılmış ve 8 adet RAPD primeri kullanılarak bu populasyonların genetik yapıları belirlenmiştir.
Bu çalışmada;
1. Çalışılan doğal P. maritimum populasyonlarının ilgili RAPD lokusları açısından genetik yapılarının ortaya konulması,
2. Çalışılan populasyonların genetik parametrelerinin tahmin edilmesi ile genetik çeşitlilik düzeylerinin belirlenmesi,
3. Çalışılan populasyonların RAPD belirteçleriyle belirlenen genetik çeşitlilik düzeylerinin literatürde mevcut olan diğer çalışmalarla karşılaştırılması amaçlanmıştır.
Elde edilen veriler, kum zambağı ve yakın akraba türleri ile ilgili yapılacak olan çeşitli genetik çalışmalara ve gen kaynaklarını koruma stratejilerinin belirlenmesine yönelik çalışmalara önemli katkılar sağlayacaktır.
3 2. GENEL BİLGİLER
Türkiye iki kıta arasında geçiş olması nedeniyle topoğrafya, iklim ve jeomorfolojik açıdan büyük biyoçeşitliliğe sahip bir bölgedir (Çıplak 2003). Ayrıca, Türkiye gerek farklı iklimlere sahip olması gerekse üç floristik bölgenin kesişme noktasında bulunması sebebiyle bitki türlerinin çeşitliliği açısından dünyanın zengin ülkelerinden birisidir (Şekercioğlu vd 2011). Yurdumuz, Orta Doğu ve Avrupa ülkeleri içinde hem tür sayısı hem de endemik tür bakımından en zengin ülkelerden biridir.
İklimsel çeşitlilikler, topoğrafik çeşitlilikler, jeolojik ve jeomorfolojik çeşitlilikle deniz, göl ve akarsu gibi farklı sucul ortam çeşitlilikleri, 0-5000 m’ler arasında değişen yükseklik farklılıkları, 3 farklı bitki coğrafyası bölgesinin birleştiği yerde olması, Anadolu diyagonali sınır kabul edilirse doğusu ve batısı arasında ekolojik farklılıklar bulunması ve bu durumun floristik faklılıklara da yansıması ülkemiz biyolojik çeşitliliğinin nedenlerindendir. Türkiye’de yaklaşık 12054 adet bitki taksonu bulunmaktadır ve bunlardan 3090 (%33.5) kadarı endemiktir. Bu endemik türlerden Türkiye florasında, 26 cinse bağlı 540 geofit türü bulunduğu kaydedilmektedir (Kaya ve Aksakal 2005; Özhatay ve Byfield 2005; Özel ve Erden 2010; Özhatay vd 2011).
Geofit adı verilen ve soğan, tuber, rizom gibi toprak altı organlarına sahip olan soğanlı bitkiler Türkiye’deki biyoçeşitliliğin oluşmasına önemli katkılar sağlamaktadır.
Soğanlı bitkilerin tohumdan çiçek açacak konuma gelmesi için 4-5 yıl gibi uzun bir zamanın geçmesi gerekir. Farklı kullanım alanlarına sahip olan bu bitkilere ihtiyacın sürekli artması, doğadan olan sökümlerin de artmasına yol açmaktadır. Bu da soğan ile üreyen bitkilerin doğadaki stoklarının azalmasına neden olmaktadır (Karoğlu 2010). Önlem alınmadığı takdirde bu bitkilerin neslinin tükenmesi söz konusu olacaktır. Birçok soğanlı bitki türü çeşitli tehlike kademelerinde bulunmakta olup, bazılarının doğadan sökümü Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından yasaklanmıştır (Çizelge 2.1).
Süs bitkisi olarak değerlendirilmek üzere yurtdışına gönderilen soğan ve yumruların % 90’lık kısmı doğadan sökülmekte olup, geriye kalan %10’luk kısmı ise kültürü yapılan türlerden oluşmaktadır. Her yıl doğadan yapılan söküm doğal populasyonun hızla azalmasına neden olmaktadır. Bunun sonucunda da ülkemiz geofitleri yok olma tehlikesi ile karşı karşıya kalmaktadır (Ekim vd 1992; Ildır 1993).
Soğanlı bitkilere ait ihtiyaç duyulan bitkisel materyalin karşılanmasında, doğadan toplama yerine yeterli miktarda üretim yapılarak doğayı korumanın gerekliliği de gün geçtikçe daha iyi anlaşılmaktadır. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından 1989 yılında çıkarılan yönetmelik 1991, 1995, 2005 ve 2013 yıllarında yeniden düzenlenerek yayınlanmıştır. Bu yönetmelik ile ülkemiz florasının korunması, çiçek soğanlarının tahrip edilmeden ve tüketilmeden doğadan toplanması, üretilmesi, depolanması ve ihracatı konuları disiplin altına alınmıştır. Bu yönetmeliğe göre Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından oluşturulan teknik komite her yıl ihracatı yapılan çiçek soğanlarının cins, tür, miktar, doğa kontenjanı, söküm takvimini belirlemekte ve hazırlanan doğal çiçek soğanı ihracat listesi de her yıl Ekim-Kasım aylarında resmi gazetede tebliğ edilmektedir. Bu listenin dışında teknik komitenin izni olmadan doğadan ticari amaçlarla çiçek soğanı toplayıp ihraç etmek yasaktır (Anonim 2012).
4
Çizelge 2.1. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından 2013 yılı için doğadan toplanarak ihracatı yasak olan 20 çiçek soğanı (Doğal çiçek soğanlarının 2013 yılı ihracat listesi hakkında tebliğ (tebliğ no: 2012/77)’in ekinden düzenlenmiştir.)
1. Allium (Yabani soğan) türlerinin hepsi
2. Crocus (Çiğdem) türlerinin hepsi
3. Fritillaria türleri (F. persica, F. imperalis hariç)
4. Lilium (Zambak) türleri (L. candidum ve L. martagon hariç) 5. Muscari (Muskari) türlerinin hepsi
6. Sternbergia (Kara çiğdem) türleri (S.lutea hariç) 7. Tulipa (Lale) türlerinin hepsi
8. Eminium türlerinin hepsi 9. Biarum türlerinin hepsi
10. Nympheaceae (Nilüfer) familyasına dahil türlerin hepsi 11. Orchidaceae (Salep) familyasına dahil türlerin hepsi
12. Arum (Yılanyastığı) türlerinin hepsi (Arum italicum, Arum dioscorides hariç) 13. Pancratium maritimum (Kum zambağı)
14. Hyacinthus orientalis (Şark sümbülü) 15. Gentiana lutea (Censiyan)
16. Cyclamen (Sıklamen) türleri (C. coum, C. cilicium ve C. hederefolium hariç) 17. Galanthus (Kardelen) türleri (G. elwesii ve G. woronowii hariç)
18. İris (Süsen) türleri
19. Paeonia ( Şakayık ) Türleri Diğer yumrulu ve soğanlı türler.
5
Ülkemizde doğal olarak yetişen bitkilerden hem ülke içinde yararlanılmakta hem de bir kısmı ihraç edilmektedir. Bu tür zenginliği içinde yer alan ve ihraç edilen geofitin bitkiler içinde yeri büyüktür. Yurdumuz geofitlerinin büyük kısmı Zambakgiller (Liliaceae), Nergisgiller (Amaryllidaceae) ve Süsengiller (Irıdaceae) familyaları kapsamında bulunurken, bu familyalar endemik türler bakımından da oldukça zengindir (Titiz vd 2000). Nergisgiller (Amaryllidaceae) 85 cinse ait 1100 türü içeren, özellikle Pancratium maritimum (Kum zambağı) gibi bazı türleri Avrupa ve Amerika’da bulunan bahçelerde süs bitkisi olarak yetiştirilen bir familyadır.
Amaryllidaceae familyasına dahil tüm türlerde pankratistatin, nivalin, galanthamin, tazettin, grasilin ve likorenin gibi sayısı 150’yi bulan ve Amaryllidaceae alkaloidleri olarak adlandırılan alkaloidler bulunmaktadır (Şener vd 1999; Berkov vd 2004). Bu alkaloidlerin biyolojik aktiviteleri yüksek olup, yapılarına göre antikanser, antiviral, antimikrobiyal, antileukaemial ve savunma sistemini güçlendirici etkilere sahip oldukları bilinmektedir (Şener vd 1999). Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı’nın listesine dahil olan kum zambağı bitkisi dekoratif bir bitki olmasının yanı sıra bitkide bulunan pankratistatin alkaloidinin tıbbi açıdan kanser tedavisinde kullanılması da bitkinin önemini daha çok artırmaktadır (Petit vd 1995). Pancratium maritimum Akdeniz, Atlantik, Karadeniz ve Hazar denizinde yayılış göstermektedir (Dothan 1986). Pancratium maritimum türünde yapılan birçok çalışmada, türün doğal yayılış alanında özellikle Akdeniz’in kumul sahillerinde aşırı derecede toplanması, kentleşme ve turizm nedeni ile ciddi bir şekilde tehdit altında olduğu bildirilmektedir (De Castro vd 2012; Di Maio ve De Castro 2013). Türün İtalya, Fransa, İspanya ve Girit’teki populasyonları büyüklük ve sayı açısından önemli derecede azalmıştır ve tehlike altında kategorisinde kabul edilmektedir (Zahreddine vd 2004). Hem doğanın korunması hem de ekonomik açıdan önem taşıyan bitki türlerimizin geleceği olan doğal yaşam alanlarının tahrip edilmesi ve doğadan aşırı toplama gibi nedenlerle tehdit altında bulunmaktadır (Anonim 1996).
Soğanlı bitkilerin süs bitkisi olarak değerlendirilmelerinin dışında modern tıpta da bu bitkilerden faydalanılmaktadır. Kum zambağı sahilleri süslemesi ve güzel kokusunun yanı sıra bitkide bulunan alkaloidler tıbbi olarak kullanılmaktadır (Petit vd 1995). Şener vd (2003) tarafından yapılan çalışmada Nergisgiller familyasına ait 4 bitkiden (Pancratium maritimum, Leucojum aestivum, ve Narcissus tazetta ssp.
tazetta) alkaloid izolasyonu yapılmıştır ve bu alkaloidlerin Plasmodium falciparum üzerine büyümeyi engelleyici etkileri çalışılmıştır. Sanaa vd (2013) tarafından yapılan çalışmada Tunus’dan örneklenen tehlike altındaki Pancratium maritimum’da alginik asit ve türevleri ilk defa rapor edilmiştir. Bu çalışmadan elde edilen kimyasal verinin endüstri ve eczacılıkta önemli bir yere sahip biyoaktif moleküllerle ilgili çalışmalara katkılar sağlayacağı vurgulanmıştır.
Genetik çeşitliliğin DNA düzeyinde araştırılması için kullanılan en hızlı ve etkili metotlardan birisi rasgele çoğaltılmış polimorfik DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA – RAPD) analizidir. Bu teknik, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR veya PCR) tabanlı olup değişik şekillerde genetik çeşitliliğin belirlenmesinde kullanılmaktadır (Gaiotto vd 1997; Wang ve Szmidt 2001). RAPD tekniğinde dizisi rasgele belirlenmiş (çoğunlukla 10 baz çiftlik) primerler ile birçok genin çoğaltımı sağlanabilmekte ve farklı bireylere özgü DNA profilleri belirlenmektedir. RAPD tekniği; hızlı olması, kolay uygulanabilirliği, çok az miktarda (10 nanogramdan düşük) DNA gereksinimi, çalışılan canlının DNA dizi bilgisinin gerekmemesi, maliyetinin düşük olması ve polimorfik bant sayısının yüksek olmasından dolayı tercih edilmektedir (Neale vd 1992; Wang ve Szmidt 2001; Aydın 2004; Altun 2006). RAPD
6
tekniğinin en büyük dezavantajı ise dominant özellikte bir belirteç olmasıdır. Yani çalışılan canlıdaki heterozigot genotipler belirlenememekte, sadece homozigot resesif ve dominant genotipler ortaya çıkarılmaktadır (Aydın 2004). RAPD tekniği yukarıda sayılan birçok avantajından dolayı birçok türde genetik çeşitliliklerinin belirlenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır.
Literatüre baktığımızda birçok soğanlı bitki türünde biyoteknolojik çalışmalara rastlamak mümkündür. Kum zambağında farklı araştırmacılar tarafından moleküler teknikler kullanılarak genetik çeşitliliği belirlemeye yönelik çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Zahreddine vd (2004) tarafından yapılan çalışmada Lübnan’da yayılış gösteren kum zambağı populasyonlarının genetik yapısının belirlenmesi için 10 RAPD primeri kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan 10 primerde toplam 118 band (110’u polimorfik) gözlenmiştir. Aynı çalışmada yapılan AMOVA analizleri sonucu populasyonlar arası çeşitlilik %47, populasyon içi çeşitlilik %53 olarak bulunmuştur.
El-Hadidy vd (2012) tarafından Mısır’daki Pancratium türlerinin morfolojik ve moleküler olarak taksonomik revizyonu 26 kantitatif morfolojik karakter ve RAPD primerleri kullanılarak yapılmıştır. Çalışmada 11 adet RAPD primeri kullanılmış ve 140 bant (%74.13’ü polimorfik) belirlenmiştir. Ortalama bant sayısı 12.72 ve ortalama polimorfik bant sayısı 10.09 olarak bildirilmiştir. Çalışma sonucunda Mısır’da 5 farklı Pancratium türü belirlenmiştir. De Castro vd (2012), 28 Pancratium örneği ve Nergisgiller familyasına ait (Pancratium hariç) 5 farklı örnek kullanarak yaptıkları çalışmada 4 kloroplast DNA belirteci kullanarak filogenetik ve biyocoğrafik çalışmalar yürütülmüştür. De Castro vd (2012) tarafından yapılan bu çalışma cinse ait bazı türlerin evrimsel tarihinin ve sınıflandırmadaki yerinin belirlenmesi açısından önemli bir çalışmadır.
Grassi vd (2005) tarafından 4 farklı ülkeden (Fransa, İspanya, İtalya ve Yunanistan) 10 farklı lokaliteden toplanan kum zambağında AFLP analizleri ile biyoçeşitliliğin değerlendirilmesi ve koruma stratejilerinin belirlenmesi üzerine bir çalışma yapılmıştır. Grassi vd (2005), çalışmada 6 farklı AFLP primeri kullanmıştır, kullanılan primerlerde 2 ile 11 arasında polimorfik bant gözlenmiştir. Çalışılan bazı populasyonların genetik çeşitliliğinde azalma belirlenmiş ve in situ ve ex situ koruma çalışmalarının gerekliliği vurgulanmıştır. Sanaa vd (2010), Tunus’da tehlike altında bulunan P. maritimum‘a ait ada ve anakara populasyonlarının genetik çeşitliliği üzerine bir çalışma yapmıştır. Sanaa vd (2010) ‘nin bu çalışmasında 5 ada ve 14 anakara populasyonundan 20’şer bitki örneklenmiş ve 7 izoenzimin analizi ile genetik çeşitlilik belirlenmiştir ve populasyonlar arasındaki genetik farklılaşma ortaya konmuştur. Yapılan çalışmada ada populasyonlarının genetik çeşitliliğinin anakara populasyonlarından fazla olduğu belirlenmiştir.
7 3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Bitkisel materyal
Çalışmada Kırklareli’ne bağlı İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Tekirdağ iline bağlı Çamlıkoy Tabiat Parkı’nda yer alan 2 doğal kum zambağı populasyonundan örneklenen 22’şer bitkiye ait yaprak materyali kullanılmıştır (Şekil 3.1).
Şekil 3.1. Çalışılan kum zambağı populasyonlarından genel bir görüntü 3.2. DNA izolasyonu
DNA izolasyonunda her bir kum zambağı populasyonuna ait 22 bitkiden Ağustos 2014 tarihinde toplanan yaprak materyali kullanılmıştır. Çalışmada, yaprak örnekleri Retsch® MM300 model homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiştir.
Homojenizasyon işleminin etkinliğini arttırmak için bitki örnekleri bir-iki gün önce hazırlanıp, -20ºC’de muhafaza edilmeli veya homojenizasyon işleminden hemen önce sıvı azot içinde 5-10 saniye beklettikten sonra homojenizasyon işlemine geçilmelidir. Böylece, bitki materyali daha kuru bir hale gelmekte ve homojenizasyonu kolaylaşmaktadır. Kum zambağı yaprak örnekleri, homojenizasyondan bir-iki gün önce hazırlanıp -20ºC’de bekletilmiştir.
Homojenizasyon süresi olarak üçer dakikadan oluşan iki kısım olmak üzere toplam altı dakika kullanılmıştır. Titreşim frekansı ise saniyede 30 olarak ayarlanmıştır.
8
Örneklerin iyi bir şekilde homojenize olup olmadığı kontrol edildikten sonra homojenizasyon işlemine son verilir. Eğer örnekler çok iyi homojenize olmamışsa (toz veya kına şeklinde değilse) bir-iki dakika daha tekrar homojenizasyon yapılabilir.
Örneklerin bir kısmı ise sıvı azot kullanılarak homojenize edilmiştir.
DNA izolasyonu, i-genomic Plant DNA Extraction Mini Kit kullanılarak üretici firmanın prosedürleri doğrultusunda yapılmıştır. İzole edilen DNA’larda miktar tayini Qubit® 2.0 Fluorometer kullanılarak yapılmıştır. Ayrıca izole edilen DNA’ların, izole edilen her bir örneğe ait 2.5 µl DNA ve 0.5 µl yükleme boyası (loading dye) ile karıştırılarak %1’lik agaroz jellerde (Bantların UV altında görüntülenmesi için RedSafe Nucleic Acid Staining Solution içeren) 1X TBE tamponunda 80 Voltta 30 dakika yürütülerek UV ışığı altında Gel Imaging System Vilber Lourmat Quantum ST5 ile görüntülenerek kalite kontrolü yapılmıştır. İzole edilen genomik DNA örnekleri PCR reaksiyonu için konsantrasyonu 5 ng/µl olacak şekilde sulandırıldıktan sonra PCR analizleri yapılıncaya kadar -20°C’de saklanmıştır.
3.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA’nın çoğaltılması
Bu çalışmada kullanılacak RAPD primerleri, daha önce P. maritimum için farklı araştırmacılar tarafından denenmiş ve kullanılmış olan, rastgele belirlenen 10 bazlı oligonükleotit zincirleridir. Projede kullanılmak üzere optimizasyonları yapılan RAPD primerleri şunlardır; OPA-01, OPA-02, OPB-10, OPB-12, OPN-06, OPN-12, OPV-08 ve OPV-18 (Operon Technologies Inc., Alameda CA). Çalışmada kullanılan primerlerin sekans bilgileri Çizelge 3.1’de gösterilmektedir.
Çizelge 3.1. Çalışmada optimize edilen RAPD primerlerinin sekans (dizi) bilgileri No Primer 5’ 3’ Sekans (dizi)
1 OPA-01 CAG GCC CTT G
2 OPA-02 TGC CGA GCT G
3 OPB-10 CTG CTG GGA C
4 OPB-12 CCT TGA CGC A
5 OPN-06 GAG ACG CAC A
6 OPN-12 CAC AGA CAC C
7 OPV-08 GGA CGG CGT T
8 OPV-18 TGG TGG CGT T
PCR işleminin optimizasyon aşamasında kum zambağı populasyonlarından rastgele bireyler seçilmiş ve bütün primerlerin optimizasyonu için aynı bireyler kullanılmıştır. PCR işleminin ön denemesinde farklı DNA miktarı, Taq DNA polimeraz miktarı, değişik MgCl2 ve primer konsantrasyonları denenmiştir. PCR optimizasyonu için değişik DNA (10, 15 ve 20 ng), primer (5 pmol ve 10 pmol), dNTP karışımı (0.2 ve 0.3 mM), MgCl2 (2.5 mM, 3 mM ve 3.5 mM) ve Tag DNA polimeraz (1U ve 2U) konsantrasyonları denenmiştir. Optimum reaksiyon koşulları, denenen primerler için Çizelge 3.2’de verilmiştir. Ayrıca çalışmada kum zambağı için optimize edilen PCR döngüleri de Çizelge 3.3’de gösterilmiştir.
9
Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan RAPD primerleri için optimize edilmiş PCR koşulları
PCR Karışımı Son Konsantrasyon
10X PCR Buffer 1X
MgCl2 3 mM
DNTPs 0.3 mM
Primer 10 pmol
Taq DNA Polimeraz 2 U
DNA 20 ng
Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan RAPD primerleri için optimize edilmiş PCR döngüleri
Basamak Sıcaklık Süre Döngü sayısı
1 94o C 3 dk 1
2
94o C 37o C 72o C
1 dk 1 dk 1 dk
45
3 72o C 10 dk 1
4 4o C Bekle
PCR işlemi için karışım hazırlanırken öncelikle seyreltilmiş olan DNA’dan 4 µl (20 ng/µl) PCR tüplerine konmakta ve daha sonra ise hazırlanan karışımdan (mastermix) 21 µl koyulup toplam hacim 25 µl olarak ayarlanmaktadır (Çizelge 3.2).
DNA amplifikasyonları Çizelge 3.2 ve 3.3’de verilen koşullarda Applied Biosystems®
Veriti® Thermal Cycler ve/veya ProFlex™ 3 x 32-well PCR System kullanılarak sağlanmıştır. DNA amplifikasyonları sonucunda elde edilen PCR ürünleri (her biri için 5 µl) ve 1 µl Yükleme boyası (Loading dye) karıştırılarak %1.7’lik agaroz jellerde (Bantların UV altında görüntülenmesi için RedSafe Nucleic Acid Staining Solution içeren) yürütülmüştür. Jeller 1X TBE tamponunda 120 Voltta 2 saat yürütülerek UV ışığı altında Gel Imaging System Vilber Lourmat Quantum ST5 ile görüntülenerek jelde oluşan bantlaşmalar ve bantların büyüklükleri belirlenmiştir. Jellerde görülen bant büyüklükleri Gel Imaging System Vilber Lourmat Quantum ST5 görüntüleme sistemine ait programda belirlenmiştir. Optimizasyonu yapılan primerlerin çoğunun verdiği bantlar aşağıda örnek şekillerde (Şekil 3.2-3.6) gösterilmiştir. Bütün şekillerde ilk kuyucukta (soldaki ilk örnek) DNA merdiveni olarak bilinen ve 100 ile 3000 baz çifti arasında bantlar içeren DNA standardı (GenerulerTM 100 base pair DNA ladder plus, MBI Fermantase, Litvanya) kullanılmıştır.
10
Şekil 3.2. Örneklerin, OPN-06 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA parçalarına ait jel görüntüsü
Şekil 3.3. Örneklerin, OPN-12 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA parçalarına ait jel görüntüsü
11
Şekil 3.4. Örneklerin, OPA-02 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA parçalarına ait jel görüntüsü
Şekil 3.5. Örneklerin, OPB-10 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA parçalarına ait jel görüntüsü
12
Şekil 3.6. Örneklerin, OPV-18 primeri ile çoğaltımı sonucu oluşan DNA parçalarına ait jel görüntüsü
3.4. Moleküler verilerin analizi
Her bir primerin jelde sahip olduğu her bir bölge bir lokus olarak alınmıştır. Her bir birey için bir primerde görülen ayrı ayrı bantlar ise belirli bir allelin ifadesi olarak değerlendirilmiştir. Çalışılan bir örnekte RAPD primerine ait bantın gözlenmesi durumunda 1 rakamı, gözlenmemesi durumunda ise 0 rakamı kullanılmıştır. Bu ilkeye dayanarak, analiz edilen her bir primer için, populasyonlardaki bireylerin her birinin sahip olduğu diploid genotipler belirlenmiştir.
Populasyonların genetik çeşitliliğini belirleyebilmek için her bir populasyonda, polimorfik lokuslar ve yüzdeleri, polimorfik lokuslardaki ortalama allel sayıları hesaplanmıştır. Bantlaşmalar sonucu elde edilen veriler skorlandıktan sonra istatistiksel analizleri POPGENE (Version 1.31) (Yeh vd 1999) ve GENALEX (Version 6.3) (Peakall ve Smouse, 2006) istatistik paket programları kullanılarak yapılmıştır.
Bu programlar ile populasyonda gözlenen allel sayısı (Na), etkili allel sayısı (Ne), beklenen heterozigotluk (He), Shannon sabiti (I), polimorfik lokus sayısı (P) ve oranı ve standart hataları hesaplanmıştır.
13 4. BULGULAR
Analizler sonucunda çalışılan sekiz RAPD primerinin her biri için öncelikle bantlaşma fenotipleri belirlenmiştir. Çalışılan her bir primerde görülen farklı büyüklükte bölgeler lokus, bu bölgelerde görülen farklı büyüklükteki bantlar ise allel olarak ele alınmıştır. Çalışılan iki populasyonda sekiz primer için net bir şekilde belirlenebilen 70 lokus değerlendirmeye alınmıştır. Çalışılan sekiz primerde gözlenen lokus sayısının beş (OPB-10) ile 15 (OPN-06) arasında değiştiği belirlenmiştir.
Çalışılan sekiz primerde polimorfik olarak gözlenmiştir. Çalışılan 2 populasyonda 8 primer için değerlendirmeye alınan 70 lokusun 3 tanesi monomorfik, 67 tanesi polimorfik olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.1).
Çizelge 4.1. Çalışılan iki kum zambağı populasyonundan elde edilen RAPD bantlarına ait bilgiler
RAPD Primeri
Polimorfik
Lokus Sayısı Monomorfik
Lokus Sayısı Toplam
Lokus Sayısı Bant Aralığı (bç) (min - max)
OPA-01 11 0 11 230 – 1940
OPA-02 8 2 10 295 – 1690
OPB-10 4 1 5 370 – 1500
OPB-12 9 0 9 315 – 1380
OPN-06 15 0 15 270 – 1400
OPN-12 6 0 6 490 – 2350
OPV-08 6 0 6 380 – 1360
OPV-18 8 0 8 160 – 1100
Toplam 67 3 70 -
Çalışılan iki populasyonun sekiz primer için sahip olduğu gözlenen allel sayısı (Na), etkili allel sayısı (Ne), beklenen heterozigotluk (He), polimorfik lokus sayısı ve polimorfik lokus yüzdesi, Shannon sabiti (I) ve standart hataları Çizelge 4.2’de gösterilmektedir. Çizelge 4.2’de belirtilen değerler her bir populasyonun sahip olduğu ortalama değerlerdir. Çizelge 4.2’nin en alt satırında belirtilen ortalama değer ise, bütün populasyonlar tek bir populasyon halinde alınarak yapılan analizler sonucunda elde edilen ortalama değerlerdir.
14
Çizelge 4.2. Çalışılan iki kum zambağı populasyonunda gözlenen allel sayısı (Na), etkili allel sayısı (Ne), beklenen heterozigotluk (He), Shannon sabiti (I), polimorfik lokus sayısı (P) ve oranı ve standart hataları (SE)
Populasyon Na Ne He I P %P
İğneada 1.914
±0.034 1.501
±0.041 0.297
±0.020 0.449
±0.027 64 91.43
Çamlıkoy 1.771
±0.071 1.378
±0.038 0.237
±0.020 0.372
±0.027 60 88.57
Ortalama 1.843
±0.040 1.440
±0.028 0.267
±0.014 0.411
±0.019 67 95.71
Şekil 4.1. Çalışılan kum zambağı populasyonlarına ait RAPD lokusu bilgileri ve heterozigotluk düzeyi
Çalışılan iki kum zambağı populasyonunda en düşük gözlenen ve etkili allel sayıları Çamlıkoy populasyonunda (Bkz. Çizelge 4.2) görülmüştür. Benzer durum, beklenen heterozigotluk (He), Shannon sabiti (I), polimorfik lokus sayısı (P) ve oranlarında da görülmüştür (Çizelge 4.2 ve Şekil 4.1). İğneada populasyonunda gözlenen 70 lokusun 66 tanesinin frekansı %5’den yüksektir. Ayrıca İğneada populasyonunda 6 adet (OPV18-5, OPV18-7, OPV18-8, OPA01-9, OPA01-10 ve OPA01-11) populasyona özgü lokus (private locus) gözlenmiştir (Bkz. EK 1, Şekil 4.1). Çamlıkoy populasyonunda ise değerlendirmeye alınan 70 lokustan 64 tanesi gözlenmiş, bunlardan 59 tanesinin frekansının %5’den yüksek olduğu belirlenmiştir.
Analiz edilen populasyonlara ait genetik çeşitlilik parametrelerine bakıldığında ortalama heterozigotluk değeri (Ht) 0.2808, populasyonlar içindeki ortalama heterozigotluk değeri (Hs) ise 0.2671 olarak belirlenmiştir. Analiz edilen populasyonlara ait genetik farklılaşma katsayısı ise (Gst) 0.0486 olarak hesaplanmıştır. Buna göre, populasyonların sahip olduğu genetik çeşitliliğin büyük bir kısmının (%95.14) populasyon içinde olduğu anlaşılmaktadır.
15 5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Kum zambağı ile ilgili olarak daha önce farklı ülkelerde farklı araştırmacılar tarafından izoenzim (Sanaa vd 2010), RAPD (Zahreddine vd 2004; El-Hadidy vd 2012), AFLP (Grassi vd 2005), plastid DNA belirteçleri (De Castro vd 2012) gibi belirteçler kullanılarak filogenetik, biyocoğrafik veya genetik yapıyı ve çeşitliliği belirlemeye yönelik çalışmalar yapılmıştır. Ülkemiz populasyonlarından örneklenen moleküler düzeyde yapılmış sadece bir çalışma mevcuttur. 2010 yılında IV. Ulusal Süs Bitkileri Kongresinde poster olarak yayınlanmış bu çalışmada Mersin ilinden iki farklı bölgeden toplanan kum zambağı genotiplerinin genetik farklılıklarının SRAP ve RAPD belirteçleri kullanılarak belirlendiği bildirilmiştir (Hocagil vd 2010).
Genetik çeşitlilik parametrelerinden biri olan gözlenen ortalama allel sayısı (Na), çalışılan iki populasyon ve lokuslar için 1.843, ortalama etkili allel sayısı (Ne) ise 1.440 olarak bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.2.). Her iki parametrenin de İğneada populasyonunda Çamlıkoy populasyonuna göre nispeten daha yüksek olduğu görülmüştür. Çalışılan sekiz RAPD primeride polimorfik olarak gözlenmiştir.
Çalışmada değerlendirmeye alınan 70 lokusun 3 tanesi monomorfik, 67 tanesi polimorfik olarak belirlenmiştir. Zahreddine vd (2004) tarafından yapılan çalışmada Lübnan’da yayılış gösteren 8 adet kum zambağı populasyonlarının genetik yapısının belirlenmesi için 2 adet OPA ve 8 adet OPB primeri olmak üzere toplam 10 RAPD primeri kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan 10 primerde toplam 118 bant gözlenmiştir.
Gözlemlenen lokusların 110 tanesi polimorfik olarak saptanmıştır. El-Hadidy vd (2012) tarafından Mısır’da yayılış gösteren Pancratium türlerinin (P. maritimum, P.
sickenbergeri, P. arabicum, P. trianthum, P. tortuosum) morfolojik ve moleküler olarak taksonomik revizyonu 26 kantitatif morfolojik karakter ve RAPD primerleri kullanılarak yapılmıştır. Çalışmada 11 adet RAPD primeri (OPA, OPB ve OPC serisinden primerler) kullanılmış ve 140 bant belirlenmiştir. Gözlemlenen lokusların 111 (%74.13) tanesi polimorfik olarak saptanmıştır. Aynı çalışmada, primer başına düşen ortalama bant sayısı 12.72 ve ortalama polimorfik bant sayısı 10.09 olarak bildirilmiştir. El-Hadidy vd (2012) tarafından yapılan bu çalışmada morfolojik ve ekolojik olarak birbirine çok benzeyen P. maritimum ve P. arabicum türlerinin RAPD analizi ile daha etkin bir şekilde birbirinden ayrıldığı ve P. tortuosum’un da çalışılan diğer türlerden kolayca ayrıldığı bildirilmektedir. Ayrıca, çalışma sonucunda Mısır’da 5 farklı Pancratium türü belirlenmiştir. Bu proje çalışmasında bulunan değerler, daha önce kum zambağında RAPD belirteçleri ile yapılan çalışmalarda belirtilen değerler ile paralellik göstermektedir.
Sanaa vd (2010), Tunus’da tehlike altında bulunan P. maritimum‘a ait 19 populasyonunun genetik çeşitliliği üzerine 7 izoenzim belirteci kullanarak bir çalışma yapmıştır. Sanaa vd (2010) ‘nin bu çalışmasında 5 ada ve 14 anakara populasyonundan 20’şer bitki örneklenmiş ve ICD, 6-PGD, PGM, MDH, PGI ve GOT enzimleri ile genetik çeşitlilik belirlenmiştir ve populasyonlar arasındaki genetik farklılaşma ortaya konmuştur. Sanaa vd (2010), gözlenen ortalama allel sayısını (Na) ada populasyonları için 1.37, anakara populasyonları için 1.30 olarak bildirmiştir. Aynı çalışmada polimorfik lokus oranı ada populasyonları için %37.14, anakara populasyonları için %30.95 olarak hesaplanmıştır. Bu değerler ada populasyonlarının genetik çeşitliliğinin anakara populasyonlarından fazla olduğunu göstermektedir.
Grassi vd (2005) tarafından yapılan çalışmada 4 farklı ülkeden (Fransa, İspanya, İtalya ve Yunanistan) 10 farklı lokaliteden kum zambağı yaprak örnekleri
16
toplanmıştır. Grassi vd (2005), AFLP analizleri ile biyoçeşitliliğin değerlendirilmesini ve koruma stratejilerinin belirlenmesini amaçlamıştır. Grassi vd (2005) çalışmada 6 farklı AFLP primeri kullanmıştır, 10 populasyon için toplam 956 bant gözlenmiş; fakat bu bantların %3.56’sı (34 bant) polimorfik olarak belirlenmiştir. Aynı çalışmada kullanılan primerlerde 2 ile 11 arasında polimorfik bant gözlenmiştir. De Castro vd (2012), 28 Pancratium örneği ve Nergisgiller familyasına ait (Pancratium hariç) 5 farklı örnek kullanarak yaptıkları çalışmada 4 kloroplast DNA belirteci ile filogenetik ve biyocoğrafik çalışma yapmışlardır. Çalışmada kloroplast DNA belirteci olarak 2 gen bölgesi (rbcL and ndhF), 1 trnL(UAA)–trnF(GAA)] ITS bölgesi ve 1 intron [trnL(UAA)] bölgesi kullanılmıştır. De Castro vd (2012) tarafından yapılan çalışma sonucunda P. arabicum ve P. linosae’nın P. maritimum ile aynı grupta yer aldığı ve plastid DNA dizisi bakımından P. hirtum’un P. trianthum aksesyonlarına benzediği bildirilmiştir. De Castro vd (2012) tarafından yapılan bu çalışma cinse ait bazı türlerin evrimsel tarihinin ve sınıflandırmadaki yerinin belirlenmesi açısından önemli bir çalışmadır. Di Maio ve De Castro 2013 tarafından yapılan çalışmada, P. maritimum‘a özgü 21 mikrosatellit belirteci karakterize edilmiş ve geliştirilmiştir. Çalışmada coğrafik olarak 3 farklı populasyonun (İsrail, İtalya ve İspanya) her birinden 16 birey olmak üzere toplam 48 birey çalışılmıştır. Karakterize edilen 21 mikrosatellit belirtecinden 16 tanesi polimorfik, 5 tanesi monomorfik olarak bulunmuştur. 21 mikrosatellit belirteci için 98 allel belirlenmiştir. Her bir primere ait allel sayıları 1 ile 11 arasında (ortalama 4.4) değişmiştir. Çalışmada P. maritimum‘a özgü geliştirilen bu mikrosatellit belirteçlerinin gelecekte yapılacak gen koruma çalışmalarında, genetik yapının belirlenmesi, genetik çeşitlilik ve gen akımı çalışmalarında uygulanabilirliği vurgulanmıştır.
Çizelge 4.2’deki veriler, İğneada ve Çamlıkoy populasyonlarına ait bireylerin genetik çeşitliliğine ait bilgileri ortaya koymaktadır. Genetik çeşitlilik parametrelerinden biri olan Shannon sabiti (I) ve beklenen heterozigotluk (He) değerleri sırası ile ortalama 0.411±0.019 ve 0.267±0.014 olarak bulunmuştur.
Zahreddine vd (2004) tarafından yapılan çalışmada Nei’nin tarafsız genetik farklılık katsayısı ortalama 0.09 (0.06 ile 0.11 arasında değişen) olarak bildirilmiştir, bu düşük değer bireylerin genellikle kendi kendilerine tozlaştıklarını gösterdiği sonucuna varılmıştır. Bu proje çalışmasındaki populasyonlara ait genetik çeşitliliğin göstergesi olan He ve I değerleri Zahreddine vd (2004)’nin çalışmasındaki populasyonlardan yüksek bulunmuştur. Bartish vd (1999), Allium aasea Ownbey and A. simillimum L.F.
Hend. (Liliaceae)’da Nei’nin genetik farklılık katsayısını sırası ile 0.274 ve 0.278 olarak hesaplamış ve bu değerlerin karşılıklı döllenme davranışının göstergesi olduğunu bildirmiştir. Sanaa vd (2010) tarafından yapılan çalışmada ortalama beklenen heterozigotluk (He) 0.100 ve ortalama gözlenen heterozigotluk (Ho) 0.086 olarak hesaplanmıştır. Aynı çalışmada Hardy–Weinberg dengesinden istatistiki olarak önemli derecede sapmalar ve önemli derecede heterozigotluk eksikliği (Fıs = 0.195) bildirilmiştir. Sanaa vd (2010)’nun çalışmasından elde edilen sonuçların Hamrick ve Godt (1990) tarafından hayvanlarla tozlaşan ve karşılıklı döllenen tohumlu bitkiler için bildirilen değerlerden biraz düşük olduğu görülmüştür (Na = 1.54, P = 35.90% and He = 0.124). Aynı çalışmada ortalama He değeri ada populasyonunda 0.125, anakara populasyonunda 0.075 olarak saptanmıştır. Ada populasyonlarında değerlerin anakaraya oranla yüksek olmasının şans, yüksek göç oranı ve farklılaşmış anakara populasyonundan meydana gelen göçler ile açıklanabileceği belirtilmiştir. Di Maio ve De Castro 2013 tarafından SSR belirteçleri kullanılarak yapılan çalışmada her bir lokus için gözlenen heterozigotluk değeri (Ho) 0.000 ile 1.000 arasında, beklenen heterozigotluk değeri (He) ise 0.000 ile 0.830
17
arasında bildirilmiştir. 11 SSR lokusunun ise Hardy–Weinberg dengesinden sapmalar gösterdiği bulunmuştur (P˂0.01).
Bu proje çalışmasında, analiz edilen populasyonlara ait genetik çeşitlilik parametrelerine bakıldığında ortalama heterozigotluk değeri (Ht) 0.2808, populasyonlar içindeki ortalama heterozigotluk değeri (Hs) ise 0.2671 olarak belirlenmiştir. Analiz edilen populasyonlara ait genetik farklılaşma katsayısı ise (Gst) 0.0486 olarak hesaplanmıştır. Buna göre, populasyonların sahip olduğu genetik çeşitliliğin büyük bir kısmının (%95.14) populasyon içinde olduğu anlaşılmaktadır.
Zahreddine vd (2004), AMOVA analizleri sonucu populasyonlar arası genetik çeşitliliği %47, populasyon içi genetik çeşitliliği %53 olarak bulmuştur. Grassi vd (2005) tarafından yapılan çalışmada ortalama Gst değeri 0.5169 olarak bildirilmiştir.
Grassi vd (2005)’in çalışmasından elde edilen Gst değerine göre farklı populasyonlar arası gen akımı oranının azaldığı görülmektedir. Aynı çalışmada Nm değerinin nesil başına 0.4673 olarak hesaplanması gen akım oranının azaldığını desteklemektedir ve bazı populasyonların genetik çeşitliliğinde meydana gelen azalma nedeniyle öncelikle bu populasyonlarda in situ ve ex situ koruma çalışmalarının gerekliliği çalışmada vurgulanmıştır.
Kum zambağının Akdeniz ülkelerinde geniş alanlarda yayılış gösterdiği rapor edilmiş olmasına rağmen gereğinden fazla toplanması, kentleşme ve gelişen turizmle birlikte tehdit altında olduğu da görülmektedir. (www.minenv.gr/4/41/4107/e410705.
html). Örneğin; Fransa sahilleri boyunca yayılış gösteren P. maritimum populasyonları kentleşme nedeniyle ciddi bir şekilde azalmış ve koruma altına alınmıştır (www.perso.club-internet.fr/v_pascal/amaryllidaceae/321_pancratium.htm).
İspanya’da ve Tunus’da benzer nedenlerle kum zambağı populasyonlarının azaldığı tespit edilmiştir (www.ddgi.es/espais/illirima.htm, Sanaa vd 2010). Girit’te ise kum zambağı tehlike altında olan türler kapsamına alınmış ve 1996 yılından beri türün
bulunduğu kumullarda koruma çalışması sürmektedir
(www.greenglobe.org/econett/practice/prac0043.htm). Lübnan’daki kum zambağı populasyonlarına ev sahipliği yapan kumul habitata verilen zararların çok ciddi boyutlara ulaştığı ve sahillerin düzenlenmesinde kum zambağı populasyonlarına zarar vermeden, peyzaj çalışmalarının içine dahil edilerek koruma çalışmalarının yapılmasının gerektiği bildirilmiştir (Zahreddine vd 2004).
Türkiye’de ise özellikle Kırklareli, Tekirdağ, İstanbul, Bolu, Bartın, Sinop, Samsun, Giresun, Trabzon, Antalya, Mersin ve Adana’nın kumul sahillerinde doğal olarak bulunmaktadır. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından 2013 yılı için doğadan toplanarak ihracatı yasak olan 20 çiçek soğanı arasında kum zambağı da yer almaktadır. Özellikle çalışma için örneklerin toplandığı İğneada Longoz Ormanları Milli Parkı ve Çamlıkoy Tabiat Parkında yer alan 2 doğal kum zambağı populasyonu doğadan rastgele toplanması, turizm, halkın yeterince tür hakkında bilgilendirilmemesi, insan eliyle meydana getirilen çevre kirliliği gibi nedenlerle ciddi tehlike altındadır ve gerekli gen koruma çalışmaları ciddi olarak planlanmalıdır. Bu çalışma ile türün sadece Trakya bölgesindeki iki populasyonu ele alınmış ve önemli bilgiler literatüre kazandırılmıştır. Türkiye’de bulunan diğer populasyonların genetik açıdan değerlendirilmesi için yeni çalışmaların yapılması önemlidir. Ülkemizde yer alan bütün populasyonları içeren etkin moleküler belirteçler kullanılarak yapılacak yeni çalışmalar türün gen kaynaklarını koruma stratejilerinin belirlenmesinde önemli rol oynayacaktır.
18
P. maritimum gibi birçok canlı türüne ev sahipliği yapan kumul habitatların özellikle insan eliyle zarar görmesi gün geçtikçe ciddi boyutlara ulaşmaktadır. Bunun sonucunda bu habitatlarda yaşayan canlıların nesilleri tehlike altına girmekte ve içinde bulundukları tehlike kategorisinde bir üst seviyeye çıkmalarına neden olmaktadır. Bu nedenle acil bir şekilde koruma çalışmaları yapılmazsa ileride gen kaynakları açısından ciddi sonuçlarla karşılaşmak olasıdır. Türlerin genetik çeşitliliğinin analizi koruma çalışmaları için önemli bir araçtır; bu nedenle özellikle tehlike altında olan türlerde gen koruma çalışmalarının planlanması için etkili belirteçler ile türün genetik yapısının ortaya konulması ve genetik çeşitliliğinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. İnsan aktivitelerinin türlerin bütünlüğü ve genetik çeşitliliğine olan katkısı aşikardır. Bu nedenle ciddi tehlike altında olan bütün türler için her birine uygun in situ ve ex situ gen koruma çalışmaları planlanmalıdır.
Ex situ gen koruma çalışmaları bulunduğu bölgedeki bütün populasyonlardan yeterli sayıda tohum ve soğan toplanarak uygun habitatlarda yetiştirilmesi ile veya yeteri kadar tohum veya soğan elde edilemiyorsa doku kültürü çalışmaları ile kısa sürede fazla sayıda bitki elde edilip onların yetiştirilmesi ile sağlanabilir. Ayrıca etkili koruma programlarının oluşturulması için kantitatif karakterler kullanılarak yapılan çalışmalardan elde edilen verilerin moleküler belirteçlerden elde edilen verilerle ilişkilendirilmesi de önemlidir.
19 6. KAYNAKLAR
ALTUN Z.G. DNA işaretleyiciler (Markör) ve Türkiye’de orman ağaçları ıslahında kullanımı. Ege Ormancılık Araştırma Müdürlüğü Dergisi, Yayın No:295, ss:20- 36, İzmir. (2006).
ANONİM (1996), Soğanlı Bitkiler (Türkiye’den İhracatı Yapılan Türlerin Tanıtım ve Üretim Rehberi), Doğal Hayatı Koruma Derneği, İstanbul, 84 s.
ANONİM (2012), Doğal Çiçek Soğanlarının Üretimi, Doğadan Toplanması ve İhracatına İlişkin Yönetmelik, Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, 19 Temmuz 2012, Sayı: 28358,
http://www.resmigazete.gov.tr/eskiler/2012/07/20120719-4.htm
AYDIN S.Ö. RAPD (Rastgele arttırılmış polimorfik DNA) belirleyicileri ve bitki sistematiği. Dumlupınar Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, Sayı:6, 113-130, (2004).
BARTISH V., Jeppsson N., Nybom H., Population genetic structure in the dioecious pioneer plant species Hippophae rhamnoides investigated by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Molecular Ecology 8, 791-802, (1999).
BERKOV S., Evstatieva L., Popov S., Alkaloids in Bulgarian Pancratium maritimum L., Z. Naturforsch, 59c, 65-69, (2004).
CIPLAK B., Distribution of Tettigoniinae (Orthoptera, Tettigoniidae) bushcrickets in Turkey: the importance of the Anatolian Taurus Mountains in biodiversity and implications for conservation, Biodivers. Conserv., 12, 47-64, (2003).
DE CASTRO O., Brullo S., Colombo P., Jury S., De Luca P., Di Maio A., Phylogenetic and biogeographical inferences for Pancratium (Amaryllidaceae), with an emphasis on the Mediterranean species based on plastid sequence data, Journal of the Linnean Society, 170, 12-28, (2012).
DI MAIO A., De Castro O., Development and characterization of 21 microsatellite markers for Pancratium maritimum L. (Amaryllidaceae), Conservation Genetic Resources, 5(4), 911-914, (2013).
DOTHAN N.F., Flora Palaestina Vol. 4. Israel Academy of Sciences and Humanities, Jerusalem, Israel. (1986).
EKİM T., Arslan N., Koyuncu M., Exported flower bulbs from Turkey and measurements taken, Acta Hortic., 325, 861-866, (1992).
EL-HADIDY A., El-Ghani M.A., Amer W., Hassan R., Morphological and molecular differentiation between Egyptian species of Pancratium L. (Amaryllidaceae), Acta biologica cracoviensia series botanica, 54/1, 53-64, (2012).
GAIOTTO F.A., Bramucci, M. and Grattapaglia, D. Estimation of outcrossing rate in a breeding population of Eucalyptus urophylla with dominant RAPD and AFLP markers. Theor. Appl. Genet. 95: 842-849, (1997).
GODT M.W., Hamrick J.L., Bratton S., Genetic diversity in a threatened wetland species, Helonias bullata (Liliaceae), Conservation Biology, 9, 596-604, (1995).
GRASSI F., Cazzaniga E., Minuto L., Peccenini S., Barberis G., Basso B., Evaluation of biodiversity and conservation strategies in Pancratium maritimum L. for the Northern Tyrrhenian Sea, Biodiversity and Conservation, 14, 2159–2169, (2005).
HAMRICK J.L., Godt M.J.W., Allozyme diversity in plant species. In: Brown, A.H.D., Clegg, M.T., Kahler, A.L., Weir, B.S. (Eds.), Plant Population Genetics, Breeding, and Genetic Resources. Sinauer, Sunderland, MA, USA, pp. 43–63.
(1990).
HOCAGİL M.M., Pınar H., Ulun A., Denli N., Mersin İlinde İki Farklı Bölgeden Belirlenen Kum Zambağı (Pancratium maritimum L.) Genotiplerinin Genetik
20
Farklılıklarının SRAP ve RAPD Markırları Yardımıyla Belirlenmesi. IV. Ulusal Süs Bitkileri Kongresi, 20-22 Ekim, Mersin, (2010).
ILDIR S., VI. 5 yıllık kalkınma planı: Bitkisel ürünler (doğal çiçek soğanları süs bitkileri grubu) özel ihtisas komisyonu, Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü, Yalova, (1993).
KAROĞLU C., Soğanlı Bitkiler ve İn Vitro Hızlı Çoğaltım, Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsü Dergisi, 19, 24-29, (2010).
KAYA Y., Aksakal Ö., Endemik bitkilerin dünya ve Türkiye’deki dağılımı, Erzincan Eğitim Fakültesi Dergisi, 7, 1, 85-99, (2005).
NEALE D.B., Devey, M.E., Jermstad, K.D., Ahuja, M.R., Alosi, M.C. and Marshall, K.A. Use of DNA markers in Forest Tree Improvement Research. New Forests.
6: 391-407, (1992).
PEAKALL R, Smouse PE, GENALEX 6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Mol Ecol Notes, 6, 288-295, (2006).
PETIT G., Groszek G., Backhaus R., Doubek D., Barr R., Meerow A., Antineoplastic agents. An investigation of the Amaryllidaceae genus Himenocallis, J. Natural Products-LLoydia, 58, 756-759, (1995).
ROSSETTO M., Weaver P.K., Dixon K.W., Use of RAPD analysis in devising conservation strategies for the rare and endangered Grevillea scapigera (Proteaceae), Molecular Ecology, 4, 321-329, (1995).
SANAA A., Fadhel N.B., Genetic diversity in mainland and island populations of the endangered Pancratium maritimum L. (Amaryllidaceae) in Tunisia, Scientia Horticulturae, 125, 740-747, (2010).
SANAA A., Boulila A., Boussaid M., Fadhel N.B., Alginic acid and derivatives, new polymers from the endangered Pancratium maritimum L., Industrial Crops and Products, 44, 290-293, (2013).
ŞENER B., Orhan İ., Satayavivad J., Antimalarial Activity Screening of Some Alkaloids and the Plant Extracts from Amaryllidaceae, Phytother. Res., 17, 1220-1223, (2003).
ŞENER B., Koyuncu M., Bingöl F and Muhtar F., production of bioactive alkaloids from turkish geophytes, IUPAC (1999)
http://www.iupac.org/symposia/proceedings/phuket97/sener.html
ŞEKERCİOĞLU, Ç.H., Anderson S., Akçay E., Bilgin R., Can Ö.E., Semiz G., Tavşanoğlu Ç., Yokeş M.B., Soyumert A., İpekdal K., Sağlam İ.K., Yücel M., Dalfes H.N., Turkey’s globally important biodiversity in crisis, Biological Conservation, 144, 2752–2769, (2011).
ÖZEL A., Erden K., İhraç edilen bazı geofitlerin pazarlanabilir soğan üretme kapasiteleri ve bazı bitkisel özelliklerinin belirlenmesi, Hr.Ü.Z.F. Dergisi, 14, 2, 90-99, (2010).
ÖZHATAY N., Byfield A., Atay S., Türkiye’nin Önemli Bitki Alanı, Doğal Hayatı Koruma Vakfı yayını, Mas Matbaacılık, İstanbul, (2003).
ÖZHATAY N., Byfield A., Türkiye’nin Önemli Bitki Alanı, Doğal Hayatı Koruma Vakfı, s.1-24, 476 sf, İstanbul, (2005).
ÖZHATAY F.N., Kültür Ş., Gürdal M.B., Check-list of additional taxa to the supplement Flora of Turkey V, Turkish Journal of Botany, 35, 589-624, (2011).
TİTİZ S., Çakıroğlu N., Birişci Y.T., Çakmak S., Süs Bitkileri Üretim ve Ticaretindeki Gelişmeler, Tarımsal Kongre I. Cilt. S: 709-740, (2000).
WANG X.R. and Szmidt, A.E. Molecular markers in population genetics of forest trees. Scand. J. For. Res. 16: 199-220, (2001).
YEH F.C., Yang R., Boyle T., POPGENE Version 1.32. Windows-based software for population genetics analysis, (1999).
21
ZAHREDDINE H., Clubbe c., Baalbaki R., Ghalayini A., Talhouk S.N., Status of native species in threatened Mediterranean habitats: the case of Pancratium maritimum L. (sea daffodil) in Lebanon, Biological Conservation, 120, 11-18, (2004).
22 7. EKLER
EK-1: Çalışılan populasyonlarda gözlemlenen 70 lokusa ait genetik çeşitlilik parametreleri
Populasyon Lokus Frekans
1 (Bant
var)
0 (Bant
yok)
Na Ne I He
İğneada OPN06-1 0.409 0.231 0.769 2.000 1.552 0.541 0.356 OPN06-2 0.364 0.202 0.798 2.000 1.476 0.504 0.323 OPN06-3 0.273 0.147 0.853 2.000 1.335 0.418 0.251 OPN06-4 0.318 0.174 0.826 2.000 1.404 0.463 0.288 OPN06-5 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPN06-6 0.136 0.071 0.929 2.000 1.151 0.255 0.131 OPN06-7 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 OPN06-8 0.636 0.397 0.603 2.000 1.919 0.672 0.479 OPN06-9 0.727 0.478 0.522 2.000 1.996 0.692 0.499 OPN06-10 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPN06-11 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.000 OPN06-12 0.500 0.293 0.707 2.000 1.707 0.605 0.414 OPN06-13 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.000 OPN06-14 0.091 0.047 0.953 2.000 1.097 0.188 0.089 OPN06-15 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 OPV18-1 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 OPV18-2 0.591 0.360 0.640 2.000 1.855 0.654 0.461 OPV18-3 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPV18-4 0.727 0.478 0.522 2.000 1.996 0.692 0.499 OPV18-5 0.045 0.023 0.977 2.000 1.047 0.109 0.045 OPV18-6 0.409 0.231 0.769 2.000 1.552 0.541 0.356 OPV18-7 0.136 0.071 0.929 2.000 1.151 0.255 0.131 OPV18-8 0.091 0.047 0.953 2.000 1.097 0.188 0.089 OPV08-1 0.864 0.631 0.369 2.000 1.872 0.659 0.466 OPV08-2 0.500 0.293 0.707 2.000 1.707 0.605 0.414 OPV08-3 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.000 OPV08-4 0.136 0.071 0.929 2.000 1.151 0.255 0.131 OPV08-5 0.318 0.174 0.826 2.000 1.404 0.463 0.288 OPV08-6 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 OPA02-1 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPA02-2 0.500 0.293 0.707 2.000 1.707 0.605 0.414 OPA02-3 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPA02-4 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPA02-5 0.364 0.202 0.798 2.000 1.476 0.504 0.323 OPA02-6 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPA02-7 0.591 0.360 0.640 2.000 1.855 0.654 0.461 OPA02-8 0.636 0.397 0.603 2.000 1.919 0.672 0.479
23
OPA02-9 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.000 OPA02-10 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.000 OPN12-1 0.818 0.574 0.426 2.000 1.958 0.682 0.489 OPN12-2 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 OPN12-3 0.864 0.631 0.369 2.000 1.872 0.659 0.466 OPN12-4 0.591 0.360 0.640 2.000 1.855 0.654 0.461 OPN12-5 0.727 0.478 0.522 2.000 1.996 0.692 0.499 OPN12-6 0.955 0.787 0.213 2.000 1.505 0.518 0.335 OPB10-1 0.727 0.478 0.522 2.000 1.996 0.692 0.499 OPB10-2 0.818 0.574 0.426 2.000 1.958 0.682 0.489 OPB10-3 0.955 0.787 0.213 2.000 1.505 0.518 0.335 OPB10-4 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.000 OPB10-5 0.273 0.147 0.853 2.000 1.335 0.418 0.251 OPA01-1 0.136 0.071 0.929 2.000 1.151 0.255 0.131 OPA01-2 0.273 0.147 0.853 2.000 1.335 0.418 0.251 OPA01-3 0.545 0.326 0.674 2.000 1.784 0.631 0.439 OPA01-4 0.364 0.202 0.798 2.000 1.476 0.504 0.323 OPA01-5 0.636 0.397 0.603 2.000 1.919 0.672 0.479 OPA01-6 0.636 0.397 0.603 2.000 1.919 0.672 0.479 OPA01-7 0.364 0.202 0.798 2.000 1.476 0.504 0.323 OPA01-8 0.318 0.174 0.826 2.000 1.404 0.463 0.288 OPA01-9 0.045 0.023 0.977 2.000 1.047 0.109 0.045 OPA01-10 0.045 0.023 0.977 2.000 1.047 0.109 0.045 OPA01-11 0.045 0.023 0.977 2.000 1.047 0.109 0.045 OPB12-1 0.318 0.174 0.826 2.000 1.404 0.463 0.288 OPB12-2 0.273 0.147 0.853 2.000 1.335 0.418 0.251 OPB12-3 0.227 0.121 0.879 2.000 1.270 0.369 0.213 OPB12-4 0.636 0.397 0.603 2.000 1.919 0.672 0.479 OPB12-5 0.909 0.698 0.302 2.000 1.728 0.612 0.421 OPB12-6 0.864 0.631 0.369 2.000 1.872 0.659 0.466 OPB12-7 0.909 0.698 0.302 2.000 1.728 0.612 0.421 OPB12-8 0.091 0.047 0.953 2.000 1.097 0.188 0.089 OPB12-9 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 Çamlıkoy OPN06-1 0.182 0.095 0.905 2.000 1.209 0.315 0.173 OPN06-2 0.136 0.071 0.929 2.000 1.151 0.255 0.131 OPN06-3 0.227 0.121 0.879 2.000 1.270 0.369 0.213 OPN06-4 0.091 0.047 0.953 2.000 1.097 0.188 0.089 OPN06-5 0.136 0.071 0.929 2.000 1.151 0.255 0.131 OPN06-6 0.045 0.023 0.977 2.000 1.047 0.109 0.045 OPN06-7 0.045 0.023 0.977 2.000 1.047 0.109 0.045 OPN06-8 0.636 0.397 0.603 2.000 1.919 0.672 0.479 OPN06-9 0.682 0.436 0.564 2.000 1.968 0.685 0.492 OPN06-10 0.227 0.121 0.879 2.000 1.270 0.369 0.213 OPN06-11 0.864 0.631 0.369 2.000 1.872 0.659 0.466
