Hepatitis B Virus Genotype E Infection in Turkey:

İ

Türkiye’de İlk Kez Saptanan

Hepatit B Virus Genotip E Enfeksiyonu*

Hepatitis B Virus Genotype E Infection in Turkey:

The Detection of the First Case

Murat SAYAN

, Tamer ŞANLIDAĞ

, Sinem AKÇALI

, Ayşe ARIKAN

1

Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Merkez Laboratuvarı, Kocaeli.

1

Kocaeli University Medical School Hospital, Central Laboratory, Kocaeli, Turkey.

2

Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Manisa.

2

Celal Bayar University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Manisa, Turkey.

3

Yakın Doğu Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Merkez Laboratuvarı, Lefkoşa, KKTC.

3

Near East University Medical School Hospital, Central Laboratory, Nicosia, TRNC.

* XVI. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi (13-17 Mart 2013, Antalya)’nde sunulmuştur.

ÖZET

Hepatit B virusu (HBV) enfeksiyonları, tüm dünyada önemli bir halk sağlığı sorunudur. HBV, nükleik asit dizi heterojenitesine göre tanımlanan 10 genotip (A-J) içermekte ve bu genotiplerin dünya üzerindeki dağılımı coğrafi bölgelere göre farklılıklar göstermektedir. Ülkemizin değişik bölgelerinde yapılan çalışma- larda, genotip D’nin baskın olduğu gösterilmiş, ancak diğer HBV genotiplerinin de varlığı bildirilmiştir.

HBV genotip E hakkındaki epidemiyolojik ve klinik bilgiler sınırlı olsa da, Batı ve Ortadoğu Afrika’da yaygın olarak bulunduğu bilinmektedir. Bu raporda, ülkemizde ilk kez tanımlanan bir HBV genotip E enfeksiyonu olgusunun sunulması amaçlanmıştır. Beş yıldır Manisa’da ikamet eden ve iş hayatına sahip 22 yaşında Nijerya uyruklu bir erkek olgu, rutin sağlık tarama testleri için Celal Bayar Üniversitesi Hastanesine baş- vurmuştur. Yapılan tetkikler arasında HBsAg testinin pozitif olarak saptanması üzerine hastadan yeni kan örneği alınarak HBV belirteçleri ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Hastanın laboratuvar bulguları; HBsAg 21 IU/ml, anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc (+), anti-HCV (-), anti-HIV (-), ALT: 44 U/L, AST: 45 U/L olarak belirlenmiş; gerçek zamanlı PCR yöntemiyle (Artus HBV QS RGQ Qiagen, Almanya) HBV-DNA düzeyi 700 IU/ml olarak saptanmıştır. Hastanın serum örneğinden izole edilen HBV-DNA’sı PCR ile çoğal- tılmış ve HBV polimeraz gen bölgesi direkt dizileme yöntemiyle dizilenmiştir. Virusun genotipi, UPGMA yöntemi ile yapılan fi logenetik analiz ve hastada olası çoklu HBV genotip enfeksiyonunun belirlenmesi amacıyla uygulanan Inno-LiPA HBV genotiplendirme (Innogenetics, Belçika) yöntemi ile genotip E olarak belirlenmiştir. HBV izolatının polimeraz geni parsiyel dizileri, global sürveyansa katkı sağlaması amacıyla uluslararası DNA veri bankasına (Gen Bank) yüklenmiştir. Ülkemizde ilk kez bildirilen bu olgu, Türkiye’de

Geliş Tarihi (Received): 05.05.2014 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 14.07.2014

İletişim (Correspondence): Prof. Dr. Tamer Şanlıdağ, Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim :

yaygın olan HBV genotip D dışında diğer genotiplerin de olabileceğini vurgulamaktadır. Olgumuz, ülke- mize gelmeden önce de inaktif HBsAg taşıyıcısı olduğundan importe olgu özelliği taşımaktadır. Sonuç olarak, farklı HBV genotiplerinin tanımlanması ve epidemiyolojik ve moleküler özelliklerinin belirlenmesi, ulusal ve global HBV sürveyansı açısından önemli olabileceği gibi, genotip tayininin yapılması, klinik yaklaşımların da daha bilinçli olmasına olanak sağlayabilir.

Anahtar sözcükler: Hepatit B virusu; genotip E; Manisa. :

ABSTRACT

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global major health problem. Currently, 10 genotypes (A-J) of hepatitis B virus (HBV) are identifi ed based on the nucleic acid sequence heterogeneity, and these genotypes have been shown to have distinct geographic distribution. Reports of the previous studies indicated that the genotype D is the predominant type among hepatitis B patients in different regions of Turkey. However, recent studies indicated that other HBV genotypes are also seen with an increasing rate. Although epidemiological and clinical information on genotype E infection is currently limited, it is known that genotype E infection is common in West and Central Africa. In this report, the fi rst case of HBV genotype E infection in Turkey was presented. A 22-year-old Nigerian male employee who resided in Manisa for fi ve years was admitted to Celal Bayar University Hospital Manisa, Turkey, for his routine check-up. Since HBsAg was found positive, other HBV markers were tested with a repeated serum sam- ple. Laboratory fi ndings were as follows; HBsAg (+), anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc (+), anti-HCV (-), anti-HIV (-), ALT: 44 U/L and AST: 45 U/L. HBV-DNA level was detected as 700 IU/ml by real-time PCR (Artus HBV QS RGQ Qiagen, Germany). HBV-DNA isolated from the serum sample of the patient was amplifi ed by PCR and polymerase gene segment of HBV was directly sequenced. UPGMA method was used for phylogenetic analysis and Inno-LIPA HBV genotyping method (Innogenetics, Belgium) was performed to determine multiple HBV genotype infection. On the basis of those methods the genotype of the virus was identifi ed as genotype E. The partial sequences of the HBV polymerase gene were loaded to the international DNA data bank (GenBank) for contribution to the global HBV surveillance. This report emphasized that besides genotype D the other HBV genotypes could be found in Turkey. Since the patient was an inactive HBsAg carrier before his residence in Turkey, this case was regarded as an imported HBV genotype E case. In conclusion, detection of different HBV genotypes, their epidemiology and molecular characteristics are important for both national and global HBV surveil- lance and better clinical approach.

Key words: Hepatitis B virus; genotype E; Turkey. :

GİRİŞ

Hepatit B virusu (HBV), nükleik asit dizi heterojenitesine göre kesinleşmiş 8 farklı genotipte (A-H) sınıfl andırılmaktadır

. Farklı genotiplerin varlığında, hastalığın klinik seyrinde ve tedavi yanıtında farklılıklar izlenebilmektedir. Bu nedenle HBV enfeksiyonla- rında genotipin bilinmesi, hastalığın seyrinin öngörülmesi ve uygun tedavi seçeneğinin belirlenmesi açısından önemli olabilir

.

HBV genotiplerinin dağılımı coğrafi k farklılıklar göstermektedir. Kuzey Avrupa, ABD

ve Orta Afrika’da genotip A; Asya’da genotip B ve C; Güney Avrupa, Ortadoğu ve

Hindistan’da genotip D; Afrika’da genotip E; Orta ve Güney Amerika’da özellikle Pasifi k

okyanusundaki adalarda (Polinezya) genotip F ve ABD ve Fransa’da genotip G sık görül-

mektedir. Genotip H ise, ilk olarak ABD ve Nikaragua’da tanımlanmış daha sonra Orta Amerika, Meksika ve Japonya’dan bildirilmiştir

. HBV yüzey antijeni (HBsAg) preva- lansına göre orta düzeyde endemik (%2-7) bölge karakteri gösteren ülkemizde, genotip dağılımı incelendiğinde, HBV genotip D’nin predominant olduğu görülmektedir

. Öte yandan, Kocaeli’nde genotip A, Adana’da genotip G ve Konya’da genotip H ile enfek- te kronik hepatit B olguları bildirilmiştir

. Bu raporda, Türkiye’de tanımlanan ilk HBV genotip E enfeksiyonu olgusunun sunulması amaçlanmıştır.

OLGU SUNUMU

Ülkemizde ikamet eden ve çalışan Nijerya uyruklu 22 yaşındaki erkek hasta, rutin tarama testlerini (HBsAg, anti-HCV, anti-HIV) yaptırmak üzere Celal Bayar Üniversitesi Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarına başvurdu. Yaptırdığı tetkikler arasında HBsAg (19 IU/ml) pozitifl iğinin saptanması üzerine aynı kişiden yeni kan örneği istendi ve HBsAg testi tekrarlanarak diğer tüm hepatit belirteçleri kemilüminesans yöntemiyle araştırıldı.

Laboratuvar testlerinde; HBsAg 21 IU/ml, anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc (+), anti-HCV (-), anti-HIV (-) ve karaciğer enzimleri ALT/AST: 44/45 IU/ml olarak tespit edildi. Serum HBV-DNA düzeyi, gerçek zamanlı PCR yöntemiyle (Artus HBV QS RGQ Qiagen, Almanya) 700 IU/ml olarak saptandı.

HBV Dizi Analizi

HBV pol geninin (ters transkriptaz; rt bölgesi, 80-250. aminoasitler arası) dizi analizi l için serum örneğinden HBV-DNA izole edildi (Anatolia Geneworks, Bosphore

Viral DNA Extraction Spin Kit ve Magnesia

16 Magnetic Bead Extraction System, Istanbul, Türkiye). HBV pol geni amplifi kasyonu (742 bp) için ileri (F:5’-tcgtggtggacttctctcaatt-3’) l ve geri (R:5’-cgttgacagactttccaatcaat-3’) primerler kullanıldı. PCR koşulları; 95°C’de 10 dk ön denatürasyon, ardından 35 döngü 95°C’de 45 sn 60°C’de 45 sn ve 72°C’de 45 sn olarak uygulandı

. Tüm PCR ürünleri High Pure PCR Product Purifi cation Kit (Roche Diagnostics, Almanya) ile safl aştırıldı. Dizileme protokolünde Phire Hot Start DNA poli- meraz (Finnzymes Oy, Finlandiya) enzimi kullanıldı ve yöntem, The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc. NJ, ABD), 36 cm kapiller ve POP-7 TM polimer (Applied Biosystems Inc., CA, ABD) kullanılarak üretici fi rmanın önerileri doğrultusunda (http://www.appliedbiosystems.com) ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems Inc., CA, ABD) platformunda gerçekleştirildi.

Filogenetik Analiz

HBV genotipi, Neighbore-Joining metodu kullanılarak fi logenetik olarak analiz edildi.

Bu amaçla oluşturulan fi logenetik ağaç Şekil 1’de gösterildi. Hastadan izole edilen HBV suşu, genotip E olarak tanımlandı. Filogenetik ağaç yapımına pol geni dizisi kullanıldı ve l Bootstrap değeri 100 olarak alındı. Kullanılan referans diziler GenBank’tan (www.nvbi.

nih.gov) sağlandı. Hastadan izole edilen genotip E izolatının pol geni dizisi (parsiyel) l

GenBank’a yüklendi ve bir erişim numarası sağlandı (KC495968.1).

Şekil 1. HBV pol geni dizisinin fi logenetik analizi [Filogenetik ağaç, HBV ters transkriptaz kangalı (~490 bp alignment) dizilenerek ve Neighbor-Joining metodu kullanılarak oluşturulmuştur. Bootstrap değeri 100 olarak seçilmiştir. Filogenetik ağacın oluşturulmasında CLC Sequence Wiever 6.7.1 (CLC bio A/S, Danimarka) programı kullanılmıştır. HBV Genotip A: EU185788, B:AB602818, C: AY066028, D: AY796031, E:HM363609, F: DQ823094, G: GU563556, H: AB516395 referans dizileri GenBank’tan sağlanmıştır].

Şekil 2. Inno-Lipa yöntemiyle genotip E olarak belirlenen HBV Manisa suşu (Inno-Lipa HBV Genotyping Strip,

Innogenetics, Belçika).

LiPA (Line Probe Assay) Yöntemi

HBV-DNA, üretici fi rmanın önerileri doğrultusunda hasta örneğinden yeniden izole edildi ve Inno-LiPA HBV genotipleme kiti (Innogenetics, Belçika) kullanılarak HBV suşu (TS/2012/Manisa) genotip E olarak tanımlandı (Şekil 2).

TARTIŞMA

Bu çalışmada, Türkiye’de kronik hepatit B’li bir hastada ilk kez genotip E enfeksiyonu bildirilmektedir. HBV genotip E, sadece Batı Afrika’da endemik bir genotiptir. HBV’nin diğer genotiplerinin aksine alt genotipleri bulunmamaktadır

. Ülkemizde yapılan çalışmalara göre HBV genotip D predominant, genotip A, G ve H olgular şeklinde bil- dirilmiştir

. HBV genotiplerinin birbirlerinden farklı özelliklere sahip olmaları kliniği ve antiviral tedaviyi etkileyebilmektedir

. Bu açıdan HBV genotip tayinin in yapılması klinik açıdan önemli olabilir.

HBV genotiplendirmesinde altın standart yöntem, popülasyon temelli DNA dizileme tekniği ile elde edilen nükleotid dizilerinin fi logenetik analizidir. Ancak hem belirlenen genotipin farklı bir analiz tekniği ile doğrulanması hem de hastada çoklu HBV genotip enfeksiyonunun belirlenmesi amacıyla Inno-LiPA HBV genotiplendirme tekniği kullanıl- mıştır. Çalışmamızda, hastada çoklu HBV enfeksiyonu saptanmamış ve HBV suşu her iki yöntemle de genotip E olarak belirlenmiştir. Öte yandan DNA dizileme ile elde edilen nükleotid dizilerinin uluslararası dizi veri havuzu olan GenBank’a yüklenmesi ve böylece global sürveyansa katkı yapılması mümkün olabilmektedir

.

Olgumuz, ülkemizde 5 yıldan bu yana ikamet etmektedir. Olgu, ülkemize gelmeden önce de inaktif HBsAg taşıyıcısı olduğunu ifade ettiğinden, importe olgu özelliği taşı- maktadır. Olgunun ülkemizde ikamet ediyor ve çalışıyor olması genotip E’nin yayılması açısından önemli olabilir. Ülkemizde önümüzdeki dönemde yabancı uyruklu kişilerin ve/

veya mültecilerin sayılarının artmasına bağlı olarak farklı HBV genotip enfeksiyonlarını tanımlamak mümkün olacaktır. Bu nedenle fi logenetik analiz ile genotip D dışındaki HBV genotiplerinin tanımlanması, dolaşımları ve bulaşı hakkında sağlıklı bir epidemiyolojik veri sağlayacaktır.

KAYNAKLAR

1. Onganer PU, Oguzoglu N, Ozer A. Mutation and genotype analysis of hepatitis B virus on acute and chronic infected selected patients in Turkey. J Cell Mol Biol 2006; 5(1): 33-42.

2. Chihara N, Arase Y, Suzuki F, et al. Prolonged hepatitis after acute infection with genotype H hepatitis B virus. Intern Med 2007; 46(22): 1847-51.

3. Kramvis A, Kew MC. Relationship of genotypes of hepatitis B virus to mutations, disease progression and response to antiviral therapy. J Viral Hepat 2005; 12(5): 456-64.

4. Kumagai I, Abe K, Oikawa T, et al. A male patient with severe acute hepatitis who was domestically infected with a genotype H hepatitis B virus in Iwate, Japan. J Gastroenterol 2007; 42(2): 168-75.

5. Alvarado-Esquivel C, Sablon E, Conde-González CJ, Juárez-Figueroa L, Ruiz-Maya L, Aguilar-Benavides S.

Molecular analysis of hepatitis B virus isolates in Mexico: predominant circulation of hepatitis B virus genoty-

pe H. World J Gastroenterol 2006; 12(40): 6540-5.

6. Sánchez LV, Tanaka Y, Maldonado M, Mizokami M, Panduro A. Difference of hepatitis B virus genotype distribution in two groups of mexican patients with different risk factors. High prevalence of genotype H and G. Intervirology 2007; 50(1): 9-15.

7. Sayan M, Şentürk Ö, Akhan S, Hülagü S, Çekmen MB. Monitoring of hepatitis B virus surface antigen escape mutations and concomitantly nucleos(t)ide analogues resistance mutations in Turkish patients with chronic hepatitis B infection. Int J Infect Dis 2010; 14(Suppl 3): e136-41.

8. Ural O, Sayan M, Akhan S, Sümer Ş, Şimşek F. Türkiye’de ilk kez saptanan Hepatit B virus genotip H enfeksi- yonu olgusu. Mikrobiyol Bul 2013; 47(3): 550-5.

9. Sayan M, Dogan C. Hepatitis B virus genotype G infection in a Turkish patient undergoing hemodialysis therapy. Hepat Mon 2012; 12(2): 118-21.

10. Chen X, Lİ M, Zhang X. HBV genotype B/C and response to lamivudine therapy: a systematic review. Bio- med Res Int 2013; 2013: 672614.

11. Emekdaş G, Tezcan S, Aslan G ve ark. Mersin ilinde kronik hepatit B hastalarında hepatit B virusu genotiple- rinin belirlenmesi. Mikrobiyol Bul 2012; 46(3): 432-45.

12. Özdemir D, Balık İ. Ülkemizde hepatit B virusu (HBV) genotip dağılımı. Viral Hepatit Derg 2002; 8(1-2):

451-4.

13. Lin CL, Kao JH. The clinical implications of hepatitis B virus genotype: Recent advances. J Gastroenterol Hepatol 2011; 26(Suppl 1): 123-30.

14. Kurbanov F, Tanaka Y, Mizokami M. Geographical and genetic diversity of human hepatitis B virus. Hepatol Res 2010; 40(1): 14-30.

15. Sayan M. Molecular diagnosis of entecavir resistance. Hepat Mon 2010; 10(1): 42-7.