Hepatit B Virüsü (HBV) Genotip D ile Enfekte
Hasta Gruplarında HBV preS1, preS2 ve S Gen
Bölgelerinin Analizi*
Analysis of Hepatitis B Virus (HBV) preS1, preS2 and S Gene
Regions from Patient Groups Infected with HBV Genotype D
Eylem KARATAŞ1,2, Selda ERENSOY1, Ulus Salih AKARCA3, Rüçhan SERTÖZ11 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye. 1 Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey. 2 Manisa Merkezefendi Devlet Hastanesi, Manisa.
2 Manisa Merkezefendi State Hospital, Manisa, Turkey.
3 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Gastroenteroloji Bilim Dalı, İzmir. 3 Ege University Faculty of Medicine, Department of Physiology, Izmir, Turkey.
* Bu çalışma, Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından 2007TIP09 proje numarasıyla desteklenmiştir.
ÖZ
Hepatit B virüsü (HBV)’nün preS ve S gen bölgelerinde oluşan mutasyonlar; immün ve tanısal kaçak mutantlara neden olabilmektedir. Bu çalışmada, HBV ile enfekte olgu gruplarında preS1, preS2 ve S gen bölgelerinde dizi analizi ile varyant ve mutasyonların araştırılması ve bu konudaki literatüre katkıda bulunulması amaçlanmıştır. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Moleküler Viroloji laboratuvarına HBV testleri için gönderilmiş ve arşivlenmiş 56 plazma örneğinden elde edilen HBV DNA PCR ürünlerinin preS ve S nükleik asit dizi analizi; zincir sonlandırma reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. İncelenen plazma örnekleri: A- Alışılmış HBV serolojik profiline sahip (22 örnek), B- Alışılmış dışı HBV serolojik profile sahip kronik HBV enfeksiyonu (26 örnek), C- Karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon (5 örnek), D- Serokonversiyon dönemindeki akut HBV re-enfeksiyonu (3 örnek) olan dört hasta grubundan elde edilmiştir. Çalışma grubundaki iki aşı kaçak örneğin biri tanısal kaçak mutant; diğeri ise anti-HBc pozitif örnekten izole edilen tanısal kaçak mutant örneğinden oluşmuştur. Elde edilen amino asit (aa) dizileri GenBank’tan alınan referans dizilerle karşılaştırılmıştır. Hepsi genotip D olarak saptanan örneklerin ikisi ayw1, altısı ayw3, ikisi karışık, kalan 46 örnek ayw2 HBsAg alt tipleri olarak tanımlanmıştır.
Geliş Tarihi (Received): 15.08.2017 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 29.10.2017
İletişim (Correspondence): Prof. Dr. Selda Erensoy, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi
PreS1 33. ve S 162. aa arasında değerlendirmeye alınan 304 kodonun 105 (%34.5)’inde aa değişikliği saptanmıştır. Bu dizilere GenBank FJ001941-FJ001996 numaraları kullanılarak ulaşılabilmektedir. Elli altı örnekten 48 (%85.7)’inde en az bir aa değişikliği tespit edilmiştir. PreS1’de A33T, A39T, P41K, D44del, D50N, T51P, D54N, L65P/M, F67L, W77T, A81S, Q82E, I84T, L85I/M, Q86H/T, L88S, A90T/V, N91K/ del, A95P, S96A, T97I/A, N98K, Q100K, S101T, S109T, P110S, N114D/E, PreS2’de M1V, Q2R, S5H, F8S, H9Q, Q13L, D14N, R16K, R18K, G19S/D, F22L/S, S28T, G30E, N33T, V39A, P41H/L, I42T/L, I45T, F46Y, S47L, R48K, I49T, D51V/G, P52L, A53V, L54R/G, N55K; S gen bölgesinde E2D, I4F, F8L, G10A, V14A, F20S, L22del, R24K, P29L, Q30K, N40S, F41del, G44E, T45L, T46P, V47A, L49R, Q54R, P56L, S64F, P70A, M75I, C76Y, R79H, I81T, F83C, L88P, L94S, Y100F, Q101H/R, M103L, L104F, L109I/M, I110L, G112S/R, S113N/P, S114A/del, T115I, T116N, T118A/K, P120A/T, T123A, “a” determinantında T126I, Q129H/R, T131N, M133T, Y134N, S136Y, S143L/M/T, D144E, G145A/R aa varyantları saptanmıştır. Üç gen bölgesinde de delesyonlar tespit edilmiştir. En yüksek aa değişikliği izole anti-HBc pozitifliği olan (24 kodonda) örnekte, ardından karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon olan hasta grubunda (8-13 kodonda) saptanmıştır. PreS2/S promotor CCAAT kutusunda da nokta mutasyon tespit edilmiştir. Elli altı örneğin %41.1’inde majör hidrofilik bölgede (MHR), %23.2’sinde “a” determinantında aa değişikliği saptanmıştır. MHR’de en yüksek aa değişikliği olan örnekler alışılmış dışı HBV serolojik profili olan (B grubu; %61.5) ve karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon olan hasta grubunda (C grubunun hepsi) gözlenmiştir. Tanısal ve immün (anti-HBs pozitif) kaçak örneklerde MHR ve “a” determinantında bildirilmiş mutasyonlar saptanmıştır. Sonuç olarak, çalışılan popülasyonda preS/S mutasyonları bulunmakta ve tanısal veya immün kaçak olarak düşünülen örneklerde MHR ve “a” determinant bölgelerinde aa değişiklik oranı yüksek seviyede tespit edilmiştir. Bu çalışma, HBsAg testlerinin kullanımında mutant saptama özelliklerinin değerlendirilmesinin önemli olduğu göstermektedir.
Anahtar sözcükler: Hepatit B virüsü; HBV; mutasyon; varyant; PreS1; PreS2, S geni.
ABSTRACT
isolated anti-HBc positive sample (in 24 codons), followed by liver transplant group (8-13 codons). Point mutation was detected in the preS2/S promoter CCAAT box. Major hydrophilic region (MHR) variants were determined in 41.1% of 56 samples. The highest number of MHR variants belonged to atypical HBV serological profile group (group B; 61.5%) and liver transplantation group with HBV re-infection (all C group). Among the diagnostic escape and immune escape mutant (anti-HBs positive) samples, reported MHR and “a” determinant mutations were detected. In conclusion, the study population carries HBV preS/S variants; MHR and “a” determinant variant rates are high among diagnostic or immune escape mutants. It is important to evaluate the mutant detection performance of HBsAg tests.
Keywords: Hepatitis B virus; HBV; mutation; variant; PreS1; PreS2; S gene.
GİRİŞ
Dünyada hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinomun en önemli etkeni hepatit B virüsü (HBV) zarflı, kısmen çift sarmallı DNA’sı olan prototipik bir Hepadnaviridae üyesidir. Ge-notiplere göre değişmekle birlikte, ortalama 3200 baz uzunluğunda olan HBV DNA’sında birbirleriyle örtüşen açık okuma çerçeveleri sayesinde dört gen bölgesi bulunur: S geni (S), çekirdek (kor) geni (C), polimeraz geni (P) ve X geni (X). S geninden üç farklı başla-ma kodonundan okubaşla-ma başlatılarak üç protein kodlanır; bu gen bölgeleri sırasıyla preS1 + preS2 + S, preS2 + S ve S’dir. Bu gen bölgelerinden sırasıyla büyük (L), orta (M) ve küçük S proteinleri sentezlenir1. HBV replikasyonu sırasında diğer DNA virüslerinden farklı olarak nükleus içerisinde ara bir RNA transkripti (pre-genomik RNA) sentezlenir. Viral reverstranskriptaz (RT) aktivitesi ile bu RNA’dan negatif DNA sarmalı sentezlenir. Reverstranskriptaz enziminin düzeltici aktivite gösteren 5’ ekzonükleazı (proofreading) olmadığından, replikasyon sırasında varyant ve türümsü (quasispecies) oluşumuna sebep olan hatalı baz eşleşmeleri meydana gelmektedir. İmmün yanıt, aşılama, HBIG kullanımı ve antiviral tedavi gibi seçici baskı durumlarında türümsü havuzundaki mutantlar baskın hale gelebilir1,2.
HBsAg seroprevalansı açısından orta endemik olan toplumumuzda 1998 yılından iti-baren HBV aşısı kitlesel aşı programına alınmıştır. Yenidoğanda aşılama ve gerektiğinde HBIG uygulanmaktadır. İmmün modülatör tedaviler, karaciğer transplantasyonunun yay-gınlaşması ve antiviral tedaviler virüs popülasyonunda değişikliklere neden olabilir. HBV enfeksiyonunun yönetiminde; laboratuvar tanı ve immünoprofilaksi stratejileri açısından toplumdaki HBV mutasyonlarına ait veri oluşturulması önemlidir.
PreS ve S gen bölgesinde oluşan mutasyonlar; aşı ve HBIG kaçak mutantlarına (im-mün kaçak) ve ticari HBsAg kitleri ile yalancı negatif sonuçlara (tanısal kaçak mutantlar) neden olabilmektedir. Kaçak mutantlar aşılanmış bireylerde de enfeksiyonlara yol açabilir ve duyarlı bireyleri horizontal olarak enfekte edebilir4. Bu mutasyonların popülasyondaki durumunun ve etkilerinin gösterilebilmesi için farklı bölgelerden ve olgu gruplarından HBV-DNA izolatlarında varyant ve mutantların tanımlanmasına yönelik veri tabanının ge-nişletilmesi önem arz etmektedir. Bu çalışmada, HBV ile enfekte olgu gruplarında preS1, preS2 ve S gen bölgelerinin dizi analizi ile varyant ve mutasyonların araştırılması ve lite-ratüre katkıda bulunulması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Bu çalışma için Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurul Başkanlığı tarafından onay alındı (02.05.2006-06-4.1/1). Plazma örnekleri çalışmaya seçilen hastalardan bilgi-lendirilmiş gönüllü onam alındı ve aşılanma durumları soruldu.
Hasta Örnekleri
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi (EÜTF) Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Labo-ratuvarına HBV serolojik testleri ve viral yük için gönderilmiş ve stoklanmış örneklerden nükleik asit dizi analizi için yeterli HBV DNA düzeyi bulunan plazma örnekleri çalışmaya alındı. Seçilen örneklerin ait olduğu 56 hastanın 25 (%44.6)’inin kadın, 31 (%55.4)’inin erkek olduğu saptandı. Hasta grubunun yaş ortalaması 40.4 (7-77) olarak tespit edildi. Hemodiyaliz hastası olan iki olgunun aşılı olduğu belirlendi. Olgular serolojik ve klinik bulgularına göre (biyokimyasal ve histoloji sonuçlarıyla) dört grupta incelendi: A- Alışıl-mış HBV serolojik profiline sahip kronik HBV enfeksiyonu, B-AlışılAlışıl-mış dışı HBV serolojik profiline sahip kronik HBV enfeksiyonu, C- Karaciğer transplantasyonu (Kc Tx) sonrası re-enfeksiyon, D- Serokonversiyon dönemindeki akut HBV enfeksiyonu. Plazma örnekleri, DNaz ve RNaz içermeyen koşullarda -80°C’de saklandı.
Çalışma Kapsamında Kullanılan Testler
Çalışmaya alınan örneklerin HBsAg düzeyleri ARCHITECT (Abbott Diagnostics, Alman-ya) ile, HBeAg, anti-HBe, anti-HBcIgM, anti-HBc total ve anti-HBs düzeyleri Murex (Ab-bott Diagnostics, Almanya) ile çalışıldı. Nükleik asit dizi analizi için nükleik asit izolasyonu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Applied Science, Almanya) kullanılarak yapıldı. Toplam 56 hastanın plazma örneğinden izole edilen HBV DNA örneklerinin preS ve S gen bölgeleri HBPr1, HBPr135, HBPr2, HBPr94 primerleri kullanılarak iki türlü (nested) PCR ile çoğaltıldı5. Dizi analizi, HBPr2, HBPr94, P7 S, P7 AS, CHBV-3 S, CHBV-3 AS5-7 pri-merleri ve ABI PRISM BigDye Terminator Kit v3.1 (Applied Biosystems, ABD) kullanılarak ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABD) cihazında çift yönlü analiz şeklinde gerçekleştirildi.
diziler DNAStar (DNAStar INC, ABD) programında MegAlign modülünde Clustal W yönte-miyle hizalandı ve ortak bir referans dizi oluşturuldu. Elde edilen diziler DNAStar (DNAStar INC, ABD) programında SeqMan modülünde referans dizi ile karşılaştırılarak temizlendi. Temizlenen diziler referanslar ile birlikte MegAlign modülünde Clustal W yöntemiyle hiza-landı ve amino asit (aa) dizilerine çevrildi.
PreS ve S gen bölgesine ait 848 baz uzunluğundaki nükleotid dizisi, GenBank’tan alınan 13 dizi (HBV genotip A-H) ve ortak referans diziyle ile beraber Clustal W yöntemiyle hiza-landı, Neighbourjoining (NJ) ve JukesCantor metodu kullanılarak filogenetik ağaç oluştu-ruldu. 122, 127, 134, 159 ve 160. pozisyonlardaki amino asitler değerlendirilerek HBsAg alt tip tayini yapıldı4.
BULGULAR
Bu çalışmada yer alan örneklerin hepsi genotip D olarak bulunmuştur. Elli altı örneğin ikisi ayw1, altısı ayw3, ikisi karışık, kalan 46 örnek ise ayw2 HBsAg alt tipleri olarak saptanmıştır. PreS ve S gen bölgelerinin aa dizisine çevrilip hizalanması sonucunda, preS1 33. ve S 162. aa arası (304 kodon) değerlendirmeye alındığında; 105 (%34.5)’inde değişiklik olduğu tespit edilmiştir. Bu dizilere GenBank FJ001941-FJ001996 numaralarından ulaşılabilmektedir. Elli altı örneğin 48 (%85.7)’inde referans diziye göre en az bir aa değişikliği bulunmuştur. Grup-lardaki örnek sayıları uygun dağılmadığı için mutasyon oranları karşılaştırılmamıştır.
Amino asit değişikliği olan örnek sayıları ve gruplarda örnek başına düşen aa değişiklik sayıları Tablo I’de gösterilmiştir. En yüksek amino asit değişikliğine saptanan izole anti-HBc örneğinin dizi analizinde preS1 gen bölgesinde dört (I84T, L85I, A95P, T97I), preS2 gen bölgesinde beş (Q2R, S5H, H9Q, R16K, V39A) ve S gen bölgesinde 15 (G10A, R24K, T46P, V47A, L94S, Q101H, L104F, L109I, T115I, T116N, P120A,T123A, S136Y, S143M, G145A) olmak üzere toplam 24 bölgede değişiklik saptanmıştır.
C76Y, R79H, I81T, F83C, L88P, L94S, Y100F, Q101H/R, M103L, L104F, L109I/M, I110L, G112S/R, S113N/P, S114A/del, T115I, T116N, T118A/K, P120A/T, T123A, “a” determi-nantında T126I, Q129H/R, T131N, M133T, Y134N, S136Y, S143L/M/T, D144E, G145A/R aa değişiklikleri saptanmıştır. T hücre epitopunda N40S, V47A ve L49R mutasyonları göz-lenmiştir. Bunların dışında HBsAg pozitif, anti-HBc negatif (B.4) bir örnekte 106-111. ve 116-117. amino asitleri arasında delesyon saptanmıştır.
Major hidrofilik bölge (MHR) ve “a” determinantında aa değişikliği bulunan olgu sayıları ve oranları Tablo II’de gösterilmiştir.
Çalışma grubundaki örneklerde S geni MHR bölgesi aa değişikliklerinin gruplardaki da-ğılımı Tablo III’te gösterilmiştir.
Tablo I. Pres ve S Gen Bölgelerinde Örnek Başına Düşen Amino Asit (aa) Değişiklik Sayılarının Alt Çalışma
Gruplarına Göre İncelenmesi
Hasta grubu (aa değişikliği olan
örnek/toplam sayı) Açıklama
Amino asit değişikliği olanlarda örnek başına aa değişikliği sayısı
PreS1 PreS2 S
PreS/S Toplam
A (17/22) (alışılmış serolojik profile sahip)Kronik HBV enfeksiyonu 1-5 1-5 1-4 1-10 A.1 (1/3) İmmün tolerans 2 3 1 6 A.2 (5/5) Kronik aktif hepatit (HBeAg pozitif) 1-5 1-3 1-4 1-10 A.3 (6/8) İnaktif 2 1-5 3-4 1-9 A.4 (5/6) Kronik aktif hepatit (HBeAg negatif) 1 1-3 1 2-5 B (24/26) Alışılmış dışı serolojik profil 1-4 1-5 1-15 1-24 B.1 (1) Salt anti-HBc pozitif 4 5 15 24 B.2 (8/8) HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif 1-2 1-4 1-5 1-9
B.3 (4/4)
HBsAg sonuçları farklı (negatif-pozitif) veya düşük pozitif
TARTIŞMA
HBV preS1, preS2 ve S gen bölgelerindeki aa değişikliklerinin araştırılması amaçlanan bu çalışmada incelenen örneklerin hepsi Türkiye’de yapılan diğer çalışmalarda olduğu gibi genotip D olarak saptanmış ve benzer şekilde baskın olarak HBsAg alt tipi ayw2 tespit edilmiş ve diğer alt tiplerin de Türkiye’de gözlenen alt tiplerle uyumlu olduğu belirlenmiştir8-10.
Çalışma popülasyonunda örneklerin %85.7’sinde en az bir aa değişikliği bulunmuştur. En fazla amino asit değişikliği (24 kodonda) izole anti-HBc pozitifliği (tanısal kaçak mu-tant) olan örnekte görülmüştür. Çalışmamızda B.1 (salt anti-HBc olumlu) ve B.5 no’lu (HBsAg negatif, anti-HBc ve anti-HBs pozitif) örneklerde HBV DNA varlığı bulunmasına karşın, HBsAg testleri sürekli olarak negatif olarak saptandığı için bu örnekler tanısal kaçak mutant olarak değerlendirilmiştir. En yüksek mutasyon yüküne sahip izole anti-HBc olan örnekte saptanan aa değişiklikleri, önceki çalışmalarda gizli ve kronik B hepatitli hastalar ile kaçak mutantlar dahil olmak üzere farklı hasta gruplarından izole edilmiştir1,11-18. S gen bölgesinde 10’u MHR içinde bulunan aa değişikliklerinin üçü “a” determinantında yer almaktadır. Bu örnekte preS2/S promotor ekspresyonunu artıran CCAAT kutusunda da nokta mutasyon tespit edilmiştir19.
Sistemlerin mutant yakalama düzeylerini değerlendiren çalışmalarda birçok testin farklı sonuç verdiği bildirilmiştir3,11,20. Çalışmamızda rutin değerlendirmede önce HBsAg negatif, farklı test ile tekrar edildiğinde ise pozitif bulunan ya da zayıf pozitif bulunan örnekleri içeren B3 grubundaki dört örnekte S gen bölgesinde üçü MHR’de olmak üzere beş aa değişikliğine rastlanmıştır. I110L değişikliğine gizli ve HBsAg ve anti-HBs beraber pozitifliği olan hastalarda rastlanmıştır13,14. Sayıner ve arkadaşları10 tarafından yapılan çalışmada T118A, kronik HBV hastalarında MHR’de en sık rastlanan değişiklik olarak bu-lunmuş ve Hint ve İspanyol toplumunda da sık görülmesinden dolayı bu sonuç mutas-yondan daha çok varyant olarak değerlendirilmiştir. 120. kodondaki mutasyonların tanı-da probleme yol açtıkları bilinmektedir. P120T mutasyonuna aşı ve HBIG kaçak mutant olarak ve gizli ve kronik HBV enfeksiyonlu hastalarda rastlanmıştır13,14,21.
Tablo II. MHR Bölgesinde ve “a” Determinantında aa Değişikliği Bulunan Olgu Sayıları ve Oranları
Olgu grubu (sayı)
MHR’de değişiklik olan olgu sayısı ve oranı (%)
“a” determinantında değişiklik olan olgu sayısı ve oranı (%)
A (22) 2 (9.1) 0
B (26) 16 (61.5) 11 (42.3)
C (5) 5 (100) 2 (40)
D (3) 0 0
Toplam (56) 23 (41.1) 13 (23.2)
İmmün kaçak olarak en sık bildirilen mutasyonlar I/T126A, Q129H, M133L, T143M ve G145R’dir1,16,22. Bu çalışmada bir B2 grubundan (HBsAg ve anti-HBs pozitif), bir de B5 (HBsAg negatif) olan aşılanmış iki hemodiyaliz hastasında aşı kaçak mutantı olma olasılığı saptanmıştır. Aynı zamanda, tanısal kaçak olan B5 örneğinde (HBsAg negatif, anti-HBc ve anti-HBs pozitif) preS2 gen bölgesinde iki ve S gen bölgesinde altı olmak üzere top-lam sekiz aa değişikliği saptanmıştır. MHR içinde yer alan dört değişikliğin birinin “a” determinantında olduğu tespit edilmiştir. Q101R, M103L, G112R gizli ve kronik HBV enfeksiyonlu hastalardan bildirilmiştir13,16,20. D144E’nin immün kaçak mutantı olduğu ve tanıda problemlere neden olduğu bildirilmiştir14,16. B2 grubundan aşılı hemodiyaliz hastasının örneğinde preS1 ve preS2 bölgelerinde değişikliğe rastlanmazken, aşı kaçak mutantı olarak bildirilmiş olan Q129R mutasyonu saptanmıştır14.
Çalışma grubumuzda HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif bulunan örneklerin (B.2 gru-bu) elde edildiği hastalardan sadece birinin (hemodiyaliz hastası) HBV aşısı ve hepsinin anti-HBc pozitif olduğu gözlenmiştir. Bu gruptaki örneklerde yapılan dizi analizlerinde preS1 bölgesinde altı, preS2 bölgesinde on, S bölgesinde 13 olmak üzere toplam 29 aa değişikliğine rastlanmıştır. Sekizi MHR’de olan değişikliklerin beşi “a” determinantında gözlenmiştir. Q54R HBsAg ve anti-HBs birlikte pozitif olan örneklerden23, L109M HIV ile enfekte gizli HBV enfeksiyonlu kan donöründe24, S114A immünoprofilaksiye rağmen perinatal enfeksiyonlu bir çocukta25, T131N ve M133T anti-HBs pozitif (aşılı veya doğal yolla) hastalarda23, Y134N ise gizli HBV enfeksiyonlu hastalarda bildirilmiştir1. Q129H ve Q129R aşı kaçak mutantı olarak bilinmektedir14,15,22. PreS1 ve preS2 gen bölgeleri, viral genomun en fazla değişkenlik görülen bölgelerindendir ve bu nedenle nokta mutasyon-ları, delesyonlar ve insersiyonlar kronik hepatit B’li hastalarda sık olarak görülmektedir1. Bu varyantlar içinde M proteini defektif olanlar en sık görülen gruptur1. PreS1’in 3’ ve preS2’in 5’ ucuna kümelenmiş olarak bulunan büyük çerçeve delesyonları özellikle hepa-topatogenez ile ilişkilendirilmiştir. Çalışmamızda üç örnekte preS2/S promotor bölgesine denk gelen delesyon saptanmış; ve örneklerde HBsAg saptamada herhangi bir sorun yaşanmamıştır. C grubundaki (karaciğer transplantasyonu sonrası reenfeksiyon gösteren) örneklerin tümünde preS2/S promoter bölgesinde, bir örnekte CCAAT kutusunda mu-tasyon saptanmıştır. PreS2/S promotor bölgesindeki CCAAT kutusu SHBs/LHBs oranının yüksek düzeyde korunmasını sağlamaktadır. Özellikle CCAAT kutusundaki mutasyonların LHBs’in endoplazmik retikulum içinde birikmesine ve ilerleyici kronik karaciğer hastalığı-na neden olduğu düşünülmektedir1,19. Üç örnekte ikisi preS2 başlama kodonuna denk gelen preS2 bölgesinde delesyon saptanmıştır. Çalışmamızda preS2 gen bölgesinde en sık olarak saptadığımızP41H ülkemizde ve yurtdışı çalışmalarda da tespit edilmişve bu sonuç varyant olarak değerlendirilmiştir9,26.
HBV taşıyıcısına ait örnekte, L49R A, B ve C grubundan birer olguda görülmüştür. İzole anti-HBc pozitifhastanın örneğinde V47A mutasyonu saptanmıştır. Akut hepatitte “a” determinantında mutasyon nadir olarak görülmektedir27. Çalışmamızda da serokonver-siyon dönemindeki HBV DNA pozitif üç hastanın olduğu D grubunda S gen bölgesinde bir örnekte sadece Q30K mutasyonu tespit edilmiştir.
MHR ve “a” determinantındaki değişiklikler daha çok aşı veya tanısal kaçak mutantla-rıyla ilişkilidir. Çalışmamızda da MHR bölgesinde aa değişikliği saptanan örnek sıklığı en yüksek olarak; alışılmış dışı HBV serolojik profili olanlar (B grubu) ve karaciğer transplan-tasyonu sonrası re-enfeksiyon olan hastaların örneklerinde (C grubu) tespit edilmiştir (Tablo II). Yirmi farklı ülkeden elde edilen çok geniş örnek grubunun HBsAg MHR bölgesi-nin yüksek duyarlılığa sahip ultradeep dizileme mutasyon analizi kullanılarak incelendiği çalışmada örneklerin %72.8’inde 345 farklı aa mutasyonu gösterilmiş ve 62 yeni mutas-yon bildirilmiştir. Geniş bir literatür taramasının da yapıldığı çalışmada, MHR mutasmutas-yonu taşıyan HBV enfeksiyonlu hasta sayısınınortalama %26.4 olduğu, belirlenmiş ve ayrıca bu çalışmada Türkiye’de yapılan çalışmalardan elde edilenüç farklı sıklık (%46.0, %27.2 ve %8.3) da belirtilmiştir16. Bizim çalışmamızda tüm hastalarda saptanan %41.1 MHR görülme sıklığı ortalamadan yüksek (Tablo II) olarak gözlenmiştir. MHR görülme sıklığı özellikle atipik serolojik profilin gözlendiği grupta daha da yüksek (%61.5) olarak saptan-mıştır. Bu durum çalışma grubumuzda immün ve tanısal kaçak mutantların bulunması ile açıklanabilir.
HBV re-enfeksiyonunu önlemek için KC transplantasyonu sonrasında alıcı hastalara yaygın olarak HBIG tedavisi verilmektedir. Uzun ve tekrarlanan HBIG tedavisi sonrasında S gen mutasyonlarının ortaya çıkması beklenmektedir. Protzer-Knolle ve arkadaşları28 144 ve 145. kodondaki mutasyonların; baskın olduğunu, kronik enfeksiyonlar yaptığını ve kötü klinik tablolar ve re-enfeksiyonla ilişkili olduğunu bildirmiştir. Çalışmamızda C grubundaki (karaciğer transplantasyonu sonrası re-enfeksiyon görülen hastalar) örnek-lerden yapılan dizi analizlerinde S gen bölgesinde çoğu önceden gözlenmiş 17 (I4F, F8L, F20S, L49R, Q54R, C76Y, Y100F, Q101R, I110L, S113N, T118K, T118A, P120T, T126I, Q129H, S143T, G145R) amino asit değişiklikleri saptanmıştır.
KAYNAKLAR
1. Pollicino T, Cacciola I, Saffioti F, Raimondo G. Hepatitis B virus preS/S gene variants: Pathobiology and clinical implications. J Hepatol 2014; 61(2): 408-17.
2. Coleman PF. Detecting hepatitis B surface antigen mutants. Emerg Infect Dis 2006; 12(2): 198-203. 3. Gerlich WH. Diagnostic problems caused by HBsAg mutants - A consensus report of an expert meeting.
Intervirology 2004; 47(6): 310-3.
4. Echevarría JM, Avellón A. Hepatitis B virus genetic diversity. J Med Virol 2006; 78 (Suppl 1): S36-42. 5. Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, et al. A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and
phylogenetic relatedness. J Gen Virol 2000; 81(Pt 1): 67-74.
6. Lindh M, Andersson AS, Gusdal A. Genotypes, nt 1858 variants, and geographic origin of hepatitis B virus-large-scale analysis using a new genotyping method. J Infect Dis 1997; 175(6): 1285-93.
7. Yang H, Westland CE, Delaney WE, et al. Resistance surveillance in chronic hepatitis B patients treated with adefovir dipivoxil for up to 60 weeks. Hepatology 2002; 36(2): 464-73.
8. Sertöz RY, Erensoy S, Pas S, Özacar T, Niesters HGM. Restriction fragment length polymorphism analysis and direct sequencing for determination of HBV genotypes in a Turkish population. New Microbiol 2008; 31(2): 189-94.
9. Bozdayı G, Türkyılmaz AR, İdilman R, et al. Complete genome sequence and phylogenetic analysis of hepatitis B virus isolated from Turkish patients with chronic HBV infection. J Med Virol 2005; 76(4): 476-81.
10. Sayıner AA, Özcan A, Şengönül A. Naturally occurring MHR variants in Turkish patients infected with hepatitis B virus. J Med Virol 2008; 80(3): 405-10.
11. Scheiblauer H, Soboll H, Nick S. Evaluation of 17 CE-marked HBsAg assays with respect to clinical sensitivity, analytical sensitivity, and hepatitis B virus mutant detection. J Med Virol 2006; 78(Suppl 1): S66-70. 12. Raza A, Mehmood K, Begum F, et al. Immunological profiling of hepatitis B virus surface gene in Pakistan.
Novus International J Biotechnology Bioscience 2012; 1(2): 1-10.
13. Zaaijer HL, Torres P,OntañónA, et al. Multiple surface antigen mutations in five blood donors with occult hepatitis B virus infection. J Med Virol 2008; 80(8): 1344-9.
14. Coppola N, Onorato L, Minichini C, et al. Clinical significance of hepatitis B surface antigen mutants. World J Hepatol 2015;7(27): 2729-39.
15. de Almeida RW, do Amaral Mello FC, Vasconcelos Menegoy I, et al. Detection and molecular characterisation of a diagnosis escape variant associated with occult hepatitis B virus in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2017; 112(7): 485-91.
16. Gencay M, HuÈbner K, Gohl P, et al. Ultra-deep sequencing reveals high prevalence and broad structural diversity of hepatitis B surface antigen mutations in a global population. PLoS One 2017; 12(5): e0172101. 17. Sayan M, Şentürk Ö, Akhan S, Hülagü S, Çekmen MB. Monitoring of hepatitis B virus surface antigen escape
mutations and concomitantly nucleos(t)ide analogues resistance mutations in Turkish patients with chronic hepatitis B infection. Int J Infect Dis 2010; 14(Suppl 3): e136-41.
18. Sayan M, Çavdar C, Doğan C. Naturally occurring polymerase and surface genes variants of hepatitis B virus in Turkish hemodialysis patients with chronic hepatitis B. Jpn J Infect Dis 2012; 65(6): 495-501.
19. Bock CT, Kubicka S, Manns MP, Trautwein C. Two control elements in the hepatitis B virus S-promoter are important for full promoter activity mediated by CCAAT-binding factor. Hepatology 1999; 29(4): 1236-47. 20. Gerlich WH, Glebe D, Schüttler CG. Deficiencies in the standardization and sensitivity of diagnostic tests for
hepatitis B virus. J Viral Hepat 2007; 14 (Suppl 1): 16-21.
21. Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. J Viral Hepat 1997; 4(Suppl 1): 11-20.
22. Cooreman MP, Leroux-Roels G, Paulij WP. Vaccine and hepatitis B immune globulin-induced escape mutations of hepatitis B virus surface antigen. J Biomed Sci 2001; 8(3): 237-47.
24. Liu Y, Zeng P, Wang J, et al. Hepatitis B virus infection in a cohort of HIV infected blood donors and AIDS patients in Sichuan, China. J Transl Med 2014; 12(1): 164.
25. Kitab B, El Feydi A E, Afifi R, et al. Hepatitis B genotypes/subgenotypes and MHR variants among Moroccan chronic carriers. J Infect 2011; 63(1): 66-75.
26. Pollicino T, Raffa G, Costantino L, et al. Molecular and functional analysis of occult hepatitis B virus isolates from patients with hepatocellular carcinoma. Hepatology 2007; 45(2): 277-85.
27. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J Clin Virol 2005; 32(2): 102-12.
