Arabidopsis thaliana'da bir post-translayonel modifikasyon olan poly(Adp- Riboz)ilasyon'un endoplazmik retikulum stresine toleranstaki rolünün araştırılması
Program Kodu: 3001
Proje No: 117Z539
Proje Yürütücüsü: Araş. Gör. Dr. Rengin ÖZGÜR UZİLDAY
Araştırmacı:
Dr. Öğr. Üyesi Barış UZİLDAY Danışman:
Prof. Dr. İsmail TÜRKAN
Bursiyer:
Oğuzhan YILMAZ
KASIM 2018 İZMİR
i ÖNSÖZ
Final raporu sunulmakta olan bu çalışmada, model bitki Arabidopsis thaliana’ da bir post translasyonel modifikasyon olan poly(ADP-riboz)ilasyon mekanizmasının endoplazmik retikulum stresi ve katlanmamış protein yanıtı üzerindeki etkileri araştırılmıştır.
Bu çalışma 117Z539 no’lu TÜBİTAK 3001 Projesi ile desteklenmiştir. Çalışma, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü’nde Araş. Gör. Dr. Rengin ÖZGÜR UZİLDAY yürütücülüğünde 12 ayda tamamlanmıştır. Proje verileri, Temmuz, 2018’ de düzenlenen Society of Experimental Biology 2018, Floransa- İtalya kongresinde “The role of Poly (ADP-ribosyl)ation in induction of unfolded protein response in Arabidopsis thaliana”
başlıklı bir poster sunumla ve Eylül, 2018’ de Çanakkale’ de düzenlenen 3. Uluslararası Katılımlı Bitki Fizyolojisi kongresinde “The Interaction Between Endoplasmic Reticulum Stress and Poly (ADP-ribosyl)ation in wild type and mutants of Arabidopsis thaliana differing in PARylation capacity” başlıklı bir sözlü sunum ile bilim dünyası ile paylaşılmıştır.
Bu proje kapsamında özgün içerikli bir makale hazırlığı devam etmektedir.
Bu projeyi, TÜBİTAK 3001 Başlangıç AR-GE Projeleri Destek Programı çerçevesinde desteklediği için Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu’ na teşekkür ederiz.
Dr. Rengin ÖZGÜR UZİLDAY
TÜBİTAK 3001 Başlangıç AR-GE Projeleri Destek Programı Proje Yürütücüsü
ii
İÇİNDEKİLER DİZİNİ
1. GİRİŞ ... 1
2. LİTERATÜR ÖZETİ ... 5
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 11
3.1 Bitkilerin büyütülmesi ve uygulamalar ... 11
3.2 Bitki yaş ağırlığı ve kuru ağırlığı ölçümleri ... 14
3.3 Klorofil miktarının ölçümü ... 14
3.4 Western Blot analizleri ... 14
3.5 Gen ifadelerinin ölçümü: ... 15
3.6 bZIP60 splays miktarının ölçülmesi ... 16
3.7 İstatistiksel analizler ... 16
4. BULGULAR ... 16
4.1 Bitki büyüme parametreleri ... 16
4.2 Klorofil içerikleri ... 19
4.3 ER stresi altında anti-PAR antikoru ile belirlenen PARilasyon seviyesi ... 25
4.4 ER stresi altında PARP ve PARG genlerinin ifadesi ... 26
4.5 ER stresi altında 3 AB uygulaması ile UPR genlerinin ifadeleri ... 29
4.5.1 ER stresi algılayan ve ileten genlerin ifadeleri ... 29
4.5.2 ER stresi ilişkili protein katlanması genlerinin ifadeleri ... 31
4.5.3 ER ilişkili protein parçalanması (ERAD) genlerinin ifadeleri ... 33
4.5.4 ER ilişkili programlanmış hücre ölümü gen ifadeleri ... 35
4.5.5 bZIP60 splaylanması ... 37
4.6 parg1-2 ve parg2-1 mutantlarında ER stresi altında ve iyileşme (recovery) safhasında UPR gen ifadeleri ... 38
4.6.1 ER stresi algılayan ve ileten genlerin ifadeleri ... 38
4.6.2 ER stresi ilişkili protein katlanması genlerinin ifadeleri ... 41
4.6.3 ER İlişkili protein parçalanması (ERAD) genlerinin ifadeleri ... 46
4.6.4 BZIP60 splayslanması ... 51
5. TARTIŞMA ... 53
6. SONUÇ ... 56
7. KAYNAKLAR ... 57
iii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1. Poly(ADP-riboz)ilasyon (PARilasyon) mekanizması, bu mekanizmadaki görevli genleri ve projede kullanılması planlanan PARP ve PARG inhibisyon mekanizmalarını
gösteren şekil (Briggs vd. 2011’den değiştirilerek). ... 8
Şekil 2. 12’lik plakalarda sıvı MS ortamında yetiştirilen 5 günlük A. thaliana bitkileri ... 12
Şekil 3. Amaç 1,2,3 için kullanılan deneme deseni ... 13
Şekil 4. Amaç 4 için kullanılan deneme deseni ... 13
Şekil 5. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3-aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde yaş ağırlık (mg) ... 17
Şekil 6. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde kuru ağırlık ... 17
Şekil 7. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde yaş ağırlık (mg) (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 18
Şekil 8. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde kuru ağırlık (mg) (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 18
Şekil 9. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde yaş ağırlık (mg) (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm) ... 19
Şekil 10. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde kuru ağırlık (mg) (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 19
Şekil 11. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde klorofil a (mg-1 YA) içeriği ... 20
Şekil 12. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde klorofil b (mg-1 YA) içeriği ... 20
Şekil 13. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde klorofil a+b (mg-1 YA) içeriği ... 21
Şekil 14. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde klorofil a (mg-1 YA) miktarı (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 22
Şekil 15. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde klorofil b (mg-1 YA) miktarı (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 22
Şekil 16. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde klorofil a+b (mg-1 YA) miktarı (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 23
Şekil 17. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde klorofil a (mg-1 YA) miktarı (R: iyileşme- recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 23
iv
Şekil 18. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde klorofil b (mg-1 YA) miktarı (R: iyileşme- recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 24 Şekil 19. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde klorofil a+b (mg-1 YA) miktarı (R: iyileşme- recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 25 Şekil 20. 0.15 µg/ml Tm (0.15T) ve 0.3 µg/ml Tm (0.3T) uygulanan Col.(yaban tip) bitkilerinde anti-PAR antikoru ile PARilasyon ile değişime uğramış proteinlerin miktarı ... 25 Şekil 21. 3-aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15 µg/ml Tm (3AB+0.15T) ve 3AB+ 0.3 µg/ml Tm (3AB+0.3T) uygulanan Col.(yaban tip) bitkilerinde anti-PAR antikoru ile PARilasyon ile değişime uğramış proteinlerin miktarı ... 26 Şekil 22. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde PARG1 gen ifadesi... 27 Şekil 23. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde PARG2 gen ifadesi... 27 Şekil 24. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde PARP1 gen ifadesi ... 28 Şekil 25. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde PARP2 gen ifadesi ... 28 Şekil 26. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde PARP3 gen ifadesi ... 29 Şekil 27. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde bZIP17 gen ifadesi ... 29 Şekil 28. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde bZIP28 gen ifadesi ... 30 Şekil 29. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde IRE1A gen ifadesi ... 30 Şekil 30. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde IRE1B gen ifadesi ... 31 Şekil 31. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde BiP1 gen ifadesi ... 31 Şekil 32. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde BiP3 gen ifadesi ... 32 Şekil 33. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde CNX gen ifadesi ... 32 Şekil 34. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde ERO1 gen ifadesi ... 33 Şekil 35. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde HRD1 gen ifadesi ... 34 Şekil 36. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde SEL1 gen ifadesi ... 34 Şekil 37. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde DER1 gen ifadesi ... 34
v
Şekil 38. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde UBC32 gen ifadesi ... 35 Şekil 39. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde BI gen ifadesi ... 35 Şekil 40. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde NAC89 gen ifadesi ... 36 Şekil 41. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde AGB1 gen ifadesi ... 36 Şekil 42. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde bZIP60u gen ifadesi ... 37 Şekil 43. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde bZIP60s gen ifadesi ... 37 Şekil 44. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde bZIP28 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm) ... 38 Şekil 45. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde bZIP28 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 39 Şekil 46. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde IRE1A gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 39 Şekil 47. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde IRE1A gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 40 Şekil 48. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde IRE1B gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 41 Şekil 49. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde IRE1B gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 41 Şekil 50. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde BiP1 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 42 Şekil 51. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde BiP1 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 42 Şekil 52. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde BiP3 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 43 Şekil 53. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde BiP3 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 44 Şekil 54. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde ERO1 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 44
vi
Şekil 55. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde ERO1 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 45 Şekil 56. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde CNX gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 46 Şekil 57. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde CNX gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 46 Şekil 58. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde HRD1 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 47 Şekil 59. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde HRD1 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 47 Şekil 60. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde DER1 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 48 Şekil 61. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde DER1 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 48 Şekil 62. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde UBC32 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm) ... 49 Şekil 63. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde UBC32 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 49 Şekil 64. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde SEL1 gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 50 Şekil 65. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde SEL1 gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K:
Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 50 Şekil 66. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde bZIP60u gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/
ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 51 Şekil 67. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde bZIP60u gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 52 Şekil 68. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde bZIP60s gen ifadesi (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/
ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 52 Şekil 69. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde bZIP60s gen ifadesi (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) ... 53
vii
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 1. ER stresi ve UPR’de yer alan ve çalışmada denemeler sırasında gen ifadeleri incelenecek olan genlerin listesi ve işlevleri. ... 10 Tablo 2. Çalışmada qRT-PCR ile ifadesi incelnen genler, gen numaraları ve primer listesi ... 15
viii ÖZET
Post-translasyonel modifikasyonlar bitkilerin çevresel strese karşı verdikleri ilk yanıtlardan olup, hücre içerisindeki proteinlerin yer ve aktivitelerini değiştirmelerini içerir. Proteinlere poly(ADP-riboz) (PAR) eklenmesi, yani poly(ADP-riboz)ilasyon (PARilasyon), PAR polimerazlarca (PARP) NAD+’dan ADP-ribozların hedef proteinlere bağlanması sonucu oluşan bir post-translasyonel modifikasyondur. Bu modifikasyon, PAR glikohidrolaz (PARG) tarafından PAR polimerlerinin hidrolizlenmesi ve proteinlerden ayrılması ile geri dönüştürülebilir. PARilasyon bitkilerde sirkadiyen ritim ve streslere yanıt gibi fizyolojik olaylarda rol oynamaktadır.
ER’ de proteinlerin yanlış katlanarak birikmesi “Endoplazmik Retikulum stresi” olarak adlandırılmaktadır. Hücrelerde ER stresine bağlı olarak “Katlanmamış Protein Yanıtı”
(unfolded protein response=UPR) olarak isimlendirilen yanıt tetiklenmektedir. UPR, proteinlerin katlanmasını ve katlanamayan proteinlerin ortadan kaldırılmasında rol alan mekanizmaları uyarmaktadır. Laboratuvar koşullarında tunikamisin isimli antibiyotik ile ER stresi teşvik edilebilmektedir. Hayvan sistemlerinde yapılan son çalışmalarda, PARilasyonun ER stresi ve UPR’nin düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Ancak bu konuda bitkiler üzerine yapılan herhangi çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, çalışmamızda model bitki Arabidopsis thaliana’ da PARP inhibitörü 3-aminobenzamide (3AB) (PARilasyonun inhibisyonu) ve parg mutantları (de- PARilasyonun inhibisyonu) kullanılarak PARilasyonun mekanizmasının ER stresi ve UPR cevabı üzerindeki etkilerinin ortaya konması amaçlanmıştır.
Sonuç olarak, ER stresinin, stresin dozuna bağlı olarak PARilasyona uğrayan protein miktarında artışa neden olduğu bulunmuştur. PAR metabolizması ile ilgili yapılan analizlerde ER stresi sırasında özellikle PARG2 geninin ifadesinin strese yanıt verdiği belirlenmiştir. Ayrıca, bitkilerde PARilasyon miktarı farmasotik olarak azaltıldığında UPR ile ilişkili bZIP28, IRE1A, BIP1, CNX genlerinin uyarılmasında azalma gözlenmiştir. Bu bulgular PARilasyonun UPR’nin etkin şekilde uyarılmasında gerekli olduğunu ortaya koymaktadır. Yapılan fizyolojik analizler parg1-2 ve parg2-1 mutantlarının ER stresine karşı yabani tipe göre daha hassas olduğunu göstermiştir. Buna benzer olarak bu bitkilerin stres sonrasında iyileşme kapasiteleri de yabani tipe göre daha düşüktür. Bu bulgular PARilasyonun yanı sıra aynı zamanda protein dePARilasyonunun da ER stresine yanıt sırasında önemli rolleri olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada sunulan veriler ile bitkilerde PARilasyon’un ER stresine toleranstaki ve UPR’nin uyarılmasındaki rolü ilk kez ortaya konmuştur.
Anahtar Kelimeler: Arabidopsis thaliana, ER stresi, katlanmamış protein yanıtı, poly(ADP-riboz)ilasyon
ix
x ABSTRACT
Post translational modifications (PTM)s are the one of the first plant responses to environmental stress and during stress, PTMs can change location and/or modify the structure of proteins that are present in the cell. The addition of poly (ADP)ribose (PAR) to proteins, hence PARylation, is a PTM that is catalyzed by PAR polymerases (PARP), which adds ADPribose to targeted proteins from NAD+. This modification can be reversed by PAR glycohydrolases (PARG) by hydrolysis and removal of PAR from proteins.
PARylation takes part in many physiological processes such as circadian rhythm and responses to abiotic and biotic stresses in plants.
The accumulation of unfolded and misfolded proteins in the ER is called endoplasmic reticulum (ER) stress. As a response to ER stress unfolded protein response (UPR) is triggered in the cell. This response induces the mechanisms that increase protein folding capacity and that degrade the unfolded proteins. In laboratory, ER stress can be triggered by antibiotic tunicamycin (Tm). Recent studies on animals systems showed that, PARylation take roles in regulation of ER stress and UPR. However, there is no study conducted on this subject in plant systems. For this reason, it is important to understand the relation between UPR and PARylaiton in plants. For this aim, in this study, PARP inhibitor 3 aminobenzamid (3AB) and Arabidopsis thaliana parg mutants (decreased dePARylation) was used to evaluate the effects of PARylation on ER stress and UPR.
In conclusion, ER stress induced degree of protein PARylation depending on severity of the stress. Analysis of PAR metabolism during ER stress demonstrated that especially PARG2 was responsive to stress. Moreover, induction of bZIP28, IRE1A, BIP1 and CNX was decreased, when PARylation was inhibited pharmaceutically. These findings demonstrate that PARylation is required for efficient induction of UPR.
Physiological analysis of parg1-2 and parg2-1 mutants concluded that these genotypes are more sensitive to ER stress, when compared to wild type. Similarly, recovery capacity of these genotypes, after stress, was lower when compared to wild-type. These findings, imply that besides PARylation, dePARylation of proteins is also important during ER stress. Data presented in this work has established role of PARylation during ER stress tolerance and induction of UPR in the plants for the first time.
Keywords: Arabidopsis thaliana, ER stress, poly(ADP-ribosyl)ation, unfolded protein response
xi
1 1. GİRİŞ
Proteinlere Poly(ADP-riboz) (PAR) eklenmesi yani Poly(ADP-riboz)ilasyon (PARilasyon), PAR polimerazlarca (PARP) NAD+’dan ADP-ribozların hedef proteinlere bağlanması ile gerçekleşen bir post-translasyonel modifikasyondur. Bu modifikasyon PAR glikohidrolaz (PARG) tarafından PAR polimerlerinin hidrolizlenmesi ve proteinlerden ayrılması ile geri dönüştürülebilir (Briggs ve Bent, 2011). PARilasyonun bitkilerde sirkadiyen ritim, programlanmış hücre ölümü, abiyotik ve biyotik streslere yanıt gibi birçok fizyolojik olayda rolü olduğu bilinmektedir (Lamb vd., 2012). Model bitki olan Arabidopsis’de 3 PARP geni bulunmaktadır (PARP1-3) (Otto vd., 2005). Bitki PARP’ları memeli PARP’larına yapısal olarak benzerlik göstermektedir. Yapısal benzerliklerinin yanısıra, enzimatik aktiviteleri incelendiğinde bitki PARP’ları ile memeli PARP’larının işlevsel olarak homolog oldukları görülür (Briggs ve Bent, 2011). PARP’ın işlevlerinin incelenmesi amacıyla PARP aktivitesini inhibe edebilen farklı kimyasallar (inhibitörler) kullanılmaktadır. Bu inhibitörler PARP katalitik bölgesini hedef alarak hücrede farklı genler tarafından kodlanan tüm PARP proteinlerini inhibe edebilmektedir (Rouleou vd., 2010). 3-aminobenzamid (3AB), nikotinamid, ve 3- metoksibenzamid (3MB) hayvan sistemlerinde yaygın kullanılan ve NAD+ yapısını taklit ederek PARP enzimlerini inaktif hale getiren inhibitörlerdir. Bu inhibitörlerin bitki sistemlerinde de etkili oldukları gösterilmiştir (Chen vd., 1994).
DNA hasarının aktifleştirdiği PARP’lar bu hasara ilk cevap veren enzimlerdendir.
PARP’lar, DNA hasar algılayıcı olarak iş görürler ve DNA hasarının boyutuna göre ya hasarın tamirinde ya da hücrenin programlanmış hücre ölümü ile ortadan kaldırılmasında görev alırlar (Lamb vd., 2012). Örneğin, Arabidopsis’de PARP1 ve PARP2 gen ifadeleri DNA hasarına neden olan gama radyasyon ya da reaktif oksijen türü (ROS) uygulamaları ile artış göstermektedir (Chen vd., 2003). Günümüze kadar yapılan çalışmalar PARilasyonun tüm bitki seviyesinde abiyotik streslere karşı cevapta önemli rolleri de olduğunu göstermiştir.
Arabidopsis’de AtPARP1 ya da AtPARP2’nin susturulması kuraklık ve yüksek ışık streslerine karşı bitki toleransını arttırmıştır (Vanderauwera vd., 2007).
Neredeyse tüm translasyon sonrası modifikasyonlar gibi PARilasyon da geri dönüşümlü bir modifikasyondur. PARG enzimleri, PARP’larca sentezlenen ADP-riboz polimerlerini hidrolize ederler ve böylece hedef proteinleri eski haline döndürerek PARP’ın karşıtı olarak iş görürler (Schreiber vd., 2006). Fakat PARG’lar, PARP aktivitesi sonucunda harcanan NAD+’ nın geri dönüşümünü sağlayamazlar ve sonuç olarak serbest ADP-riboz havuzunda aşırı miktarda artış gözlenir. Genel olarak hayvanlarda tek bir PARG geni bulunurken, Arabidopsis genomunda 2 adet PARG kodlayan gen (PARG1 ve PARG2)
2
bulunmaktadır. Farklı bitki türlerinde PARG kodlayan gen sayısı değişim göstermektedir.
Örneğin çeltik ve söğüt bitkilerinde Arabidopsis’deki gibi 2 adet PARG kodlayan gen bulunurken, Ricinus communis tek bir PARG genine sahiptir (Briggs ve Bent, 2011). PARG’ın işlevsel rolü üzerine yapılan çalışma sayısı çok sınırlıdır. PARG1’ in Arabidopsis’de sirkadiyen ritmin (biyolojik saat) düzenlenmesinde iş gördüğü bildirilmiştir. parg1 mutasyonunun yaprak hareketini arttırdığı, kısa ve uzun günlerde erken çiçeklenmeye neden olduğu ve sirkadiyen saat ile kontrol edilen genlerin periyodlarını uzattığı anlaşılmıştır (Panda vd. 2002). Ayrıca, PARG2 ifadesinin biyotik strese yanıt verdiği bilinmektedir. Örneğin, Arabidopsis’de patojenik Pseudomonas syringae enfeksiyonundan sonra, PARG2 geninin ifadesinde artış gözlenmiştir (Adams-Phillips vd., 2010).
Son yıllarda hayvan sistemlerinde PARilasyon’un endoplazmik retikulum (ER) stresine verilen cevapların uyarılmasında da önemli rol oynadığı gösterilmiştir (Chambers vd., 2012; Jwa ve Chang, 2012). ER hücrenin salgı proteinlerinin sentezlendiği, değişime uğradığı ve katlandığı bölmesidir. Bu organelde protein katlanma mekanizması salgı proteini yüküne göre duyarlı bir şekilde kontrol edilir (Schröder ve Kaufman, 2005). Yüksek salgı proteini yükü altında ER protein katlama mekanizmalarının yetersiz kalması ve ER lümeninde katlanmamış ya da yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi ER stresi olarak adlandırılır. Bu koşullar altında katlanmamış protein yanıtı (unfolded protein response=UPR) olarak adlandırılan ve ER stresine karşı savunmada rol alan genleri uyaran bir yanıt tetiklenir (Iwata ve Koizumi, 2012). ER’de katlanmamış proteinler bZIP28 ve IRE1 olarak adlandırılan iki protein tarafından algılanır. Bu proteinler aynı zamanda UPR yanıtının uyarılmasında da sinyal görevi görürler (ayrıntılı mekanizma için bkz “Literatür Özeti”). UPR, ER içinde protein çökelmesini engelleyen, protein katlanma ve yeniden katlanma kapasitesini arttıran ve doğru şekilde katlanamayan proteinlerin parçalanmasını teşvik eden bir yanıttır. UPR tarafından ifadesi uyarılan genler işlevlerine göre moleküler şaperonlar, katlanma yardımcıları ve ER ilişkili protein parçalanması (ER associated protein degradation=ERAD) genleri olarak sınıflandırılabilir (Howell, 2013). Moleküler şaperonlar ve katlanma yardımcılarına örnek olarak HSP70 benzeri protein binding protein 1 (BiP1) ve BiP3, kalneksin (CNX), kalretikulin (CRT), endoplasmik retikulum oksidoredüktaz 1 (ERO1) ve protein disulfide izomeraz (PDI) verilebilir. Bu proteinlerden BiP’ler moleküler şaperonlar, CNX-CRT sistemi kalite kontrol ve glikosilasyon, ERO1-PDI sistemi ise disülfid bağların oluşumundan sorumludur (Liu and Howell, 2016). UPR, tamir edilmesi ve doğru katlanması mümkün olmayan proteinlerin ER lümeninde birikimini engellemek ve parçalanmalarını sağlamak amacıyla ERAD’ı uyarır.
ERAD mekanizması içinde lümenal bir lektin olan OS9 katlanmamış glikoproteinleri tanır ve SEL1/HRD3 ve HRD1 aracılığıyla (üç protein ER zarında transmembran bir kompleks
3
oluşturur) bu proteinleri sitozole taşır ve bu sırada ubikutinlenmelerini sağlar. Ubikutinlenen proteinler ise sitozolde 26S proteozom tarafından parçalanırlar (Su vd., 2012).
Yukarıda özetlendiği gibi ER’de protein katlanması, ER stresi ve UPR karmaşık bir gen ağıyla birbiriyle bağlantılıdır. Bu protein katlanma mekanizmasının titizlikle kontrolü salgı proteinlerinin hedeflerine doğru katlanmış şekilde ulaşması için gereklidir. Bu nedenle ER’de protein katlanmasının ve ER stresine verilen yanıtın düzenlemesini etkileyebilecek yeni mekanizmaların aydınlatılması büyük bir önem taşımaktadır. Hayvan sistemlerinde PARilasyon, ER stresi ve UPR etkileşimini gösteren çalışmalar “Literatür Özeti” kısmında ayrıntılı olarak anlatılmıştır.
Özetlenecek olursa hayvan sistemlerinde PARilasyon’un ER stresi altında UPR’nin uyarılması ve ER de protein katlanma mekanizmasının kontrolü için zorunlu bir modifikasyon olduğu, PARilasyon yokluğunda UPR’nin uyarılamadığı ve ER stresine verilen yanıtın şiddetinin azaldığı gösterilmiştir. Ancak hayvan sistemlerinde şu ana kadar bu yönde çalışmalar yapılmasına karşın bitki sistemlerinde bu konuda hiçbir çalışma bulunmamaktadır.
Literatürdeki bu boşluğun doldurulması bitkilerde ER stresi ve katlanmamış protein yanıtı ve PARilasyon mekanizmasının etkilerinin daha iyi anlaşılması için büyük bir önem taşımaktadır. Bu nedenle çalışmamızda model bitki Arabidopsis thaliana kullanılarak bitki sistemlerinde bu konunun araştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışmada PARP inhibitörü 3AB (PARilasyonun inhibisyonu) ve A. thaliana’nın parg mutantları (de-PARilasyonun inhibisyonu) kullanılarak PARilasyon mekanizmasının ER stresi ve UPR cevabı üzerindeki etkileri aydınlatılılmıştır.
Bu bilgiler ışığında çalışmamızda aşağıdaki soruların yanıtlanması amaçlanmıştır:
1- ER stresi PARilasyonu nasıl etkilemektedir?
ER stresinin bitkilerde PARilasyonu nasıl etkilediği (arttırma/azaltma) bilinmemektedir.
Bu sorunun yanıtının araştırılması için Tm teşvikli ER stresi uygulanmış bitkilerde anti-PAR antikoru kullanarak western blot analizleri yapılmış ve orta ve yüksek şiddetteki ER stresine bitkilerin verdiği PARilasyon yanıtları incelenmiştir.
2- ER stresi altında PAR metabolizması yani PARP ve PARG genleri nasıl düzenlenmektedir?
ER stresi altında PARilasyonun değişimi aydınlatıldıktan sonraki basamak bu strese karşı PARilasyon ile ilişkili PARP ve PARG genlerinin verdiği yanıtların belirlenmesidir. Bu
4
yanıtların belirlenmesi için PARP1,2,3 ve PARG1,2 genlerinin ER stresi altındaki ifadeleri qRT-PCR ile belirlenmiştir.
3- Bitkilerde PARilasyon ER stresi sırasında UPR’nin uyarılması için gerekli midir?
PARilasyonun ortadan kalkması ER stresine toleransı etkiler mi?
PARilasyonun ER stresi ile ilişkili UPR genlerinin uyarılmasındaki rolünün belirlenmesi amacıyla 3-aminobenzamid (3AB) adlı inhibitör kullanılmıştır. Bu inhibitör PARP enzimini inhibe ederek PARilasyonu engellemektedir. ER stresi (Tm uygulaması) ile birlikte, 3AB uygulanarak (Tm+3AB grubu) PARilasyonun engellendiği durumda ER stresi ile ilişkili UPR genlerinin nasıl düzenlendiği araştırılmıştır. Böylelikle PAR modifikasyonlarının ER stresi ile ilişkisi açık şekilde ortaya konulmuştur.
4- PARilasyonun geri dönüştürülmesi ER stresine yanıtta ve bitkilerin iyileşmesinde (recovery) yer almakta mıdır?
Proteinlerin PAR ile modifiye edilmesinin yanı sıra, PAR modifikasyonlarının geri dönüştürülmesi yani PAR’ın proteinlerden ayrılması da bitkilerin çevresel faktörlere yanıtlarında yer alan sinyal yolaklarının düzenlenmesinde etkilidir. Bu nedenle projede PAR modifikasyonlarını geri dönüştüremeyen PARG mutantları (parg1-2, parg2-1) kullanılmıştır.
Bu mutantlarda proteinlerde PAR modifikasyonlarının biriktiği bilinmektedir. Bu mutantların Tm teşvikli ER stresine maruz bırakılması ile (i) ER stresine cevapta döngüsel PARilasyon mekanizmasının (PARilasyon/de-PARilasyon) rolü ve (ii) ER stresine verilen cevaptan sonra iyileşmede (recovery) PARilasyonun önemi aydınlatılmaya çalışılmıştır. İyileşme denemelerinde bitkiler ER stresine üç gün maruz bırakıldıktan sonra 3 gün boyunca stressiz koşullarda büyütülmüştür (uygulama detayları için bkz. “Gereç ve Yöntem” bölümü).
Tunikamisin (Tm) ile uyarılan ER stresi cevabının ve UPR genlerinin ifadelerinin 3 gün iyileştirme sonunda kontrol bitkileri seviyesine geldiği bilinmektedir (McCormack vd., 2015).
yabani tip ve parg bitkilerinde UPR genlerinin ifadelerinin iyileşme sonrasındaki yanıtları qRT-PCR ile karşılaştırılarak araştırılmıştır. Yukarıda belirtilen denemeler sırasında ER stresinin bitki büyümesi ve fizyolojisi üzerine etkileri bitki yaş ve kuru ağırlıkları ile klorofil miktarı belirlenerek ortaya konmuştur.
5
2. LİTERATÜR ÖZETİ
İklim değişikliği ve dünya nüfusundaki artış strese karşı toleranslı bitkilerin geliştirilmesi ve bitki verimliliğin arttırılmasına yönelik gereksinimi öne çıkarmaktadır. Bitkiler, büyümelerini ve verimliliklerini etkileyen birçok abiyotik ve biyotik strese maruz kalmaktadırlar. Bitkilerin strese karşı ilk verdikleri yanıtlardan birisi hücre içerisinde varolan proteinlerin yerini ve aktivitelerini değiştirmelerini içeren post-translasyonel modifikasyonlardır (PTM) (Deribe vd., 2010). PTM’ler içinde en iyi bilinenleri protein fosfosilasyonu, ubikütinasyonu, disülfid köprülerin düzenlenmesi, S-glutatyonilasyon ve S- nitrosilasyon olarak sıralanabilir. Ancak diğer PTM’lerin işlevleri ve düzenlenme mekanizmaları ile ilgili bilgiler kısıtlıdır.
Proteinlere Poly(ADP-riboz) (PAR) eklenmesi yani Poly(ADP-riboz)ilasyon (PARilasyon), PAR polimerazlarca (PARP) NAD+’dan ADP-ribozların hedef proteinlere bağlanması ile gerçekleşen bir post-translasyonel modifikasyondur. Bu modifikasyon PAR glikohidrolaz (PARG) tarafından PAR polimerlerinin hidrolizlenmesi ve proteinlerden ayrılması ile geri dönüştürülebilir (Briggs ve Bent, 2011).
PARilasyonun bitkilerde sirkadiyen ritim, programlanmış hücre ölümü, abiyotik ve biyotik streslere yanıt gibi birçok fizyolojik olayda rolü olduğu bilinmektedir (Lamb vd., 2012).
Mayalar hariç tüm ökaryotik organizmalarda birden fazla PARP proteini bulunmaktadır. Tüm PARP’ların ortak noktası NAD+’yı ADP-riboz ve nikotinamide parçalayan bir C-terminal katalitik bölge içermeleridir. Model bitki Arabidopsis’de ise 3 PARP geni bulunmaktadır (PARP1-3) (Otto vd., 2005). Bitki PARP’ları memeli PARP’larına yapısal olarak benzerlik göstermektedir. Bitki ve memelilerdeki yapısal bu benzerlikler yine bu gruplarda PARP fonksiyonunun da korunmuş olabileceğini göstermektedir (Chen vd., 1994). Arabidopsis, kavak (Populus trichocarpa) ve çeltikte (Oryza sativa) bulunan PARP proteinleri korunmuş PARP katalitik bölgesi ve WGR nükleik asit bağlanma bölgesini içermektedir. Korunmuş protein bölgeleri ve yapılarına göre bitki PARP proteinleri üç alt gruba ayrılabilir. Bunlardan ilki, insan PARP1 proteinine benzerlik gösteren ve iki adet çinko-parmak DNA bağlanma bölgesi içerenler, ikincisi, insan PARP2 proteinine benzerlik gösteren ve ek herhangi bir N- terminal bölge bulundurmayanlar, üçüncüsü ise insan PARP1 proteinine benzerlik gösteren ve N-terminal çinko-parmak bölgesi içermeyenlerdir (Briggs ve Bent, 2011).
Yapısal benzerliklerin yanısıra, enzimatik aktiviteleri incelendiğinde bitki PARP’ları memeli PARP’ları ile fonksiyonel olarak homologlardır. Bitkisel nüklear proteinlerin poly(ADP- riboz) ile kovalent modifikasyonu ilk olarak tütün (Nicotiana tabacum) bitkisinin H1, H2A ve H2B histonlarına NAD+’nın kovalent bağlanması ile gösterilmiştir. Ayrıca Arabidopsis’de ve
6
mısırda hasar görmüş DNA’ya PARP ile NAD+ bağlandığı gösterilmiştir (Doucet-Chabeaud vd., 2001; Chen vd., 1994).
PARP’ın fonksiyonlarının incelenmesi amacıyla PARP aktivitesini inhibe edebilen farklı kimyasallar (inhibitörler) kullanılmaktadır. Bu inhibitörler PARP katalitik bölgesini hedef alarak hücrede farklı genler tarafından kodlanan tüm PARP proteinlerini inhibe edebilmektedir (Rouleou vd., 2010). Aminobenzamid (3AB), nikotinamid, ve 3- metoksibenzamid (3MB) hayvan sistemlerinde yaygın kullanılan ve NAD+ yapısını taklit ederek PARP enzimlerini inaktif hale getiren inhibitörlerdir. Bu inhibitörlerin bitki sistemlerinde de çalıştığı gösterilmiştir. Bunlara örnek olarak, her üç inhibitöründe mısır çekirdeklerinde PARP enzim aktivitesini baskılaması ve 3MB’nin Arabidopsis’de ADP-riboz polimerlerinin oluşmasını engellemesi verilebilir (Chen vd., 1994). PARP aktivitesi genetik mutasyonlar ile azaltılabilmektedir (PARP genlerinin tamamen ya da kısmi susturulması ile), ancak kronik PARP eksikliğinin bitki fenotipi ve büyümesi üzerine olumsuz etkileri nedeniyle PARP inhibitörleri bu enzimin fonksiyonlarının araştırılmasında değerli bir araç olmaya devam etmektedir (Briggs and Bent, 2011). Bu kronik etki nedeniyle çalışmamızda parp mutantları kullanılması tercih edilmemiştir.
PARP’lar DNA hasarı ile aktifleştirilen ve bu hasara ilk cevap veren enzimlerdendir.
PARP’lar, DNA hasar algılayıcı olarak iş görürler ve DNA hasarının boyutuna göre ya hasarın tamirinde ya da hücrenin programlanmış hücre ölümü ile ortadan kaldırılmasında görev alırlar (Lamb vd., 2012). Örneğin insan PARP1 ve PARP2 enzimleri hasar görmüş DNA’ya bağlanarak aktifleşir ve kendi kendini değiştirerek kendi PARilasyonunu katalizler (Wang vd., 2006). Bu modifikasyonun oluşması DNA tamirinden sorumlu diğer enzimlerin aktifleşmesini sağlar. Bitki PARP’ları genotoksik stres sırasında benzer rollere sahiptir.
Arabidopsis’de PARP1 ve PARP2 gen ifadeleri DNA hasarına neden olan gama radyasyon ya da reaktif oksijen türü (ROS) uygulamaları ile artış göstermektedir (Doucet-Chabeaud vd., 2001). AtPARP2’nin bitkide transgenik olarak aşırı ifade edilmesi ROS teşvikli DNA hasarını azaltmış, PARP’in susturulması ise aynı durumda DNA hasarını arttırmıştır (Block vd., 2005).
Bu bulgular, hayvanlarda olduğu gibi bitkilerde de PARP enzimlerinin DNA hasarına karşı koruyucu etkisi olduğunu göstermektedir.
Yukarıda bahsedildiği gibi PARP’ların DNA hasarı algılayıcıları olmaları nedeniyle ayrıca hayvan hücrelerinde programlanmış hücre ölümü düzenleyicisi olarak görev almaktadır. Düşük miktarda DNA hasarı PARP aktivasyonuna ve DNA hasarının başarılı şekilde tamirine neden olurken, yüksek miktarda DNA hasarı PARP’ın aşırı derecede uyarılmasına neden olmaktadır. PARP’ın aşırı derecede uyarılması yüksek miktarda NAD+
7
tüketimine, sonrasında ise hücrede solunum sürecinin sekteye uğramasına ve programlanmış hücre ölümünün tetiklenmesine neden olmaktadır (Du vd., 2003)). PARP tarafından programlanmış hücre ölümünün tetiklenmesine benzer bir gözlem bitkilerde de yapılmıştır. Soya (Glycine max) hücre kültüründe AtPARP2’nin aşırı ifade edilmesi düşük miktarda ROS’a karşı DNA’nın daha iyi korunmasına neden olurken, yüksek miktarda ROS uygulandığında hücre ölümü miktarının yabani tipe göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir (Amor vd., 1998). Ayrıca PARP inhibitörlerinin soya ve tütün hücre kültürlerini oksidatif stres ve ısı şoku teşvikli programlanmış hücre ölümüne karşı korudukları gösterilmiştir (Amor vd., 1998; Tian vd., 2000). Bu gözlemler PARP’ın bitki hücrelerinde programlanmış hücre ölümünün düzenlenmesinde önemli rolü olduğunu göstermiştir. Bu bulgular ayrıca, bitkilerde poly(ADP-riboz) seviyesinin hassas şekilde kontrol edilmesi gerektiğini, az miktarda PARilasyon koruma sağlarken aşırı PARilasyonun ise hücre ölümüne neden olduğunu göstermektedir.
Günümüze kadar yapılan çalışmalar PARilasyonun tüm bitki seviyesinde abiyotik streslere karşı cevapta önemli rolleri olduğunu göstermiştir. Örneğin, Arabidopsis’de AtPARP1 ya da AtPARP2’nin susturulması kuraklık ve yüksek ışık streslerine karşı bitki toleransını arttırmıştır (Vanderauwera vd., 2007). Bu çalışmalar stres altında PARP aktivasyonu ile NAD+ ve ATP tüketiminin arttığını ve poly(ADP-riboz) biriktiğini göstermiştir (Block vd., 2005). Stresli koşullar altında PARP aktivitesinin azaltılması stres altında daha az NAD+ ve ATP kullanılmasına buna bağlı olarak mitokondriyal solunum üzerindeki yükün hafifletilmesine ve daha az ROS üretilmesine neden olmaktadır. Böylelikle hücrenin enerji verimi artmaktadır.
PARilasyon geri dönüşümlü bir modifikasyondur. PARG enzimleri, PARP’larca sentezlenen ADP-riboz polimerlerini hidrolize ederler ve böylece hedef proteinleri eski haline döndürerek PARP’ın karşıtı olarak iş görürler (Schreiber vd., 2006). Fakat PARGlar, PARP aktivitesi sonucunda harcanan NAD+’ nın geri dönüşümünü sağlayamazlar ve sonuç olarak serbest ADP-riboz havuzunda aşırı miktarda artış gözlenir. Serbest ADP-riboz miktarındaki artış memelilerde iyi bilinen bir hücre ölüm sinyalidir. Hayvanlarda PARG geninin susturulması ölümcül olması nedeniyle bu konudaki çalışmalar PARP’lar ile kıyaslandığında az sayıdadır ve PARG fonksiyonlarının aydınlatılmasına yönelik çalışmalar hala devam etmektedir. Ayrıca, hayvanlarda PARG’ların embriyonik gelişimde, hücre ölümünde ve DNA onarımında önemli rolleri olduğu bilinmektedir (Briggs ve Bent, 2011).
Genel olarak hayvanlarda tek bir PARG geni bulunurken, Arabidopsis genomunda 2 adet PARG kodlayan gen bulunmaktadır. Farklı bitki türlerinde PARG kodlayan gen sayısı
8
değişim göstermektedir. Örneğin çeltik ve söğüt bitkileri Arabidopsis’e benzer olarak 2 adet PARG kodlayan gene sahipken, Ricinus communis tek bir PARG genine sahiptir (Briggs ve Bent, 2011). Arabidopsis’de bulunan iki PARG geni %68 oranında benzerlik göstermektedir.
Bitkilerde yapılan bir çalışmada parg1 mutantında ADP-riboz polimer konsantrasyonunun kontrole göre 25 kat daha fazla olduğu belirlenmiştir (Panda vd., 2002). PARG’ın fonksiyonel rolü üzerine yapılan çalışmalar çok kısıtlıdır. PARG1’ in Arabidopsis’de sirkadiyen ritmin düzenlenmesinde iş gördüğü bildirilmiştir. parg1 mutasyonunun yaprak hareketini arttırdığı, kısa ve uzun günlerde erken çiçeklenmeye neden olduğu ve sirkadiyen saat ile kontrol edilen genlerin periyodlarını uzattığı anlaşılmıştır. Bu çalışma sonucunda elde edilen bilgiler ışığında bir düzenleyici proteininin PARilasyona uğraması ile sirkadiyen ritmin kontrol edildiği düşünülmektedir (Panda vd., 2002). Bunlara ek olarak, PARG2 ifadesinin biyotik strese yanıt verdiği bilinmektedir. Örneğin, Arabidopsis’in patojen Pseudomonas syringae ile infeksiyonu sonrasında PARG2 gen ifadesinde artış gözlenmiştir (Adams-Phillips vd., 2010). Birçok farklı biyotik uyarıcı ile uyarılan PARG2 ifadesi PARilasyonun bitki savunmasında rol aldığı yönünde değerlendirilmektedir.
Şekil 1’de PARP ve PARG proteinlerinin fonksiyonu ve PARilasyon mekanizması gösterilmiştir. Ayrıca önerilen çalışmada kullanılması planlanan PARP inhibitörü (3AB) ve parg mutantlarının (parg1-2 ve parg2-1) PARilasyon mekanizmasında etki ettikleri basamaklar da gösterilmiştir.
Şekil 1. Poly(ADP-riboz)ilasyon (PARilasyon) mekanizması, bu mekanizmadaki görevli genleri ve projede kullanılması planlanan PARP ve PARG inhibisyon mekanizmalarını gösteren şekil (Briggs vd., 2011’den değiştirilerek).
9
Yukarıda görüldüğü gibi PARilasyon bitkilerde farklı fizyolojik süreçlerde ve çevresel streslere cevapta önemli rollere sahiptir. Hayvan sistemlerinde yeni yapılan çalışmalarla PARilasyonun endoplazmik retikulum stresi ile ilişkili önemli rolleri olduğu gösterilmiştir, ancak bu konu hakkında bitkilerde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır.
Bilindiği gibi hücrelerarası alana ya da salgı yolu organellerine hedeflenmiş olan proteinler, ER-bağlı ribozomlarda sentezlenir. Sonrasında ER lümeni içine taşınır ve burada doğal hallerine katlanırlar (Schröder ve Kaufman, 2005). Bu katlanma yolağı boyunca, proteinlerinin katlanması çeşitli kalite-kontrol sistemleri tarafından her aşamada denetlenir ve sadece düzgün katlanmış proteinler Golgi aygıtına geçerek salgı yolağında ilerlemeye devam eder (Iwata ve Koizumi, 2012). Örneğin hücre duvarı protein bileşenleri, plazma zarını oluşturan proteinlerin çoğu ve vakuollerde yer alan proteinlerin büyük bölümü salgı yolağı kaynaklı proteinlerdir (Sanderfoot ve Raikhel, 2003). Katlanma mekanizmalarının yetersiz kaldığı durumlarda, ER’ de proteinlerin yanlış katlanarak birikmesi veya çökelmeleri
“Endoplazmik Retikulum Stresi”ne neden olmaktadır (Iwata ve Kouzumi, 2010). ER lümeninde yetersiz katlanma kapasitesine bağlı olarak katlanmamış proteinlerin birikimi
“Katlanmamış Protein Yanıtı” (unfolded protein response=UPR) olarak adlandırılan bir yanıtı tetikler. Bu yanıt proteinlerin katlanmasında (şaperonlar, katlanma yardımcıları) ve katlanamayan proteinlerin ortadan kaldırılmasında rol alan mekanizmaları uyarır (Liu ve Howell, 2016).
ER stresi ER zarında bulunan algılayıcılar ve sinyal iletim elemanları tarafından belirlenir. ER stres sinyal yolu iki koldan oluşmaktadır. Bunlardan ilki zar ilşkili bir transkripsiyon faktörü olan bZIP28 diğeri ise membran ilşkili protein kinaz ve ribonükleaz aktivitelerine sahip inositol requiring enzyme 1 (IRE1)’dir (Koizumi vd., 2001;Liu ve Howell, 2010; Iwata ve Koizumi, 2012). ER lümeninde katlanmamış proteinlerin birikmesiyle bZIP28, ER’den Golgi aygıtına geçer ve burada S1P ve S2P proteazları tarafından kesilir, böylece proteinin N-terminal kısmı sitozolde serbest kalır. Kesilmiş bZIP28 nukleusa taşınır ve burada ER stresine cevap verecek olan mekanizmaları uyarır (Liu vd., 2007). IRE1’in sinyal mekanizması ise bZIP28’den farklıdır. ER stresinin algılanması ile IRE1 bZIP60 mRNA’sını keserek (ribonükleaz aktivitesi) bZIP60’ın aktif formunun sentezlenmesine yol açar böylelikle bu transkripsiyon faktörü ER stres cevaplarını uyarır (Nagashima vd., 2011). Ayrıca bZIP28 ve bZIP60’ın aktif formlarının heterodimerler oluşturabildiği ve bu iki yolun kesişebildiği de bilinmektedir.
ER stresine karşı verilen önemli cevaplardan bir diğeride ER lümeninde biriken katlanmamış proteinlerin taşınımı ve parçalanmasıdır (Su vd., 2011). Böylelikle bu
10
proteinlerin ER’de çökelmeleri engellenir. ER ilişkili protein parçalanması (ER-associated protein degradation=ERAD) olarak adlandırılan bir mekanizmayla proteinler ER’den sitozole taşınır ve 26S proteozomu tarafından parçalanır. Katlanmamış proteinler bi lümenal lektin olan OS9 tarafından tanınırlar ve bu proteinler SEL1/HRD3 (integral zar proteini) ve HRD1 (E3 ligaz) tarafından sitozole taşınırlar. Taşınma sırasında proteinlerin ubikutinlenmesi gerçekleşir ve ubikutinlenen proteinler 26S proteozom tarafından parçalanırlar (Su vd., 2012).
ER stresi laboratuvar ortamında çeşitli kimyasallar ile uyarılabilir. Salgı yolağına hedeflenmiş proteinlerin çoğu N-bağlı oligosakkaritlerin eklenmesiyle değişime uğrayan glikoproteinlerdir. Glikolizasyon olarak adlandırılan bu olay önemli bir translasyon sonrası modifikasyon olup proteinlerin parçalanmasını ve proteolize uğramalarını engellemekte ve ayrıca çözünürlüklerini arttırmaktadır. Bunlara ek olarak glikolizasyon, ER içerisindeki kalite- kontrol mekanizması için bir “tanıma sinyali” olarak iş görmektedir (Ceriotti, 2011). Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarda tunikamisin isimli antibiyotiğin yukarıda sözü edilen N- glikolizasyonunu engelleyerek ER stresine neden olduğu bulunmuştur (Liu vd., 2007).
Dolayısıyla tunikamisin hücrede oluşan ER stresine karşı verilen “katlanmamış protein yanıtı”
nın spesifik teşvik edicilerinden biridir. Bu özelliği nedeniyle çalışmamızda ER stresinin teşvik edilmesi için Tm kullanılmıştır. Çalışmamızda gen ifadeleri incelenen ve ER stresinin algılanmasında, sinyal iletiminde ve UPR’de yer alan genler Tablo 1’de işlevleri ile birlikte verilmiştir.
Tablo 1. ER stresi ve UPR’de yer alan ve çalışmada denemeler sırasında gen ifadeleri incelenecek olan genlerin listesi ve işlevleri.
Laboratuvarımızda gerçekleştirilen daha önceki çalışmalarda ER stresinin bitki stres yanıtlarında önemli rolü olduğu bilinen reaktif oksijen türleri (ROS) ile ilişkisi ortaya
11
konmuştur (Ozgur vd., 2014; Ozgur vd., 2015). Bu çalışmalarda ER stresinin NADPH oksidaz aracılı ROS sinyalini tetiklediği, hücresel redoksu yeniden düzenlediği ve antioksidan savunmayı uyardığı gösterilmiştir. Ayrıca, kloroplast, mitokondri ve peroksizomlarda ROS birikiminin yapay olarak arttırılmasının, yani bu hücre bölmelerinde oksidatif stres oluşturulmasının da ER stresine neden olduğu gösterilmiştir.
2012 yılında Nature dergisinde yayınlanan bir çalışmada, PARP’ ların memelilerde katlanmamış protein yanıtını düzenlemede de rolü olduğu gösterilmiştir (Jwa ve Change, 2012). İnsanda PARP16 bir ER transmembran proteinidir ve bu protein ER stresi sırasında UPR’nin uyarılması için ihtiyaç duyulan olan IRE1’in işlerliği için gereklidir. PARP16, ER stresi sırasında kendini PARilasyona uğratarak aktifleşir ve bunun ardından IRE1’i PARilasyona uğratarak UPR’yi uyarır. IRE1’in PARP16 ile PARilasyonu ER stresi olmaksızın UPR’yi uyarabilmektedir. Bu olay UPR’nin uyarılmasında sadece ER stresinin değil IRE1’in PARilasyonunda tek başına görev alabildiğini göstermektedir. Ayrıca PARP16’nın UPR’nin uyarılması için gerekli olduğu mutantlar kullanılarak gösterilmiştir (Jwa ve Change, 2012).
Yine hayvan sistemlerinde gerçekleştirilen bir başka çalışmada ise ER lümeninde proteinlerin katlanmasından sorumlu HSP70 benzeri proteinler olan BiP’lerin (binding protein) aktivitelerinin PARilasyon ile düzenlenebildiği gösterilmiştir (Chambers vd., 2012). Ancak hayvan sistemlerindeki çalışmalara karşın bitki sistemlerinde bu konuda hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Literatürdeki bu boşluğun doldurulması bitkilerde ER stresi ve katlanmamış protein yanıtının ve PARilasyon mekanizmasının etkilerinin daha iyi anlaşılması için büyük önem taşımaktadır.
3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1 Bitkilerin büyütülmesi ve uygulamalar
Araştırmamızda genom dizisi aydınlatılmış model bitki Arabidopsis thaliana yaban tipi (Col-0) ve PARG mutantları parg1-2 (SALK_116088) ve parg2-1 (GABI_072B04) kullanılmıştır. PARG mutantları Helsinki Üniversitesi’nden Prof. Dr. Jaakko Kangasjarvi tarafından sağlanmıştır.
Tohumlar kullanılmadan önce %70 etanolde 1 dakika bekletildikten sonra steril distile suda 5 kez yıkanmış ve ardından %4 NaOCl (sodyum hipoklorit) çözeltisinde 10 dakika tutulduktan sonra steril distile suda 5 kez yıkanarak sterilize edilmiştir. Tohumların yüzey sterilizasyonu işlemi laminar flow steril kabinde gerçekleştirilmiştir. Tohumlar çimlenmenin senkronizasyonu için stratifikasyon amaçlı 4oC’de 72 saat bekletilmiştir.
12
Bitkilerin yetiştirilmesi için McCormack vd. (2015) tarafından farklı genotiplerin Tm teşvikli ER stresine hassasiyetinin belirlenmesi amacıyla geliştirilen bitki büyütme ve stres uygulama yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntemde bitkiler 12 gözlü plakada (12 well plate) %0.6 sukroz ve içeren 1/2 kuvvet sıvı Murashige ve Skoog (MS) ortamında yetiştirilmektedir (ortam içeriği için bkz Murashige ve Skoog, 1962 ve Gamborg vd., 1968). Sıvı MS ortamı kullanılmasının amacı ER stresi uygulaması sırasında bitkilere Tm’ nin eşit miktarda dağılması ve katı MS ortamı kullanımından doğan bitkilerin ortamdan ortama taşınması sırasındaki mekanik (yaralanma) etkinin azaltılmasıdır. 12 gözlü plakada her göze otoklavlanmış 4 ml %0.6 sukroz içeren sıvı MS ortamı (1/2 kuvvet) konulmuş ve her göze 15 tohum olacak şekilde sterilize ve strafiye edilmiş A. thaliana tohumları eklenmiştir. Bitkiler çimlendikten sonra (A. thaliana çimlenmesi 2 gün sürmektedir) 5 gün boyunca 150 µmol m−2 s−1 ışık şiddeti (12 saat aydınlık/12 saat karanlık), 22 ◦C sıcaklık ve %60 bağıl neme sahip bitki büyütme odasında yetiştirilmiştir. Denemelerde 5 günlük bitkiler kullanılmıştır. Şekil 2
‘de laboratuvarımızda bu yöntemle yetiştirilmiş 5 günlük (çimlenmeden sonra) A. thaliana bitkilerinin fotoğrafı verilmiştir.
Şekil 2. 12’lik plakalarda sıvı MS ortamında yetiştirilen 5 günlük A. thaliana bitkileri ER stresi uygulamaları, McCormack vd. (2015) belirlediği Tm konsantrasyonları ve sürelerde yapılmıştır. ER stresi orta ve yüksek seviyede olmak üzere 0.15 µg/ml ve 0.3 µg/ml Tm kullanılarak iki farklı konsantrasyonda uygulanmıştır. Uygulama süresi 3 gündür.
Uygulama, 5 günlük bitkileri içeren plakalardaki her gözdeki MS ortamı, uygulanacak kimyasalları içeren MS ortamı ile değiştirilerek gerçekleştirilmiştir. PARilasyon’un engellenmesi için Zhang vd. (2015)’e göre 0.75 mM 3-aminobenzamid (3AB) kullanılmıştır.
Eğer bitkilere ER stresi sonrasında iyileştirme (recovery) yapılacaksa bitkiler hiçbir kimyasal içermeyen MS ortamında 3 gün daha büyütülmüştür. Amaca göre uygulama ve iyileştirme sonrasında bitki örnekleri sıvı azotta dondurularak -80 ◦C’de analizlere kadar muhafaza edilmiştir.
13
Yukarıdaki yöntemler kullanılarak amaç bölümünde belirtilen analizler için kurulan deneme desenleri aşağıda Şekil 3 ve Şekil 4’te verilmiştir.
Şekil 3. Amaç 1,2,3 için kullanılan deneme deseni
Şekil 4. Amaç 4 için kullanılan deneme deseni
14 3.2 Bitki yaş ağırlığı ve kuru ağırlığı ölçümleri
Stres uygulamalarını takiben, hasat edilen günlerde her bir gruptan alınan en az 5 bitkinin kök ve gövde ağırlıkları ölçülmüştür. Ayrıca bu bitkilerin kuru ağırlıkları 70oC’de 72 saat etüvde bekletildikten sonra kaydedilmiştir.
3.3 Klorofil miktarının ölçümü
Klorofil miktarı Porra vd. (1989)’a göre belirlenmiştir. 50 mg yaprak örneği 5 ml %80 aseton ile havan ve tokmak yardımıyla homojenize edilmiştir. Homojenatlar 15 ml’lik tüpe aktarılmış, daha sonra homojenizasyon sırasında uçan aseton her tüp için tekrar 5 ml’ye tamamlanmıştır. Bunun ardından tüpler 5000 g de 5 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatantların absorbansları spektrofotometrede (Shimadzu UV-1700) 1 ml’lik küvetlerde 750, 663.6 ve 646.6 nm dalga boylarında ölçülmüştür. Elde edilen absorbanslar aşağıdaki formüllere yerleştirilerek klorofil miktarları hesaplanmıştır.
Chla = 12.25*A(663.6-750) - 2.55*A(646.6-750) Chlb = 20.31*A(646.6-750) - 4.91*A(663.6-750) Chla + b = 17.76*A(646.6-750) + 7.34*A(663.6-750)
3.4 Western Blot analizleri
Western blot için kullanılacak proteinler RIPA tamponu (150 mM NaCl, %0.1 Triton X- 100, %0.5 sodyum deoksikolat, %0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 mM sodyum ortovanadat, 1 mM NaF) ile ekstrakte edilmiştir. Örnekler ilk olarak sıvı azotta havan ve tokmak yardımıyla toz haline getirilmiştir. Bunun ardından 0.1 g örneğe 0.5 ml olacak şekilde RIPA tamponu eklenmiş ve örnekler homojenize edilmiştir. Ekstraksiyon aşamasındaki tüm işlemler 4 ◦C’ de gerçekleştirilmiştir. Homojenizasyonun ardından örnekler 15000 g’de 4 ◦C’
de 10 dk santrifüj edilmiş ve sonraki aşamalarda elde edilen süpernatant kullanılmıştır. Elde edilen protein ekstraktlarının protein miktarları Bradford (1976)’a göre bovin serum albümin (BSA) ile hazırlanmış standart kullanılarak belirlenmiştir.
Western blot analizleri için örnekler %10 SDS-PAGE jelinde ayrılmıştır. Elektroforez için Mini Protean Tetra Cell (Bio-Rad) mini elektroforez kullanılmıştır. Her kuyucuğa eşit miktarda (20 µg) protein yüklenmiştir. Elektroforezin ardından elde edilen jellerdeki proteinler Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) ile Bio-Rad tarafından tedarik edilen PVDF membranlara transfer edilmiştir. Transferin ardından membranlar %3 BSA ile 2 saat boyunca bloklanmıştır. Bloklama işlemi ardından membranlar projede araştırılması planlanan anti- PAR antikoru (Abcam, ab14459) ile muamele edilmiştir. Bunun ardından membranlar primer antiokra özgü horse radish peroxidase (HRP) ile konjuge edilmiş ikincil antikorla muamele edilmiştir. Membranlar, diaminobenzidin (DAB) substrat solüsyonu (%0.05 DAB, %0.015 H2O2, 10 mM PBS pH 7.2) ile muamele edilerek sekonder antikorların bulunduğu bölgelerde
15
boyamanın oluşması sağlanmıştır. Membranlar Vilber-Lourmat jel görüntüleme cihazında görüntülenerek PAR ile modifiye edilmiş protein miktarları densitometrik olarak hesaplanmıştır.
3.5 Gen ifadelerinin ölçümü:
Gen ifadelerinin belirlenmesi için kantitatif RT-PCR kullanılmıştır. Total RNA izolasyonu RNeasy Plant Kiti (Qiagen) ile yapılmıştır. Total RNA izolasyonu ardından elde edilen RNA ile Protoscript II Reverse Transcriptase cDNA sentez kiti (New England Biolabs) ve oligo(dT) primerler kullanılarak cDNA sentezlenmiştir. Her iki basamak üreticilerin talimatlarına göre gerçekleştirilmiştir. Deneme gruplarından elde edilen cDNA' lar kullanılarak ifadesi incelenecek genlere spesifik primerler kullanılarak PCR reaksiyonları hazırlanmıştır.
Bu PCR' lar ABI StepOne Plus Real-time PCR cihazı ile ABI SYBR Green Master Mix kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu PCR basamağının yanında aynı cDNA taslakları kullanılarak stresle birlikte ifadesi değişmeyen ACTIN8 (ACT8) genine spesifik primerlerle de PCR yapılmıştır. Böylelikle elde edilen gen ifadeleri ACT8 ifadesine göre normalize edilmiştir.
Elde edilen veriler StepOne Plus relative quantification software (ABI) kullanılarak
“comparative Ct” yöntemine göre değerlendirilmiş ve gen ifadeleri bağıl olarak belirlenmiştir.
Diğer bir deyişle, kontrol grupları 1 kabul edilmiş ve gen ifadeleri uygulama gruplarında bunun katları olarak verilmiştir. Çalışmada ifadesi incelenen genler için kullanılan primerler Tablo 2’de verilmiştir. UPR ile ilgili genler için primerler daha önceki yayınlarımızdan alınmıştır (Ozgur vd.,2014; Ozgur vd., 2015). PARP1,2 ve 3’ün primerleri Boltz vd.
(2014)’ten, PARG1 ve 2’nin ise Zhang vd. (2015)’den alınmıştır.
Tablo 2. Çalışmada qRT-PCR ile ifadesi incelnen genler, gen numaraları ve primer listesi
16 3.6 bZIP60 splays miktarının ölçülmesi
bZIP60 (AT1G42990) splays miktarı Mishiba vd. (2013)’e göre belirlenmiştir. Bu yöntemde bZIP60’ın splays edilmiş ve edilmemiş formları kantitatif RT-PCR ile aynı gen için iki farklı primer seti kullanılarak ölçülmektedir. Bu primerler splaylanmamış form için
bZIP60u-F 5’-AGTCTGCTGTGCTCTTGTTGG-3’ , bZIP60u-R 5’-
GCAACACTTTGTGTGGGACATA-3’ ve splayslanmış form için ise bZIP60s-F 5’- AAGCAGGAGTCTGCTGTTGG-3’ , bZIP60s-R 5’-TTTGTGTGGGACATATAAGGGAAT-3’
olarak verilebilir.
3.7 İstatistiksel analizler
Her deneme 3 kez tekrar edilmiştir. Elde edilen veriler one-way ANOVA analiziyle değerlendirilmiş ve uygulama gruplarının istatistiksel olarak birbirine olan farkını ölçmek için TUKEY post-test uygulanmıştır. Bu karşılaştırma sonucu P < 0.05 değerine sahip gruplar birbirinden istatistiksel olarak farklı olarak değerlendirilmiştir. İstatistiksel analizler GraphPad yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
4. BULGULAR
4.1 Bitki büyüme parametreleri
5 günlük bitkilere 3 gün boyunca 0.15 µg/ml ve 0.3 µg/ml Tm teşvikli ER stresi uygulanması bitkilerin yaş ağırlıklarını önemli derecede düşürmüştür (Şekil 5). Bu düşüşler 0.15T ve 0.3T grupları için sırasıyla %23 ve %29 olarak belirlenmiştir. Sadece 3AB uygulaması yaş ağırlıkta bir değişime neden olmazken, 3AB ve Tm beraber uygulanan 3AB+0,15T ve 3AB+0,3T gruplarında sırasıyla %36 ve %38 düşüşler gözlenmiştir. Bitki kuru ağırlıklarında da yaş ağırlıklara benzer olarak 0.15T, 0.3T, 3AB+0,15T ve 3AB+0,3T gruplarında sırasıyla %23, %31, %36 ve %39 oranında düşüşler gözlenmiştir (Şekil 6).
Sadece 3AB uygulaması kuru ağırlıkta değişime neden olmamıştır.
17
Şekil 5. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3-aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde yaş ağırlık (mg)
Şekil 6. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde kuru ağırlık
parg1-2 ve parg2-1 mutantlarının Tm teşvikli ER stresine verdikleri yanıtlar yabani tip ile karşılaştırıldığında bu genotiplerin büyümelerinin stres ile daha olumsuz etkilendiği görülmektedir (Şekil 7). Kontrol koşulları altında ise karşılaştırılan üç genotip arasında farklılık gözlenmemiştir. 0.15 µg/ml Tm uygulaması ile yabani tip, parg1-2 ve parg2-1 genotiplerinde yaş ağırlık sırasıyla %23, %29 ve %36 düşmüştür. 0.3 µg/ml Tm uygulaması ile ise %29, %33 ve %37 düşüş gözlenmiştir. Bahsi geçen üç genotipin kuru ağırlıkları da benzer oranlarda düşüş göstermiştir (Şekil 8).
18
Şekil 7. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde yaş ağırlık (mg) (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm )
Şekil 8. 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde kuru ağırlık (mg) (K: Kontrol, P12: parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm )
Stresin iyileştirilmesi (recovery) safhasında stres sonrası yapılan ölçümlerle neredeyse aynı ilişkiler korunmuştur ancak özellikle parg2-1 ile yabani tip arasındaki büyüme farkı 0.3 µg/ml Tm uygulanan gruplarda açılmıştır (Şekil 9, Şekil 10). Üç günlük iyileşme periyodunun sonunda daha önce 0.15 µg/ml Tm uygulaması yapılan yabani tip, parg1-2 ve parg2-1 genotiplerinde yaş ağırlık yabani tipin kontrolüne göre göre sırasıyla %22, %27 ve
%31 düşmüştür. 0.3 µg/ml Tm uygulaması ardından iyileşme yapılan bitkilerde ise %27, %37 ve %44 düşüş gözlenmiştir.
19
Şekil 9. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde yaş ağırlık (mg) (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12:
parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm)
Şekil 10. İyileşme (recovery) sonrası 0.15 µg/ml Tm ve 0.3 µg/ml Tm uygulanan Col.(yaban tip), parg1-2 ve parg2-1 bitkilerinde kuru ağırlık (mg) (R: iyileşme-recovery, K: Kontrol, P12:
parg1-2, P21: parg2-1, 0.15T: 0.15 µg/ ml Tm, 0.3T: 0.3 µg/ml Tm ) 4.2 Klorofil içerikleri
0.15 µg/ml Tm uygulaması ile klorofil a içeriği kontrole göre %45, 0.3 µg/ml Tm uygulaması ile ise %63 oranında azalmıştır (Şekil 11). 3AB uygulaması ile klorofil a içeriği
%10 artış göstermiştir fakat bu değer istatistiksel olarak anlamlı bulunmamamıştır. 3AB+0.15
20
µg/ml Tm uygulaması ile ise klorofil a içeriğinde %50 oranında, 3AB+0.3 µg/ml Tm uygulaması ile ise kontrole göre %63.5 oranında düşüş belirlenmiştir.
Şekil 11. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde klorofil a (mg-1 YA) içeriği
0.15 µg/ml Tm uygulaması ile klorofil b içeriği kontrole göre %12 azalmıştır (Şekil 12).
0.3 µg/ml Tm uygulaması ile ise klorofil b içeriği %37 oranında azalmıştır. 3 AB uygulaması ile ise klorofil b içeriği %16 oranında artış göstermiştir. 3AB+0.15µg/ml Tm uygulaması ile klorofil b içeriğinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim belirlenmezken, 3AB+0.3 µg/ml Tm uygulaması ile klorofil b içeriği %36 oranında azalmıştır.
Şekil 12. 0.15 µg/ml Tm (0.15T), 0.3 µg/ml Tm (0.3T), 0.75 mM 3 aminobenzidine (3AB), 3AB+0.15T ve 3AB+0.3T uygulanmış bitkilerde klorofil b (mg-1 YA) içeriği
