Dr Beyza Ener Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi 2015-Bursa

Dr Beyza Ener

Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi 2015-Bursa

İnvazif Fungal Enfeksiyonlar

• Aspergillus türleri

• Candida türleri

• Candida dışı maya mantarları

• Aspergillus dışı küf mantarları

Cryptococcus neoformans Trichosporon türleri

Malassezia türleri Geotrichum candidum Magnusiomyces capitatus

Saprochaete clavata

Mucorales takımı Fusarium türleri

Pseudallesheria/Scedosporium

Antifungal Tedavi Başarısızlığı

• Pek çok nedenleri var

• Antifungal Direnç

– Intrensek (primer) direnç

– Kazanılmış (sekonder) direnç

• Mikrobiyolojik direnç

• Klinik direnç

In Vitro Antifungal Duyarlılık Testleri

Referans yöntemler

• CLSI yöntemleri

 CLSI M27-A3

 CLSI M38-A2

 CLSI M44-A2

 CLSI M51-A

Suplementler (M27-S4; M44-S3; M51-S1)

• EUCAST yöntemleri

 EUCAST E. Dis 7.2

 EUCAST E. Dis 9.1

WWW.eucast.org/antifungal suseptibility testing afst/rational documents for antifungals

• Alman referans yöntemi

 DIN-58940-84

Onaylı ve valide ticari sistemler

• Sensititre Yeast One

(TREK Diagnostic Systems, Inc., Cleveland, OH)

• Agar Gradiyent Yöntemi

– Etest

(AB Biodisk, Solna, Sweden)

– Etest

(bioMerieux, Inc., Marcy l’ Etoile, France)

– Liofilchem MIC Test Strips

(Via Scozia, Zona Industriale Italy)

• Vitek 2

(bioMerieux, Inc., Marcy l’ Etoile, France)

Antifungal Direnç

Mikrobiyolojik Direnç – Klinik Direnç

• Mikrobiyolojik direnç

Wild-type: Direnç gelişimi olmamış suş

Non-wild type: Direnç gelişimi olan suş

Epidemiyolojik eşik değerlerle belirlenir.

o İdeal olanı 1000 suşluk veri olmasıdır

o Modal dağılıma bakılır ve modal MİK’den iki dilüsyon yüksek MİK değeri

o Suşların %95-99’unu kapsayan MİK değeri

• Klinik direnç

Bir suşun, antifungal ajanın güvenilir kullanım dozunda ulaştığı serum ve doku düzeyinden daha yüksek MİK değerine sahip olması

Flukonazol: ≤2mg/L; S >4 mg/L;R

Sistemik Etkili Antifungal Ajanlar

Skualen epoksidaz 14-α-demetilaz

Β-1,3 glukan sentaz

Primer Antifungal Direnç

• Amfotericin B

– Aspergillus terreus

– Pseudoallescheria boydii, Scedosporium apiospermum, S. prolificans – Trichosporon asahii, T. mucoides

– Candida lusitaniae, C. krusei, C. glabrata ?

• Flukonazol

– Çoğu küf mantarları – C. krusei

– C. glabrata

• Vorikonazole

– Mucorales takımı

• Ekinokandinler

– Aspergillus dışı çoğu küf mantarları – Candida dışı çoğu mayalar

Kazanılmış Direnç

1. İlaçların hücre içine penetrasyonunun azalması

2. Hedef enzimdeki değişimler

a. Hedef enzim genlerinin aşırı ekspresyonu b. Hedef enzim genlerinde nokta mutasyonlar

3. Effluks pompası genlerinin aşırı ekspresyonu

Amfoterisin B – Kazanılmış Direnç

Çok uzun yıllar (50 yıldan fazla) monoterapide olarak

kullanılmasına rağmen direnç gelişimi çok az

Özellikle küflerde

Hücre zarında ergestrol miktarının azalması ve diğer sterollerin birikmesi Maya mantarlarında

Erg2, Erg3, Erg11, Erg24

AmB’ye direnç geliştiren suşların virülansı düşük

Benjamin Matteson Vincent etal. PLOS BIOLOGY 2013

Ekinokandin Direnci

Mantar Hücre Duvarı

• Yaşam için kesinlikle gerekli

• Katmanlardan oluşmuş

– Dış kısmı: Glikoprotein

– İç kısmı: Polisakkarit moleküleri (glukan ve kitin)

• Hücre duvarı sentezi dinamik bir süreç (Konfigürasyonu değişmekte)

– Maya-hif formu – Stres cevabı

Kazanılmış Direnç

1. İlaçların hücre içine penetrasyonunun azalması

2. Hedef enzimdeki değişimler

a. Hedef enzim genlerinin aşırı ekspresyonu

b. Hedef enzim genlerinde nokta mutasyonlar

3. Effluks pompası genlerinin aşırı ekspresyonu

Hücre duvar

konfigürasyonunun değişimi Eagle etkisi – Paradoksal etki

1,3-β-D Glukan Sentaz Enzim Kompleksi

• En az iki alt kısım

– Fks proteini – Rho1 proteini

• Fks proteini

– FKS1 – FKS2 – FKS3

• UDP-glikoz molekülünden glukozun (1,3)-β-D glikozil iskeletine eklenmesine

FKS1 ve FKS2 geninde nokta mutasyonu

• C. albicans, C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. krusei, C.

guilliermondii, Aspergillus türleri

• FKS1 geninde nokta mutasyonu iki farklı bölgede (hotspot=HS) olabilmekte

– FKS1 HS1: 641-649 aa – FKS1 HS2: 1345-1365 aa

• Ser 645 Phe veya Thy veya Pro ile değişimi

• C. glabrata’da hem FKS1 hem de FKS2 genindeki mutasyon önemli

– FKS1: D632E, D632G, D632Y – FKS2: F659V, F659S, F659del

Kitin Konsantrasyonunun Artması ile Gelişen Direnç

Hücre duvarı sinyal ağının aktivasyonu kitin sentezini aktive ediyor

• PKC

• HOG

• Ca⁺⁺/calcineurin

Azol Direnci

Azollerin Etki Mekanizması

Candida Türleri-Azol Direnci

• ERG11 geninde nokta mutasyonu

• ERG11 geninin aşırı ekspresyonu

• Dışa atım genlerinin aşırı çalışması

– MDR genleri – CDR genleri

• C. albicans (MDR1, CDR1, CDR2), C. glabrata (CgCDR1, CgCDR2) ve C. dubliniensis (CdMDR1, CdCDR1)

• By-pass yollar (ERG3 genleri ile ilişkili)

MacCallum DM, Coste A, Ischer F, et al. Genetic dissection of azole resistance mechanisms in Candida albicans and their validation in a mouse model of disseminated infection.

Antimicrob Agents Chemother. 2010;54:1476-1483.

Aspergillus fumigatus’da Azol Direnci İlacın Hedef Bölgesindeki Değişimler

14-α-demetilaz enzimini kodlayan gen cyp51 Cyp51A

Cyp51B %63 homolog

Aspergillus fumigatus’da Kazanılmış Direnç

• 1997 yıllında ilk kez itrakonazol direnci ile karşılaşılıyor

• Denning DW, Venkateswarlu K, Oakley KL, et al.

Antimicrob Agents Chemother 1997; 41:1364-8.

• Denning DW, Radford SA, Oakley KL, Hall L, Johnson EM, Warnock DW. J Antimicrob Chemother 1997;

40:401–14.

• Oakley KL, Morrissey G, Denning DW. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41:1504-7.

Cyp51A Nokta Mutasyonu

Değişen kodonlar

Minimal İnhibitör Konsantrasyon (µg/ml)

İtrakonazol Vorikonazol Pasokonazol G54E >8 0,25-0,5 0,25-1

G54R >8 0,12-0,5 1

G54V >8 0,25-1 Belirlenmedi G54W >8 0,12-0,5 >8

G138C >8 4->8 1->8

P216L >8 1 1

M220I >8 1 0,5

M220K >8 1-2 1->8

M220R >8 2 2

M220T >8 0,5-1 0,25-0,5

M220V >8 1-2 0,5-1

Y431C >8 4 1

G432S >8 0,5 0,25

G434C >8 4 1

G448S >8 >8 0,5-1

Nokta mutasyonlar

 Azol grubu ilaçlarla uzun süre

devam eden tedavi veya proflaksi

 Hasta kökenli gelişmekte

• Hollanda’da multiazol dirençli (MAR) izolatlar

– 12/13 hasta cyp51A geninde TR34/L98H – >2002

– Hem daha önce azol kullanmayan; kullanan hastalar

– Tek bir kolondan kaynaklanmadığı

A. fumigatus /Multi-Azol Direnci

Verweij P E et al. Multiple-triazole-resistant

aspergillosis. N Engl J Med.2007; 356:1481-1483.

A.

• Hollanda’da özellikle vorikonazole dirençli izolatlar

• TR46/Y121F/T289A

• >2009 sonra görüldüğü

Linden JWM, et al. Aspergillosis due to Voriconazole Highly Resistant Aspergillus fumigatus and Recovery of Genetically Related Resistant Isolates From

Domiciles. Clinical Infectious Diseases 2013;57(4):513–20

A. fumigatus / Voriconazole

Direnci

Cyp51A Geninin Promotor Bölgesi Tandem Repeat (TR)

WT CAGAGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAAAGTTGCCTAATTA

TR34 CAGAGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAAT GAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAAT GAAAGTTGCCTAATTA

TR46 CAGAGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAAAGTTG TCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAAAGTTG CCTAATTA

TR46 CAGAGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAA AGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAA AGTTGCCTAATTA

TR53 CAGAGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAAAGTTGCCTAA TGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAAAGTTGCCTAATTA

TR34/L98H TR46/Y121F/T289A

Kazanılmış Direnç

• Çevresel maruziyet

 Demetilaz inhibitörleri (DMI) azol grubu

fungisitlerin kullanılmasına

Multiazol direnç oranı

%5-12,5

Snelders E, Veld HRA, Rijs AJ, Kema GH, Melchers WJ, Verweij PE. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Appl Environ Microbiol 2009; 75:4053-7.

Mantar Hücresi

Zirai fungisitler Medikal antifungal ajanlar

Ergesterol sentez inhibitörleri

Mitokondri üzerinden etkili

Çekirdek üzerinden etkili

Cyt P450; cyp51 Azoller

Cyt P450; cyp51 Azoller

Ergestrol ile etkileşenler Amfoterisin B

Glukan sentezini inhibe edenler

Ekinokandinler

Ziraat-Antifungal Ajanlar

• Mantarlar esas olarak fitopatojendir

• Ürünün %10-30 kadarının mantar

enfeksiyonu nedeniyle kaybedilmesi sıktır

• Özellikle nemli ve ılık/sıcak mevsimlerde etkileri çok artar

• Tarım / Bahçecilik /Çiçekçilik

sektöründe antifungal çok kullanılır

Stensvold CR, et al. Curr Fungal Infect Rep 2012; 6:178-91

Ziraat-Azol

• İlk azol 1973

– Triademefon – İmazalil

• 1980’den sonra kullanımı hızla artmış

– Propikonazol – Bromukonazol – Epoksikonazol – Difenokonazole – Tebukonazole

Stensvold CR, et al. Curr Fungal Infect Rep 2012; 6:178-91

Ülkemizde Azol Direnci

Kullanılan Suşlar

Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı stoklarında bulunan (1999-2012)

«Aspergillus fumigatus kompleks» suşları

Çalışma Aşamaları

• Canlandırma

– İki kez Saborauds’ dekstroz agara (SDA) pasajlanarak canlanmaları sağlandı (37^oC’da 48-72 saat)

• «A. fumigatus Kompleksindeki» Diğer Suşlardan Ayırım

– «A. fumigatus kompleksindeki» A. fumigatus dışındaki türleri ayırmak için, dirençli olan suşların tamamı 50^oC’da inkübe edildi. Bu derecede üreyen suşlar A. fumigatus olarak değerlendirildi

• Direnç Tarama

– Canlandırılan ve saflığından emin olunan suşlar 4 µg/ml itrakonazol içeren SDA’a pasajlandı ve 48 saat inkübe edildi. Bu ortamda üreyen suşlar dirençli kabul edilerek ayrıldı

• Kontrol Suşlar

– Kontrol olarak Dr Paul Verweij’den temin edilen bir dirençli ve bir duyarlı suş her tarama grubuna eklendi

• Değerlendirme

– Dirençli suşlara CLSI M38-A2 dökümanına göre in-vitro antifungal duyarlılık testleri çalışıldı

SDAx2

50°C ETÜV

4µ/ml İTZ SDA

DUYARLILIK TEST PCR

DİZİ ANALİZİ

Dirençli Suşlardan DNA Analizi

DNA ekstraksiyonu spin kolon

prensibiyle çalışan ticari bir kitle (Gene Matrix Plant&Fungi; EURx Ltd,

Gdansk/Polonya) yapıldı

GAGAGACTTTGACACAGTCCGCGACAGAGGCCTCCCCCCTATAAGTCGAGTGCAGGACTG GCTGATCAAACTATGCTCATGCACTGTCTTCTCCTACATAACAGAATACTGGGCAGCGGG CTGGAGATACTATGGCTTTCATATGTTGCTCAGCGGCAGCATTCTGAAACACGTGCGTAG CAAGGGAGAAGGAAAGAAGCACTCTGAATAATTTACACTGTTCTCCTCTAGAAAAAACTC ATGAGTGAATAATCGCAGCACCACTCCAGAGTTGTCTAGAATCACGCGGTCCGGATGTGT GCTGAGCCGAATGAAAGTTGCCTAATTACTAAGGTGTAGTTCCAGCATACCATACACCCT AACTCATACTACGGTAGGTAGATCTACTTACCTATGAACCTATATTGGTAGGTAGGTGAA TATAAAATACAGCATGGAACATGTTTTTCATTAGCTGGTCTCTCATTCGTCCTTGTCCTA GGCCTTAAGGAATCCAGTATATGAAATAATCCCTCTTATCCATTTTCCTCTTATTCTTTT TCATTTCCCTCATCACTGCAACTCTAATCCTCGGGCTCACCCTCCCTGTGTCTCCTCGAA ATGGTGCCGATGCTATGGCTTACGGCCTACATGGCCGTTGCGGTGCTGACGGCAATCTTG CTCAATGTTGTTTATCAATTATTCTTTCGGCTTTGGAACCGAACAGAACCGCCAATGGTC TTTCATTGGGTCCCATATCTGGGTAGTACCATCAGTTACGGGATTGATCCCTACAAGTTC TTCTTTGCGTGCAGAGAAAAGGCAAGTTTCAAGATTGTAGTTTGACATTCATTCCTGGGC GCATTGCTGAGTATTGCTTTCTTAACTGGCAGTATGGCGATATCTTCACTTTTATACTGT TGGGTCAAAAAACCACAGTCTACCTGGGCGTTCAGGGAAACGAGTTTATTCTCAACGGCA AGCTCAAGGATGTCAATGCGGAAGAGGTCTATAGTCCATTGACGACCCCCGTTTTCGGAT CGGACGTGGTGTATGATTGTCCCAATTCCAAGCTGATGGAGCAGAAAAAGTTCATCAAGT ACGGCTTGACTCAGTCTGCGTTAGAGTCTCATGTGCCACTTATTGAGAAGGAGGTTTTGG ACTATCTGCGCGATTCACCGAACTTTCAAGGCTCGTCCGGCCGGGTGGACATCTCTGCGG CAATGGCTGAGATTACCATTTTTACCGCTGCTCGAGCCCTCCAAGGCCAGGAAGTTCGTT CCAAACTCACGGCTGAGTTCGCTGACCTCTATCATGACCTGGACAAGGGCTTTACTCCCA TCAATTTTATGCTACCGTGGGCCCCATTGCCGCATAACAAGAAGCGAGATGCTGCTCATG CGCGCATGAGGTCAATCTACGTTGACATCATCACTCAGCGCCGTCTTGACGGTGAGAAGG ACTCTCAGAAATCAGACATGATATGGAACCTGATGAACTGCACATACAAAAACGGCCAGC AAGTGCCTGATAAAGAGATTGCGCACATGATGATAACCCTGTTGATGGCTGGTCAGCATT CGTCTTCGTCCATCAGCGCCTGGATTATGCTGAGACTGGCCTCACAGCCAAAAGTCCTCG AAGAGCTGTATCAGGAACAGCTGGCCAATCTTGGCCCCGCCGGGCCAGACGGCAGTCTTC CTCCGCTCCAGTACAAGGATCTTGACAAACTTCCCTTCCATCAACATGTTATTCGTGAAA CCTTGCGGATTCACTCCTCTATTCACTCTATCATGCGCAAGGTGAAAAGCCCCTTGCCCG TTCCCGGGACCCCTTACATGATTCCTCCCGGTCGCGTGCTCCTTGCTTCACCTGGAGTGA CAGCCCTCAGCGACGAACACTTCCCCAATGCTGGGTGCTGGGATCCCCATCGCTGGGAGA ACCAGGCTACTAAGGAGCAGGAGAACGACAAGGTTGTCGACTACGGTTACGGCGCCGTCT CCAAGGGCACGTCAAGTCCCTATCTTCCGTTTGGTGCTGGCCGACACCGCTGCATCGGCG AGAAATTCGCTTATGTCAACCTTGGTGTGATTCTGGCGACCATTGTGCGCCACCTGCGAC TTTTCAACGTGGATGGAAAGAAAGGAGTCCCTGAAACTGACTATTCATCCCTCTTTTCGG GCCCCATGAAGCCAAGCATCATCGGCTGGGAGAAGCGGTCGAAAAACACATCCAAGTGAG ACTGTTGTAACCATCGAGGACTTCAAAGGATTTGGTGTGATCGGAATAGGTGTATTATAC

(ekzon 1548, intron 71

“base-pair” [bp])

Accession number:

AFUA_4G06890

Primerler

PCR ve Dizi Analizi

• Klasik PCR protokolü

• Ethidyum-bromid jel elektroforez

• Heterodubleks analizi (HDA) (yalnız promotor bölge için)

• PCR ürünlerinin saflaştırılması (CP: Omega Bio- Tek, Norcross GA/ABD)

• DNA dizi analizi (Beckman Coulter CEQ8000XL)

• Dizilerdeki mutasyonları saptamak için web tabanlı bir program ile (Bioedit Sequence alignment editor) “ClustalW Analiz” yapıldı

• 1999-2012 yılları

• 746 suş tarandı (419 hastaya ait)

• 76 suşta (%10,2) ITZ dirençli

• 62 hastada (%14,8) direnç

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Hasta sayısı Suş sayısı

Dirençli hasta yüzdesi Dirençli suş yüzdesi

MİK aralığı (µg/ml)

MİK₅₀ (µg/ml)

MİK₉₀ (µg/ml) İtrakonazol >16 >16 >16

Vorikonazol 2-8 8 8

Posokonazol 0,064-4 2 4

Amfoterisin B 0,5-2 0,5 1

Promotor Bölge Elektroforezi

Promotor Bölge ClusterW Analizi

TR34/L98H mutasyonu

Azol dirençli suşlarımızın %86,8’inde (66/76) tarımda kullanılan azol fungisitlerin neden olduğu TR34/L98H mutasyonu tespit edildi.

Tebukonazol (Ziraai Fungisit)

TR34/L98H mutasyonu olan 66 suşun

tebukonozol MİK değerleri biri hariç >16 µg/ml olarak bulundu. Bir suşun MİK değeri ise yine

yüksek olup, 4µg/ml olarak saptandı

SONUÇ

• TR34/L98H mutasyonu bölgemizde (ülkemizde) bulunmakta

• 2000 yılından sonra görülme olasılığı yüksek

First Determination of Azol Resistance in Aspergillus fumigatus Strains Carrying the TR₃₄/L98H Mutations in Turkey

Ece Özmerdiven¹, Seçil Ak², Beyza Ener¹, Harun Ağca¹, Burcu Dalyan Cilo¹, Berrin Tunca², Halis Akalın³

Uludağ University, Faculty of Medicine Department of Medical

Microbiology¹, Department of Medical Biology², Department of Clinical Microbiology and Infectious Diseases³

 ICCAC 2014 On-line Abstract (POM008)

 Journal of Infection and Chemotherapy 2015 (Basıma kabul edildi)

SONUÇ

• Amfoterisin B’de kazanılmış direnç çok az

• Ekinokandinler

– FKS1 ve FKS2 genlerinde nokta mutasyonu – Eagle etkisi

• Azoller – Candida türleri

– ERG11 geninde nokta mutasyonu

– MDR (Flukonazol) ve CDR (multi-azol) genlerinin aşırı ekspresyonu

• Azoller – Aspergillus fumigatus

– CYP51A geninde nokta mutasyonu – TR34/L98H