TRAKYA BÖLGESİ DOĞAL FLORASINDA BULUNAN FRAGARİA CİNSİNE BAĞLI TÜRLERİN TESPİTİ, MOLEKÜLER VE MORFOLOJİK KARAKTERİZASYONLARININ YAPILMASI

(1)

NKUBAP.00.24.AR.14.16 nolu proje TRAKYA BÖLGESİ DOĞAL FLORASINDA BULUNAN FRAGARİA CİNSİNE BAĞLI TÜRLERİN

TESPİTİ, MOLEKÜLER VE MORFOLOJİK KARAKTERİZASYONLARININ YAPILMASI

Yürütücü: Yrd. Doç. Dr. A. Zafer MAKARACI Araştırmacılar: Araş. Gör. Fatma Seren SAĞIR

Araş. Gör. Nihan ŞAHİN 2017

(2)

i ÖNSÖZ

“Trakya Bölgesi Doğal Florasında bulunan Fragaria cinsine bağlı türlerin tespiti, Moleküler ve Morfolojik Karakterizasyonlarının Yapılması” adlı proje NKUBAP.00.24.AR.16 no ile Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından (NKÜBAP) desteklenmiştir. Trakya bölgesinde bulunan biyo-çeşitliliğin tespitine katkı yapmak amacıyla çilek meyvesini içinde bulunduran Fragaria cinsine ait türler Trakya kapsamında tespit edilmiştir. Elde edilen bulgular ile gelecekte çilek ıslah çalışmaları, çilek çeşitlerinin geliştirilmesi adına pratikte yararlı olacaktır. Ayrıca Trakya bölgesindeki bitkisel biyo-çeşitliliğin korunmasınada etki edecektir.

(3)

ii İÇİNDEKİLER

TABLO VE ŞEKİLLER DİZİNİ……….iii

ÖZET……….. v

ABSTRACT……… v

GİRİŞ……….. 1

GEREÇ VE YÖNTEM……….. 4

BULGULAR VE TARTIŞMA……… 29

SONUÇ………... 44

KAYNAKLAR……… 45

(4)

iii TABLO VE ŞEKİL LİSTELERİ

Tablolar Sayfa

Tablo 1. Örneklerin alındığı lokasyonlar (İl ve ilçe) ve bu

lokasyonların koordinatları. 5

Tablo 2. Alınan örneklerin ait türler 23

Tablo 3. Stok kimyasallar 26

Tablo 4. Seçilen 6 belirtece ait primer bilgileri 27 Tablo 5. Morfolojik gözlemlere ait temel istatistikler. 31 Tablo 6. Morfolojik gözlemlere ait temel istatistikler (Devamı). 31 Tablo 7. Temel bileşenler analizi sonucunda açıklanan toplam varyans. 34 Tablo 8. On dört morfolojik karakter için temel bileşen katkıları. 34

Tablo 9. DNA miktarları. 38

Tablo 10. Temel bileşenler analizi sonucunda açıklanan toplam varyans. 40 Tablo 11. Beş belirteç için temel bileşen katkıları. 40 Şekiller

Şekil 1. Alınan örnekleri harita üzerindeki lokasyonlar 4

Şekil 2. Örnek 1 7

Şekil 7.Örnek 6 10

(5)

iv

Şekil 32. Fragaria viridis 24

Şekil 33. Fragaria sterilis 24

Şekil 34. Fragaria vesca 25

Şekil 35. Morfolojik gözlemlere ait frekans grafikleri (a: 1. yaprakçık boyu;

b: 1. yaprakçık eni; c: 2. yaprakçık boyu; d: 2. yaprakçık eni; e:

3. yaprakçık boyu; f: 3. yaprakçık eni) 32

Şekil 36. Morfolojik gözlemlere ait frekans grafikleri (Devamı) (g: 1. Yaprakçık diş sayısı;h: 2. yaprakçık diş sayısı; i: 3. yaprakçık diş sayısı; j:

1. Yaprakçık damar sayısı; k: 2. yaprakçık damar sayısı; l:

3. yaprakçık damar sayısı). 33

Şekil 37. On dört karaktere ait faktör haritası. 35 Şekil 38. Toplanan genotiplerin iki temel bileşene göre faktör haritası. 36 Şekil 39. On dört karakter için hiyerarşik kümeleme dendogramı. 37

Şekil 40. Örneklere ait DNA ekstraktları. 38

Şekil 41. PCR sonrası jel görüntüleri ((a): EMFv8 primeri ile G1-G26 arası genotiplerin amplifikasyonları; (b): EMFv10 primeri ile G1-G26 arası

genotiplerin amplifikasyonları) 39

Şekil 42. GelAnaylzer 2010a ekran görüntüsü. 39

Şekil 43. On bir allele ait faktör haritası. 41

Şekil 44. Toplanan genotiplerin iki temel bileşene göre faktör haritası. 42 Şekil 45. Beş belirteç için hiyerarşik kümeleme dendogramı. 43

(6)

v ÖZET

Bu proje, Trakya doğal florasına adapte olmuş ve varlığını sürdüren Fragaria cinsine ait türlerin, ileride yapılabilecek ıslah çalışmalarında, bu türlerin var olduğu düşünülen çeşitli biyotik ve abiyotik stresler karşısında dayanıklılık genlerinin taranması, tespiti ve kullanılabilmesi açısından kaynaklık etmesi için tespiti, morfolojik ve moleküler karakterizasyonlarının yapılması ile Trakya bölgesi doğal florasında bulunan Fragaria popülasyonün tespit edilmesi amacıyla yapılmıştır.

Tarama sonucunda Kırklareli ilinin Merkez, Demirköy, Kofçaz, Pınarhisar ve Vize ilçelerinden, Edirne’nin Keşan ilçesinden, Tekirdağ ilinin Saray ve Süleymanpaşa ilçelerinden örnekler alınmıştır. Alınan örneklerin morfolojik ve moleküler karakterizasyonları yapılmıştır.

Morfolojik değerlendirme sonucunda Trakya bölgesinde üç farklı Fragaria türü tespit edilmiştir.Bunlar Fragaria vesca, Fragaria sterilis (Potentilla sterilis) ve Fragaria viridis’dir. Yine SSR belirteçler kullanılarak bu türler arasında molekülar karakterizasyon yapılmaya çalışılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Fragaria vesca, Fragaria sterilis, Fragaria viridis, SSR belirteç, Trakya

ABSTRACT

This research Project was conducted in order to determine Fragaria species in Turkey’s Thrace region by using morphological and molecular methods. Such species can be used in breeding studies against biotic and abiotic stresses if they have resistance genes.

In survey studies, Fragaria samples were collected from Kırklareli Central, Demirköy, Kofçaz, Pınarhisar, Vize, Süleymanpaşa, Saray, Keşan districts. Molecular and morphological characterizations were performed. According to the morphological studies, three different species were found in Thrace region. Those were Fragaria vesca, Fragaria sterilis (Potentilla sterilis) and Fragaria viridis. Some molecular characterization was also performed by using SSR markers.

Keyword: Fragaria vesca, Fragaria sterilis, Fragaria viridis, SSR marker, Thrace

(7)

1 1. GİRİŞ

Rosales takımı, Rosaceae familyası, Fragaria cinsi içerisinde yer alan çilek türleri, yaklaşık 2000 yıldan beri insanoğlu tarafından yetiştirilmektedir. Ticari olarak yetiştirilen Fragaria ×ananassa ise 250 yıllık bir geçmişe sahiptir (Hancock, 1999).

Oldukça geniş bir coğrafyada doğal olarak bulunan çilek, yetiştiği coğrafyanın çeşitliliği kadar tür zenginliğine de sahiptir. Genelde ılıman iklim bölgelerinde, nemli, çayırlık ve ormanlık alanlarda doğal yapının parçası olarak bulunmaktadır. Ancak soğuk olan daha kuzey bölgelerde, hatta Sibirya gibi alanlarda da yabani çilek türleri bulunmaktadır.

Ülkemiz F. vesca ve F. viridis’in doğal yaşama alanı içinde yer almaktadır.

Ülkemizin hemen hemen tüm bölgelerinde, melez bir tür olan Fragaria ×ananassa yetiştiriciliği yapılmaktadır. F. vesca türüne ait bazı yerel çeşitlerin F. vesca özellikle nemli ve ormanlık alanlarda doğal bitki örtüsüyle birlikte 200-2450 m yüksekliklerde bulunmaktadır.

Dünya’da en yaygın olan Fragaria türü Fragaria vesca’dır. Avrupa, Kuzey Asya, Kuzey Amerika ve Kuzey Afrika’da yayılmıştır. F. vesca diploit bir tür olup kromozom sayısı 2n=2x=14’tür. Ancak melez bir tür olan Fragaria ×ananassa, meyve özellikleri nedeniyle, yeryüzünde en fazla yetiştiriciliği yapılan türdür.

Kültür çileği olan Fragaria ×ananassa, iki Amerikan yerli türünün melezlemesi sonucu elde edilmiştir. Güney Amerika Fragaria chiloensis ve Kuzey Amerika Fragaria virginia’nın bir melezidir (Sangiacomo ve Sullivan, 1994). Fragaria ×ananassa, iki oktoploid Güney Amerika Fragaria chiloensis ve Kuzey Amerika Fragaria virginia’nın tesadüf melezlemesi ile 1700 yılında ortaya çıkmıştır (Hummer ve Hancock, 2009).

Şans eseri melezleme sonucunda nispeten iri meyve boyutlu F. chiloensis ile sert ve verimli F. virginiana meyveleri görülmüştür. Kuzey Amerika’dan 19 yüzyılın ortalarında Fragaria ×ananassa Duch klonları ile Avrupa'ya getirilmiştir. Bu kıtadaki melezleme çalışmaları bu dönemden itibaren hızlı bir şekilde artış göstermiştir. 1930 yıllına kadar ıslahçılar tarafından yapılan tür içi melezlemeler ve Avrupa materyalleri ile yabancı türlerin melezlenmesini içeren birçok çalışmayı içermektedir.

Charles Hovey ‘Hovey’ adındaki ilk çeşidi kuzey Amerika’da Avrupa çeşitleri ile seçilmiş doğal F. virginiana’nın melezlenmesi sonucu elde etmiştir.

Yüzyılın ortasında, toplu ıslah programları yapılmaya başlanmıştır. Bunlardan en ünlüsü George Darrow’un 1920 yılında USDA ‘de kariyeri ile başlamıştır. Birçok ıslah çalışmasında kullanılan bitkiler bu gen kaynağından elde edilmiştir. Özellikle Chandler ve Camarosa çeşitleri hızlı bir şekilde dünyaya yayılmıştır.

Son yıllarda, pazarlama avantajları sağlayan tescilli çeşitlerin büyük şirketler tarafından önem kazanmasından dolayı özel ıslah programları tekrar canlanmaktadır.

Bu ıslah çalışmalarında kullanılan ebeveynlerin bulunması ve korunması, bilim insanlarını çeşitli çilek türlerini keşfetmeye yönlendirmiştir. Bu nedenle gen kaynaklarının ortaya konması ve korunması konusu daha da önem kazanmıştır.

Dünya çapında, büyük çoğunluğu Kuzey Amerika ve Avrupa’da olmak üzere 40’ın üzerinde melezleme programı vardır. Ayrıca Asya, Avustralya ve Güney

(8)

2

Amerikada’da da aktif ıslah programları vardır. Bu programların her birinde eşsiz F. × ananassa’nın genotipleri, bazı programlarda ayrıca F. virginiana, F. chiloensis ve Fragaria spp. ‘nin eşsiz genotipleri de bulunmaktadır.

Toplanan bu özel ve toplu koleksiyonlarda, ekonomik öneme sahip meyve büyüklüğü, aroma, tekstür ve önemli biyotik ve abiyotik bozukluklara dayanıklılık gibi bitkisel özellikler vardır. Doğal klonal germplasm deposunda (NCGR) ‘supercore’

olarak toplanan 38 elit tür klonu temel alt türlerden ve doğal bölgelerden toplanmıştır.

Bu oluşum hastalıklara dayanıklılık özelliklerini, gün nötrlüğünün birden fazla kaynağını, (sadece F. virginiana ) iri meyve boyutu (F. chiloensis) kış soğukları, kuraklık stresi, sıcağa tolerans ve birçok melezleme ile ilgili diğer özellikler gibi kaynakları içerir.

Çilek ıslahçıları yüksek ürün elde etme amaçlarının yanında son zamanlarda ıslah edilen çeşitlerin bazı subtropik ve kısa gün koşullarına adapte olmasını da hedeflemektedir. Gelişen dünyada sürdürülebilir tarım üzerine çilek ıslahçılarının şu anki çeşitler içerisine hastalık ve zararlılara dayanıklılığı da katlamaları vurgulanmaktadır. Fakat binlerce hastalık etmeninden hangisinin çalışmaya değer olduğuna karar vermeleri gerekmektedir. Bu kararı; yetiştiricilik yapılacak bölgedeki yaygın olarak görülen hastalık zararlılar, bu patojenler için patojenik ırk çeşitliliği, kültürel yöntemlerle hastalık zararlılara karşı etkinlik, dayanıklı genotiplerin belirlenmesi için izlenen metodun uygunluğu ve dayanıklılık özelliğiyle ilgili genetik çeşitlilik gibi birkaç faktör etkilemektedir. Bu nedenle de uygun ekolojiye adapte olmuş türler belirlenerek gen kaynağı olarak ortaya konulmalıdır.

Ekonomik rekabetin acımasız olduğu koşulları karşısında, ülkeler sahip oldukları varlıkları en ince ayrıntısına kadar araştırmakta ve bu kaynakları ülke ekonomisine artı değer olarak kazandırmanın yollarını araştırmaktadırlar. Türkiye'nin sahip olduğu biyolojik çeşitlilik ve gen kaynakları varlığının incelenmesi de bu bakımdan önemlidir.

Uzun yıllar tür içi ve türler arası biyoçeşitliliğin belirlenmesinde kriter olarak bitkilerin sadece morfolojik özelliklerden yararlanılmasına rağmen, günümüzde bu amaçla dünyada ve ülkemizde çoğunlukla moleküler genetiğin imkanları kullanılmaktadır.

Morfolojik özelliklerin çevre ve iklim faktörlerinden kolayca etkilenmesi nedeniyle yanıltıcı sonuçların çıkma ihtimaline karşılık moleküler belirleyicilerinin çevreden etkilenmeyişleri, bitkinin gelişme devrelerinin her aşamasında aynı sonuçları vermeleri, geniş bir varyasyon göstermeleri ve daha güvenilir bilgi verebilmeleri bu tekniklerin son yıllarda daha yaygın kullanımına olanak vermektedir.

Son yıllarda genetik kaynakların önemlerinin anlaşılmasıyla, bitki materyallerinin toplanmaları, karakterize edilmeleri, korunmaları ve sonucunda ıslah programlarında değerlendirmeleri çalışmaları hızla artmaktadır.

Ülkemizde çilek üzerine yapılan ilk karakterizasyon çalışmaları Dokuzoğuz (1963), Kaşka ve Paydaş (1993) ve Kaşka ve ark. (1990) tarafından başlatılmıştır. Yine ülkemizde moleküler kararkterizasyonun yapıldığı ilk çalışma

Serçe ve ark. (2007) Türkiye’deki tüm bölgelerden topladıkları örneklerin SSR ve RAPD sistemleri ile moleküler karakterizasyonlarını gerçekleştirmişler ve toplanan örnekler ile ülkemizdeki ilk çekirdek koleksiyonu oluşturmuşlardır.

(9)

3

Günaydın (2008) CAPS ve SSR markırları kullanarak bazı çilek çeşit ve genotiplerinde moleküler karakterizasyon gerçekleştirmiştir. Çalışma yerli ve yabancı orjinli toplam 34 genotip üzerine gerçekleştirilmiştir. Çalışmada 17 adet CAPS primer enzim kombinasyonu ve 12 adet SSR primer çifti kullanılmış, CAPS primer-enzim kombinasyonlarının 52’si polimorfik, toplam 60 adet bant ürettiğini tespit etmişlerdir.

Kullanılan SSR primer çiftlerinden ise 145’i polimorfik olan toplam 150 adet allel elde etmişlerdir. CAPS tekniğinde genetik benzerlik katsayısı 0.56–0.95 arasında değiştiği, SSR tekniğinde elde edilen sonuçlara göre, genetik benzerlik katsayısı 0.55-0.94 arasında değiştiği bildirilmiştir.CAPS ve SSR verilerinin birlikte analiz edilmesi sonucunda ise, genetik benzerlik katsayısı 0.59-0.91 arasında değişim göstermiştir.

Sonuç olarak, çilek çeşit ve genotiplerinin karakterizasyonunda, SSR yöntemi CAPS tekniğine göre polimorfizm oranı (PO) ve polimorfizm bilgi içeriği (PBİ) bakımından daha üstün olduğu bildirilmiştir.

Amerika Birleşik Devletlerinde son 30 yılda, yirminin üzerinde araştırıcı tarafından, Kuzey ve Güney Amerika’ya düzenlenen gezilerle toplanan F. chiloensis ve F.

virginiana türlerinden oluşan 2000’den fazla genotipi içeren çilek gen kaynakları, Oregon eyaletindeki Corvallis şehrinde bulunan Ulusal Klonal Gen Kaynakları Merkezi’nde korunmaktadır (Hummer 1991).

Avrupa’da ise Fragaria genetik kaynaklarının toplanması konusundaki çalışmalar 1992-1993 yıllarında, 16 ülkeden 24 kuruluşun katılımıyla başlatılmıştır (Roudeillac ve Boxus 1997). İlk olarak 900 civarındaki eski ve yeni çeşit incelenip değerlendirilmiş ve aralarından 112 çeşit korumaya değer bulunmuştur. Bunun sonrasında çalışmalar, Finlandiya’dan Türkiye’ye 19 ülkeden araştırmacıların katılımıyla oluşan “COST Action 836” çatısı altında yürütülmüştür (Navatel ve Kruger 2004). Araştırmalar sonucunda oluşturulan 20 koleksiyonda, 2747 çilek çeşidi ve 418 yabani çilek genotipi incelenmiş ve değerlendirilmiştir. Eski çeşitlerin arasından 108 önemli eski çeşitten oluşan bir çekirdek koleksiyon oluşturulmuştur (Geibel 2002; 2004).

Davis ve ark. (2006), F. ×ananassa genomik kütüphanesinden elde ettikleri 23 SSR markırının, Fragaria türleri arasında geçişini incelemişler ve bu markırların F.vesca türüne ait bağlantı haritasına eklenebileceğini bildirmişlerdir.

Yoon ve ark. (2012), 18 SSR markırı kullanarak kültürü yapılan 59 çilek üzerinde çalışmışlar, bu çeşitlerin genetik çeşitliliğini ve popülasyon strüktürlerini belirlemişlerdir. Çalışma sonucunda her lokusta ortalama 5,6 allel ve 21’i spesifik olmak üzere 101 allel kaydetmişlerdir.

Her ne kadar 2007 yılında Türkiye’ de TÜBİTAK TOVAG 103O121 (Serçe ve ark 2007) kapsamında bir araştırma yürütülmüş olsa bile bu proje sonuçları her bir bölgenin daha kapsamlı bir şekil de incelenmesi gerektiğini ortaya koymuştur. Bu amaçla bu araştırmada Trakya bölgesi Fragaria türleri ayrıntılı olarak incelenmiştir.

(10)

4 3. GEREÇ ve YÖNTEM

Trakya bölgesinde Fragaria cinsine ait türlerin yetişebileceği yerler bu araştırma esnasında taramaya tabi tutulmuş ve bu amaçla Kırklareli, Tekirdağ ve Edirne illerinde bu cinse ait bitkilerin yetişebileceği potansiyel alanlarda tarama faaliyetleri gerçekleştirilmiştir.

Tarama sonucunda Kırklareli ilinin Merkez, Demirköy, Kofçaz, Pınarhisar ve Vize ilçelerinden, Edirne’nin Keşan ilçesinden, Tekirdağ ilinin Saray ve Süleymanpaşa ilçelerinden örnekler alınmıştır.

Örnekler ufak bir kürek vasıtasıyla yerlerinden sökülmüş ve hemen 2,5 litre hacmindeki torf dolu plastik saksılara aktarılmışlardır. Alınan örnekler Namık Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Laboratuvarlarında morfolojik gözlemlere tabi tutulmuş, aynı zamanda DNA izolasyonu için ihtiyaç üzerine gerekli taze yaprak elde edilmiştir.

Şekil 1. Alınan örnekleri harita üzerindeki lokasyonları

(11)

5

Tablo 1. Örneklerin alındığı lokasyonlar (İl ve ilçe) ve bu lokasyonların koordinatları. Koordinatlar derece, ondalık biçiminde verilmiştir.

1.Örnek (Kırklareli, Pınarhisar) K 41°.752.12 D27°.666.38 2. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.776.08

D 27°.699.55 3. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.807.82 D 27°.739.01 4. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.874.58 D27°.815.47 5. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.864.43

D 27°.933.51 6. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.830.90 D 27°.712.97 7. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.826.33 D 27°.678.03 8. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.841.06 D 27°.660.00 9. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.856.11 D 27°.654.47 10. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.853.49 D 27°.636.49 11. Örnek(Kırklareli, Demirköy) K 41°.869.92 D 27°.619.73 12. Örnek (Kırklareli, Kofçaz) K 41°.909.57 D 27°.178.53 13. Örnek (Kırklareli, Kofçaz) K 41°.948.59 D 27°.149.85 14. Örnek (Kırklareli, Kofçaz) K 41°.967.38 D 27°.155.81 15. Örnek Kırklareli, Kofçaz) K 41°.970.17 D 27°.209.44 16. Örnek (Kırklareli, Kofçaz) K 41°.979.08 D 27°.241.28 17. Örnek (Kırklareli, Kofçaz) K 41°.988.63 D 27°.261.70 18. Örnek (Kırklareli, Kofçaz) K 41°.982.66 D 27°.295.97 19. Örnek (Kırklareli, Merkez) K 41°.952.12 D 27°.297.81 20. Örnek (Kırklareli, Merkez) K 41°.937.54 D 27°.327.42 21. Örnek (Kırklareli, Merkez) K 41°.968.70 D 27°.419.14 22. Örnek (Kırklareli, Demirköy) K 41°.972.60 D 27°.936.57

(12)

6

23. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.589.39 D 27°.817.03 24. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.603.51 D 27°.841.55 25. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.651.04 D 27°.883.47 26. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.656.62 D 27°.918.82 27. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.655.53 D 27°.973.69 28. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.653.69 D 27°.988.25 29. Örnek (Kırklareli, Vize) K 41°.594.59 D 28°.082.63 30. Örnek (Tekirdağ, Saray) K 41°.570.29 D 28°.078.30 31. Örnek (Tekirdağ, Saray) K 41°.513.88 D 28°.010.04 32. Örnek (Tekirdağ, Merkez) K 40°.844.03 D 27°.378.41 33. Örnek (Tekirdağ, Merkez) K 40°.840.08 D 27°.383.30 34. Örnek (Edirne, Keşan) K 40°.750.15 D 26°.715.43

(13)

7 3.2. Morfolojik Gözlemler

Her bir lokasyondan alınan örneklere ait yaprak resimleri aşağıda verilmiştir. Sekiz, on, yirmidört ve yirmialtı nolu örnekler fitoftora yada külleme hastalığı yüzünden öldükleri için fotoğrafları sunulmamıştır.

Şekil 2. Örnek 1

(14)

8 Şekil 3. Örnek 2

Şekil 4. Örnek 3

(15)

Şekil 6. Örnek 5

(16)

Şekil 8. Örnek 7

(17)

Şekil 10. Örnek 11

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

Şekil 28.Örnek 31

(27)

Şekil 30.Örnek 33

(28)

Yapılan morfolojik gözlemler sonucunda alınan örneklerin üç farklı Fragaria cinsine ait olduğu tespit edilmiştir. Tespit edilen türler Fragaria vesca, Fragaria sterilis ve Fragaria viridis’dir.

Fragaria sterilis aynı zamanda Potentilla cinsi altında “Potentilla sterilis” olarak adlandırılmaktadır. Her iki tür sistematikçiler tarafından “basionym veya homotipik sinonim olarak” olarak kabul edilmektedir (Anonim, 2017. www.eu-nomen.eu).

Fragaria sterilis ve Fragaria vesca ayrımı yapılırken göz önüne alınan kriterlerin başında iki husus bulunmaktadır. Bunlardan en önemlisi Fragaria sterilis kol oluşturmamaktadır (Şekil 33), oysaki Fragaria vesca uzun gün şartlarında kol oluşturmaktadır (Şekil 34). Diğer bir kriter ise Fragaria sterilis çiçeklerinde anterler çiçeğin içine doğru bakma eğilimde olup, polen kesesi tüp şeklindedir. Ayrıca polenlerin dağılımı kısıtlı olup, polenler polen keselerine yapışık durumdadır. Fragaria vesca’da ise polenlerin dağılımı ile ilgili bir sorun bulunmamaktadır. Yapraklar anatomileri bakarak Fragaria sterilis ve Fragaria vesca’yı bir birinde ayırmak imkansız görülmektedir.

Araştırma sonucunda yaprak morfolojine bakarak 16. örneğin Fragaria viridis olduğu düşünülmektedir (Şekil 32). Ancak Fragaria viridis’i Fragaria vesca’dan kesin olarak ayırt edebilmek için fosfoglikoz izomeras izoenzim analizi yapılması gerekmektedir (Arulsekar 1981).

(29)

23 Tablo 2. Alınan örneklerin ait türler

Örnek No Tespit Edilen Tür

1 F. sterilis

2 F. vesca

3 F. sterilis

4 F. sterilis

5 F. sterilis

6 F. sterilis

7 F. sterilis

8 -

9 F. sterilis

10 -

11 F. sterilis

12 F. sterilis

13 F. vesca

14 F. sterilis

15 F. vesca

16 F. viridis

17 F. sterilis

18 F. sterilis

19 F. sterilis

20 F. sterilis

21 F. sterilis

22 F. vesca

23 F. vesca

24 -

25 F. sterilis

26 -

27 F. sterilis

28 F. vesca

29 F. sterilis

30 F. sterilis

31 F. sterilis

32 F. sterilis

33 F. sterilis

34 F. vesca

(30)

24 Şekil 32. Fragaria viridis

Şekil 33. Fragaria sterilis

(31)

25 Şekil 34. Fragaria vesca

(32)

26 3. DNA İzolasyonlarının Yapılması

Tablo 3. Stok kimyasallar

Kimyasal Adı İçeriği

Ekstaksiyon Tamponu (EB) Stok  0,35 M Sorbitol

 0,1 M Tris HCl

 Na-EDTA pH 8,0

 %2 PVP

 %0,1 DIECA

Lysis Tamponu  %2 CTAB

 200Mm Tris HCl

 50Mm Na EDTA

 2M NaCl

 %2 PVP

 %0.1 DIECA

Sarkosyl Stok  %5 N-Lauroylsarcosine sodium salt Kloroform: Oktanol karışımı (CO)  Chloroform:Octanol 24:1 (v:v)

CTAB Stok  %10 (w/v) CTAB

NaAc Stok  3 M NaAc

Ethanol  %96 (v/v)

 %70 (v/v)

2-propanol  %100 2-propanol

TE  1M Tris-Cl

 0.5M EDTA pH 8.0

Protokolün basamakları şu şekildedir;

• Örnekler üzerine sıvı azot konularak ezildi ve toz haline getirildi.

• 2 ml’lik tüplere konulan yaklaşık 0,5 g örnekler üzerine 0,75 ml Ekstraksiyon tamponu (EB Stok:Lysis Tamponu Stok:Sodiumbisulfite:Sarkosyl (25:25:0,1:10)) eklenerek 10 saniye kadar yüksek devirde vortekslendi.

• Parçalanan örnekler yarım saat boyunca 56°-65°C’de su banyosuna kondu ve 10 dakikalık aralıklarla karıştırıldı.

• Örnekler, inkübasyon işlemi bittikten sonra oda sıcaklığına gelene kadar beklendi, daha sonra üzerine 1000 µl CO eklenip nazikçe karıştırıldı.

• 16000g/ 20°-23°C / 10 dakika santrifüj edildi.

• Santrifüj sonrası tüpte oluşan 3 fazdan en üstte bulunan, DNA’yı içeren sulu faz alınıp yeni 2ml’lik tüplere aktarıldı.

• Örneklerin üzerine 0,75 ml %70 Ethanol ve 3M NaAc eklendi ve hafifçe karıştırıldı.

• DNA bu çözeltinin içinde 1 gece -20°C’de bırakıldı, DNA’nın çökelmesi sağlandı.

• Ertesi gün örnekler 16000g /5 dk spin edildi. DNA’nın pellet halinde tüpün dibine yapışması sağlandı.

(33)

27

• Tüpler boşaltıldı ve tamamen kuruduktan sonra örnekler üzerine 100µl TE eklendi. TE içindeki örnekler 1 gece 4°C’de bırakılıp, ertesi gün daha sonra kullanılmak üzere -20°C’ye kaldırıldı.

3.4. SSR Belirteçlerinin Seçimi

Moleküler karakterizasyon için kullanılacak belirteçler James ve ark. (2003) tarafından bildirilen 10 SSR belirteci içerisinden seçilmiştir. Bunlar arasından en yüksek ürün büyüklük aralığı gösteren 6 tanesi tercih edilmiş ve çalışmada kullanılmıştır.

Belirteçlerle ilgili bilgiler Tablo 4’de gösterilmiştir.

Tablo 4. Seçilen 6 belirtece ait primer bilgileri.

Primer Adı Foward Reverse Ürün Büyüklük

Aralığı

EMFv2 TGCGTGCATACACGCTCTGTG CGCTGGTGAGAGGAGGTGCTAG 194–278

EMFv3 CTCTGATTCTTCTTCGTCCACCAT TCCCCAGAGAATTAAACAGTCGTA 235–261

EMFv4 TTGCCAATTCATATAGGACATGAA GGCGCAATGGCAGTCTCT 267–311

EMFv6 CGCCGTTTGAGATTGCCCTGAA CAAATTGCCACCCCTAGAGAAAAG 228–290

EMFv8 TGACCCGATACAAGACAAAAACCG CACTCATGTCGGTAGCCATTCTC 192–206

EMFv10 AGCCTCAACAACAGCCTCAGAACAAACCTC CGCTCCCACCGCCCTCCATT 243–252

3.5. PCR İşlemleri

PCR işlemleri için kullanılan reaksiyon karışımı şu şekildedir;

 Örnek DNA (50ng) 1µl

 dNTP mix (10mM) 1,5 µl

 10X Standard Taq Reaction Buffer (MgCl2 Free) 2 µl

 MgCl2 (25mM) 1,5 µl

 Taq Polimeraz 0,5 µl

 Foward Primer 1 µl

 Reverse Primer 1 µl

 ddH2O 12 µl

PCR koşulları 94⁰C’de 5 dakika ilk denatürasyon, sonrasında 38 döngü olacak şekilde 94⁰C’de 30 saniye, primerler için belirtilen spesifik bağlanma sıcaklıklarında (James ve ark., 2003) 45 saniye ve 72⁰C’de 50 saniye, son olarak yine 72⁰C’de 10 dakika son uzatma yapılacak şekilde ayarlanmıştır. DNA amplifikasyonları yukarda verilen koşullarda Thermal Cycler kullanılarak yapılmıştır.

Jellerde görülen 35. ve 36. Örnekler (Şekil 41) F.anannassa’dan alınan DNA’lara aittir. Burada örneklerin genomlarını F.anannassa ile de kıyaslanması hedeflenmiştir.

3.6. Elektroforez İşlemleri

Elektroforez işlemleri %10 μl/ml (v/v) etidyum bromit ile boyanmış %2’lik agaroz jellerde 130 Voltta 35 dakika yürütüldükten sonra UV jel görüntüleme sistemi ile görüntülenmiştir. Görüntüsü alınan jellerde GelAnaylzer 2010a kullanılarak bant

(34)

28

büyüklükleri belirlenmiş, daha sonra bu büyüklüklerden faydalanılarak skor tabloları oluşturulmuştur.

3.7. İstatistik Analizler Kümeleme (Cluster) Analizi

Kümeleme analizi Ward metodu (en küçük varyans) ile R istatistik programı (3.3.2 Sincere Pumpkin Patch) kullanılarak yapılmıştır.

Kümeleme analizi için verilerin hazırlığında kullanılan kod aşağıdaki gibidir.

>mydata <- na.omit(mydata)

>mydata <- scale(mydata)

>wss <- (nrow(mydata)-1)*sum(apply(mydata,2,var))

>for (i in 2:15) wss[i] <- sum(kmeans(mydata, centers=i)$withinss)

>plot(1:15, wss, type="b", xlab="Number of Clusters", ylab="Within groups sum of squares")

>fit <- kmeans(mydata, 5) # 5 cluster solution

>aggregate(mydata,by=list(fit$cluster),FUN=mean)

>mydata <- data.frame(mydata, fit$cluster)

Toplanan tüm veriler öncelikle Ward metoduna göre önyüklenmiş p değerleri ile hiyerarşik kümeleme analizi (Ward Hierarchical Clustering with Bootstrapped p values) yapılmıştır.

>library(pvclust)

>fit <- pvclust(mydata, method.hclust="ward.D2", method.dist="euclidean")

>plot(fit)

>pvrect(fit, alpha=.95)

Temel Bileşenler Analizi

Temel bileşenler analizi (PCA) R istatistik programında FactoMiner kütüphanesi kullanılarak yapılmıştır (Husson ve ark. 2010).

PCA için kullanılan kod şu şekildedir;

>library(FactoMiner)

>res.pca<-PCA(mydata)

(35)

29 4. BULGULAR ve TARTIŞMA

4.1. Morfolojik Karakterizasyon Temel İstatistikler

Morfolojik karakterlere ait temel istatistikler Tablo 5’de gösterilmiştir. Genotiplerin karakterlere göre frekansları ise Şekil 35 ve Şekil 36’de görüldüğü gibidir.

Morfolojik gözlemler sonucunda genotiplerde 1. yaprakçıkta;

 Yaprakçık boyu 2,40 ile 6,20 cm arasında değişmiştir. Genotiplerin %29,8’i 2,40 ile 3,50 cm arasında, %60’ı 3,60 ile 4,50 cm arasında, %9,9’u 4,70 ile 6,20 cm arasında değişim göstermiştir (Şekil 35).

 Yaprakçık eni 1,50 ile 3,70 cm arasında değişim göstermiştir. Genotiplerin

%36,6’sı 1,50 ile 2,40 cm arasında, %26,7’si 2,60 ile 3 cm arasında, %36,7’si ise 3,10 ile 3,70 cm arasında değişmiştir (Şekil 35)

 Yaprakçık diş sayısı 13 ile 22 arasında değişmiştir. Genotiplerin %30’unun 14- 16 arasında, %53,3’ünün 17-19 arasında, %16,6’sının 21-23 arasında dişe sahip olduğu gözlenmiştir (Şekil 36).

 Yaprakçıktaki damar sayısı 5-9 arasında değişmiştir. Genotiplerin %20’sinin 5- 6 arasında, %50’sinin 5-6 arasında, %30’unun ise 8-9 damara sahip olduğu gözlenmiştir (Şekil 36).

2. yaprakçıkta;

 Yaprakçık boyu 2,40 ile 4,80 cm arasında değişmiştir. Genotiplerin %26’sı 2,40- 2,80 cm arasında, %26,6’sı 3,00-3,40 cm arasında, %33,4’ü 3,60-3,90 cm arasında, %13,3’ü ise 4,10-4,80 cm arasında değişmiştir (Şekil 35).

 Yaprakçık eni 1,50 ile 3,80 cm arasında değişmiştir. Genotiplerin %16,7’si 1,50- 1,80 cm arasında, %40’ı 2,00-2,40 cm arasında, %26,6’sı 2,50-2,80 cm arasında ve %16,7’si 3,00-3,80 cm arasında değişim göstermiştir (Şekil 35).

 Yaprakçık diş sayısı 13 ile 22 arasında değişmiştir. Genotiplerin %33,3’ünün 13-15 arasında dişe, %53,4’ünün 16-19 arasında dişe ve %13,3’ünün 20-22 arasında dişe sahip olduğu görülmüştür (Şekil 36).

 Yaprakçık damar sayısı 4 ile 9 arasında değişim göstermiştir. Genotiplerin

%10’unun 4-5 damara, %53,3’ünün 6-7 damara ve %36,7’sinin 8-9 damara sahip olduğu gözlenmiştir (Şekil 36).

3. yaprakçıkta;

 Yaprakçık boyu 2,00 ile 5,20 cm arasında değişim göstermiştir. Genotiplerin

%26,7’si 2,00-2,60 cm arasında, %26,6’sı 2,70-3,00 cm arasında, %30’unun 3,10-3,50 cm arasında, %16,7’sinin 4,00-5,20 cm arasında değişim gösterdiği gözlenmiştir (Şekil 35).

 Yaprakçık eni 1,20 ile 3,60 cm arasında değişim göstermiştir. Genotiplerin

%13,3’ünün 1,20-1,60 cm arasında, %36,7’sinin 1,90-2,20 cm arasında,

%33,3’ünün 2,30-2,60 cm arasında ve %16,7’sinin 2,70-3,60 arasında değişim gösterdiği gözlenmiştir (Şekil 35).

 Yaprakçık diş sayısı 12 ile 21 arasında değişmiştir. Genotiplerin %23,3’ünün 12-14 arasında dişe, %43,4’ünün 15-17 arasında dişe, %33,3’ünün 18-21 arasında dişe sahip olduğu görülmüştür (Şekil 36).

(36)

30

 Yaprakçık damar sayısı 5 ile 10 arasında değişmiştir. Genotiplerin

%36,7’sının 5-6 damara, %56,6’sının 7-8 damara, %6,7’sinin 9-10 damara sahip olduğu görülmüştür (Şekil .. l).

Genotiplerin %23,3’ünde diş eni 4,00 ile 4,67 cm arasında, %53,4’ünde 5,00 ile 6,00 cm arasında, %23,3’ünde 6,33 ile 7,33 cm arasında değişmiştir. İncelenen genotiplerin

%50’sinde diş boyu 2,00-2,67 cm arasında, %40’ında 3,00-4,00 cm arasında ve

%10’unda 4,67-5,67 cm arasında değişim göstermiştir.

(37)

31 Tablo 5. Morfolojik gözlemlere ait temel istatistikler.

1. Yaprakçık Boyu

1. Yaprakçık Eni

2. Yaprakçık Boyu

2. Yaprakçık Eni

3. Yaprakçık Boyu

3. Yaprakçık Eni

Valid 30 30 30 30 30 30

Mean 3,8567 2,7233 3,4367 2,4200 3,1233 2,2467

Median 3,9000 2,8000 3,4000 2,4000 3,0000 2,2500

Mode 4,20 2,00 3,80 2,00^a 2,50^a 2,30

Std. Deviation 0,75780 0,61346 0,61335 0,58274 0,77890 0,51107

Variance 0,574 0,376 0,376 0,340 ,607 ,261

Range 3,80 2,20 2,40 2,30 3,20 2,40

Minimum 2,40 1,50 2,40 1,50 2,00 1,20

Maximum 6,20 3,70 4,80 3,80 5,20 3,60

Tablo 6. Morfolojik gözlemlere ait temel istatistikler (Devamı).

1.

Yaprakçık Diş Sayısı

1.

Yaprakçık Damar

Sayısı

1.

Yaprakçık Damar

Sayısı

1.

Yaprakçık Damar

Sayısı

Diş Eni Diş Boyu

Valid 30 30 30 30 30 30 30 30

Mean 17,6000 16,8333 16,4333 7,2333 7,0000 6,8000 5,5889 3,0556

Median 17,5000 16,0000 16,0000 7,0000 7,0000 7,0000 5,6667 2,8333

Mode 17,00â 15,00 16,00 7,00 7,00â 7,00â 6,00 2,67â

Std. Deviation 2,38675 2,32057 2,22344 1,04000 1,17444 1,15669 ,89135 ,88011

Variance 5,697 5,385 4,944 1,082 1,379 1,338 ,795 ,775

Range 9,00 9,00 9,00 4,00 5,00 5,00 3,33 3,67

Minimum 14,00 13,00 12,00 5,00 4,00 5,00 4,00 2,00

Maximum 23,00 22,00 21,00 9,00 9,00 10,00 7,33 5,67

(38)

32

a b

c d

e f

Şekil 35. Morfolojik gözlemlere ait frekans grafikleri (a: 1. yaprakçık boyu; b: 1.

yaprakçık eni; c: 2. yaprakçık boyu; d: 2. yaprakçık eni; e: 3. yaprakçık boyu; f: 3.

yaprakçık eni)

(39)

33

g h

i j

k l

Şekil 36. Morfolojik gözlemlere ait frekans grafikleri (Devamı) (g: 1. yaprakçık diş sayısı; h: 2. yaprakçık diş sayısı; i: 3. yaprakçık diş sayısı; j: 1. yaprakçık damar sayısı;

k: 2. yaprakçık damar sayısı; l: 3. yaprakçık damar sayısı).

(40)

34

Kümeleme (Cluster) ve Temel Bileşenler (PCA) Analizleri

On dört farklı morfolojik gözlem için yapılan PCA analizi sonucunda dört önemli bileşenin ortaya çıktığı (eigen değeri > 1) ve toplam varyasyonun %74,613’ünün açıklandığı görülmüştür (Tablo 7).

Tablo 7. Temel bileşenler analizi sonucunda açıklanan toplam varyans.

Total Variance Explained Component Initial Eigenvalues

Total % of Variance Cumulative %

1 4,339 30,995 30,995

2 2,848 20,341 51,335

3 1,933 13,810 65,145

4 1,328 9,485 74,631

5 0,821 5,862 80,492

6 0,563 4,019 84,511

7 0,495 3,533 88,044

8 0,418 2,988 91,032

9 0,360 2,573 93,606

10 0,285 2,035 95,641

11 0,242 1,731 97,372

12 0,185 1,324 98,696

13 0,119 0,853 99,549

14 0,063 0,451 100,000

Tablo 8. On dört morfolojik karakter için temel bileşen katkıları.

Rotated Component Matrix^a

Component

1 2 3 4

1. Yaprakçık Boyu 0,800 0,142 -0,080 0,231

1. Yaprakçık Eni 0,744 -0,431 -0,013 0,088

2. Yaprakçık Boyu 0,796 -0,196 -0,052 -0,028

2. Yaprakçık Eni 0,608 -0,417 0,255 -0,037

3. Yaprakçık Boyu 0,812 0,017 0,114 0,133

3. Yaprakçık Eni 0,697 0,080 0,390 -0,014

1. Yaprakçık Diş Sayısı -0,014 0,931 -0,187 -0,061 2. Yaprakçık Diş Sayısı -0,017 0,858 0,148 -0,167 3. Yaprakçık Diş Sayısı -0,197 0,875 0,203 -0,003 1. Yaprakçık Damar Sayısı -0,002 0,249 0,772 -0,046 2. Yaprakçık Damar Sayısı 0,345 -0,060 0,771 -0,086 3. Yaprakçık Damar Sayısı -0,042 -0,071 0,880 0,010

Diş Eni 0,353 -0,026 0,078 0,826

Diş Boyu -0,059 -0,172 -0,163 0,886

Extraction Method: Principal Component Analysis.

Rotation Method: Varimax with Kaiser Normalization.^a a. Rotation converged in 5 iterations.

(41)

35

On dört morfolojik karakter içerisinde birinci bileşende en yüksek etkinliği gösteren 3. yaprakçık boyu karakteri, ikinci bileşende en yüksek etkinliği gösteren 1. yaprakçık diş sayısı karakteri, üçüncü bileşende en yüksek etkinliği gösteren 3. yaprakçık damar sayısı karakteri ve dördüncü bileşende en yüksek etkinliği gösteren diş boyu karakteri olmuştur.

Şekil 37. On dört karaktere ait faktör haritası.

On dört karakterin iki temel bileşene göre faktör haritası incelendiğinde karakterlerin dört bölgenin üçünde dağılmış olduğu görülmektedir (Şekil 37). Her iki bileşenin de pozitif olduğu birinci bölgede 1. yaprakçık boyu, 2. yaprakçık boyu, 2.

yaprakçık eni, 3. yaprakçık boyu, 3. yaprakçık eni, 1. yaprakçık damar sayısı, 2.

yaprakçık damar sayısı ve 3. yaprakçık damar sayısı karakterleri, birinci bileşenin pozitif, ikinci bileşenin negatif olduğu ikinci bölgede 1. yaprakçık eni, diş eni ve diş boyu karakterleri, birinci bileşenin negatif, ikinci bileşenin pozitif olduğu üçüncü bölgede ise 1. yaprakçık diş sayısı, 2. yaprakçık diş sayısı ve 3. yaprakçık diş sayısı karakterleri yer almıştır.

İki temel bileşene göre oluşturulan bireylere ait faktör haritasında (Şekil 38) genotiplerin dört bölgede de yer aldığı görülmüştür. Her iki bileşenin de pozitif olduğu birinci bölgede G5, G19, G25, G28 ve G34 genotipleri, birinci bileşenin pozitif, ikinci bileşenin negatif olduğu ikinci bölgede G2, G6, G14, G17, G18, G20, G21, G22, G23 ve G31 genotipleri, birinci bileşenin negatif, ikinci bileşenin pozitif olduğu üçüncü bölgede G1, G3, G7, G9, G16, G27 ve G29 genotipleri ve her iki bileşenin de negatif

(42)

36

olduğu dördüncü bölgede ise G4, G11, G12, G13, G15, G30, G32 ve G33 genotipleri yer almıştır.

Şekil 38. Toplanan genotiplerin iki temel bileşene göre faktör haritası.

Yapılan kümeleme analizi sonucunda oluşturulan dendograma göre (Şekil ..) genotiplerin iki ana kümeye ayrılmış, birinci ana kümede G28, G4, G11, G9, G16, G29, G5, G19, G25, G3, G1 ve G7 genotipleri, ikinci ana kümede ise G21, G13, G26, G32, G33, G2, G6, G30, G31, G15, G12, G18, G20, G17, G14, G22, G23, G24 genotipleri yer almıştır.

(43)

37

Şekil 39. On dört karakter için hiyerarşik kümeleme dendogramı.

(44)

38 4.2. Moleküler Karakterizasyon

DNA Miktarları

DNA izolasyonu sonucunda elde edilen DNA miktarları Tablo 9’da verilmiştir.

Tablo 9. DNA miktarları.

Örnek No DNA Miktarı (ng/µl) OD 260/280 OD 260/230

1 721,28 2,19 0,26

5 600,20 2,06 0,54

6 97,57 1,92 0,22

7 941,70 2,22 1,64

9 273,76 1,96 0,14

12 387,41 2,20 1,37

15 1444,20 2,19 0,59

16 357,11 1,52 0,17

18 329,14 1,94 0,14

19 871,39 2,08 0,59

21 409,72 1,71 0,22

31 90,17 2,15 0,24

34 803,43 2,03 0,64

DNA miktarlarının ölçülmesinden sonra DNA kalitesinin belirlenebilmesi için ekstraktlar

%1’lik Agaroz jelde yürütülüp sonrasında görüntülenmiştir (Şekil 40).

Şekil 40. Örneklere ait DNA ekstraktları.

Elde edilen DNA’lar PCR işlemleri için yeterli miktar ve kalitede olmuştur, Moleküler karakterizasyon işlemleri seçilen toplam altı SSR belirteci kullanılarak yapılmıştır. PCR işlemleri sonrasında görüntüsü alınan jellerde (Şekil 40 ve 41)

“GelAnaylzer 2010a” kullanılarak bant büyüklükleri belirlenmiş (Şekil 42), daha sonra bu büyüklüklerden faydalanılarak skor tabloları oluşturulmuştur. Bu tablolardan faydalanılarak Ward (en küçük varyans) metodu ile istatistik analizler gerçekleştirilmiştir. Kullanılan altı belirteçten beş tanesi amplifiye olmuş, bunlar toplam 11 farklı allel üretmiştir.

(45)

39

Şekil 41. PCR sonrası jel görüntüleri ((a): EMFv8 primeri ile G1-G26 arası genotiplerin amplifikasyonları; (b): EMFv10 primeri ile G1-G26 arası genotiplerin amplifikasyonları)

Şekil 42. GelAnaylzer 2010a ekran görüntüsü.

(46)

40

Kümeleme (Cluster) ve Temel Bileşenler (PCA) Analizleri

On bir farklı allel için yapılan PCA analizi sonucunda dört önemli bileşenin ortaya çıktığı (eigen değeri > 1) ve toplam varyasyonun %77,216’sının açıklandığı görülmüştür (Tablo 10).

Tablo 10. Temel bileşenler analizi sonucunda açıklanan toplam varyans.

Total Variance Explained

Component Initial Eigenvalues

Total % of Variance Cumulative %

1 3,342 30,378 30,378

2 2,091 19,012 49,390

3 1,714 15,577 64,967

4 1,347 12,249 77,216

5 0,920 8,368 85,584

6 0,565 5,132 90,716

7 0,489 4,442 95,158

8 0,317 2,877 98,036

9 0,123 1,115 99,151

10 0,074 0,669 99,820

11 0,020 0,180 100,000

Tablo 11. Beş belirteç için temel bileşen katkıları.

Rotated Component Matrix^a Bileşen

1 2 3 4

EMFv2 (Lokus 1)

Allel 1 0,256 0,102 -0,048 0,903 Allel 2 0,685 0,207 0,060 -0,632 Allel 3 0,169 0,778 0,447 -0,083 EMFv3

(Lokus 2)

Allel 1 0,676 0,158 -0,023 0,397 Allel 2 0,051 0,794 -0,297 0,034 EMFv4

(Lokus 3)

Allel 1 0,872 -0,252 0,189 0,095 Allel 2 0,215 0,128 0,765 -0,228 EMFv8

(Lokus 4)

Allel 1 0,882 0,324 -0,061 -0,024 Allel 2 -0,001 0,048 0,886 0,104 EMFv10

(Lokus 5)

Allel 1 0,629 -0,266 0,333 0,058 Allel 2 -0,106 0,759 0,226 0,082 Extraction Method: Principal Component Analysis.

Rotation Method: Varimax with Kaiser Normalization.

a. Rotation converged in 6 iterations.

Beş belirteç arasında birinci bileşende en yüksek etkinliği EMFv8 belirtecinin birinci alleli, ikinci bileşende en yüksek etkinliği EMFv3 belirtecinin ikinci alleli, dördüncü bileşende yine EMFv8 belirtecinin ikinci alleli ve dördüncü bileşende EMFv2 belirtecinin birinci alleli göstermiştir (Tablo 11).

(47)

41

Temel bileşenler analizi sonucunda iki temel bileşene göre oluşturulan faktör haritasında (Şekil 43) on bir allelin iki kümede toplandığı görülmüştür. Her iki bileşenin pozitif olduğu birinci bölgede lokus 1’in 2. ve 3. allelleri (L1A2, L1A3), lokus 2’nin 2.

alleli (L2A2), lokus 3’ün 2. alleli (L3A2), lokus 4’ün 2. alleli (L4A2) ve lokus 5’in 2. alleli (L5A2), birinci bileşenin pozitif, ikinci bileşenin negatif olduğu ikinci bölgede ise lokus 1’in 1. alleli (L1A1), lokus 2’nin 1. alleli (L2A1), lokus 3’ün 1. alleli (L3A1), lokus 4’ün 1.

alleli (L4A1) ve lokus 5’in 1. alleli (L5A1) yer almıştır.

Şekil 43. On bir allele ait faktör haritası.

(48)

42

Şekil 44. Toplanan genotiplerin iki temel bileşene göre faktör haritası.

İki temel bileşene göre oluşturulan bireylere ait faktör haritasında (Şekil 44) genotiplerin dört kümede de yer aldığı görülmüştür. Her iki bileşenin pozitif olduğu ilk kümede G7, G12, G15, G16, G19, G22, G29, G31 genotipleri; birinci bileşenin pozitif, ikinci bileşenin negatif olduğu ikinci kümede G13, G14, G21, G23, G24, G28, G33, G34 ve FragariaXananassa_1 genotipleri; birinci bileşenin negatif, ikinci bileşenin pozitif olduğu üçüncü kümede G1, G3, G4, G5, G6, G9, G17, G18, G20, G25, G26, G30 genotipleri ve her iki bileşenin de negatif olduğu dördüncü kümede G2, G11, G32 ve FragariaXananassa_2 genotipleri yer almıştır.

(49)

43

Şekil 45. Beş belirteç için hiyerarşik kümeleme dendogramı.

Yapılan kümeleme analizi sonucunda oluşturulan dendograma göre (Şekil 45) genotiplerin iki ana kümeye ayrılmış, G23, G22, G19, G7, G15, G12, G16, G35, G34, G30, G24, G21, G13, G14, G32, G28, G33, G29 ve G31 genotiplerinin birinci ana kümede, G18, G26, G1, G17, G2, G36, G11, G9, G20, G6, G5, G3 ve G4 genotipleri ikinci ana kümede yer almıştır.

(50)

44 4. SONUÇ

Trakya bölgesinin kapsamlı bir şekilde taranması sonucunda üç farklı Fragaria türü tespit edilmiştir. Tespit edilen türler F. vesca, F. viridis ve F. sterilis’dir. Ancak şunu belirtmek gerekir ki. Fragaria sterilisis son yıllarda sistematikçiler tarafından Potentilla cinsi altında değerlendirilmektedir. Arazi surveyleri esanasında F. vesca’yı F.

sterilis’den ayırt etmenin zor olduğu görülmüştür. Araştırma esansında bu örneklerin uzun süre ile laboratuvar ve sera ortamında takip edilmeleri bu ayırımın yapılmasına büyük kolaylık sağlamıştır.

Bölgedeki Fragaria viridis popülasyonun sınırlı olduğu görülmekte olup bu türü bölgede daha iyi takip edilmesi ve popülasyonun korunması gerektiği görülmektedir.

Moleküler karakterizasyon beş SSR belirteci ile gerçekleştirilebilmiş. Fakat genotipler arasındaki ayrımın anlaşılabilmesi için oluşan varyasyon çok yüksek olmamıştır. Yapılan kümeleme analizi sonucunda morfolojik gözlemler sonucunda F.

sterilis olarak tespit edilen genotiplerin moleküler olarak da çoğunlukla beraber kümelendiği görülmektedir. Morfolojik olarak F. vesca olarak tespit edilen 7 genotipin altı tanesi aynı küme içerisinde yer almış ve F. viridis de bu kümenin içerisinde yer almıştır. Beş belirteç açısından yapılan karakterizasyonda F. viridis’in F. sterilisis’e yakınlığı F. vesca’dan daha fazladır. Kullanılan iki adet F.ananassa örneğinin kümeleme dendogramının iki ayrı kolunda yer alması sebebiyle tür seviyesinde bir ayrımın sağlanamadığı söylenebilir.

Temel bileşenler analizinde sonucunda genotipleri iki ayrı grup halinde kümelendikleri görülmüştür. Tamamı F. sterilisis’den oluşan bir grupun yanı sıra F.

vesca, F. viridis ve F. sterilisis den oluşan ikinci bir grup oluşmuştur. Bunların dışında da iki grupda da yer almayan dört genotip faktör haritasının çeşitli yerlerine dağılmıştır.

Hiyerarşik kümeleme analizi hem morfolojik hem moleküler veriler dayandırılarak iki kere yapılmıştır. Bu kümeleme analizi sonucunda da 30., 21., 13., 33. ve 31.

genotipler aynı küme içerisinde yer almıştır. Benzer şekilde 11. ve 9. genotiplerinde aynı küme içerinde oldukları tespit edilmiştir.

Moleküler karakterizayon için daha fazla moleküler belirteç kullanılması gerektiği görülmektedir.

(51)

45 5. KAYNAKLAR

Anonim. http://www.eu-nomen.eu/portal/taxon.php?GUID=E587ED74-2AC9- 4F65-A41F-1C4AD11CC2AE# (Erişim tarihi: Haziran, 2017)

Arulsekar, S. Ve Bringhurst, R.S. Genetic model fort he enzyme marker PGI in diploid California Fragaria vesca. Journal of Heredity 73, 117-120. 1981.

Dokuzoğuz, M. Önemli çilek çeşitlerimiz üzerine pomolojik araştırmalar. Ege Üniversitesi, Ziraat Fakültesi yayınları:74, İzmir, 1963

Geibel, M. 2002. Genetic Resources in Strawberryies in Europe. Acta Hort.

(ISHS) 567:73-75 http://www.actahort.org/books/567/567_5.htm. IV. International Strawberry Symposium.

Hancock J.F., Strawberries,Wallingford,UK,1999, (p47-66)

Hummer, K.E., Hancock. Strawberry genomics: botanical history, cultivation, traditional breeding and new tecnologies, Chap.11. Springer, Germany,p(413-435)

Hummer KE (1991). Fragaria at the National Clonal Germplasm Repository at Corvallis, Oregon. In: Dale A, Luby JJ, editors. The Strawberry into the 21st Century.

Portland: Timber Press,pp. 106–107.

Husson, F., Le, S. and Pages, J. Exploratory Multivariate Analysis by Example Using R, Chapman and Hall. 2010

James, C. M., Wilson, Hadonou, F. A. M., Tobutt, K. R. Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in diploid strawberry (Fragaria vesca L.) for mapping, diversity studies and clone identification. Molecular Ecology Notes, (2003):03, 171–173.

Kaşka, N., Paydaş, S., Gübrük, H., Melezleme Islahıyla Elde Edilen Bazı Umutlu Çilek Çeşit Adaylarının Veri Denemelerindeki Ön Sonuçlar. Derim,7(4): 150-157.1990 Kaşka, N.,Paydaş, S. Çilek Melezleri Üzerine Çalışmalar. Bitki Islahı Simpazyumu, 15-17 Ekim 1986, İzmir (p17-25)

Navatel J.C., Kruger E.. From Finland to Turkey the European Strawberry Cultivar Network. Euro Berry Symposium – COST- Action 836 Final Workshop.Ancona, Italy, 2004

R Core Team R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/.

2016

Roudeillac, P. and Boxus, P. 1997 Preservation of F x ananassa genetic resources in Europe: organization of a European strawberry genebank. Acta Hort.

439:43-46.

(52)

46

Sangiacoma M.A., Sullivan J.A.,Introgression of wild species into the cultivated strawberry using octoploids. Theory of Applied Genetics 88:349-357, 1994

Serçe S., Paydaş S., Kaşka N., Gündüz K., Özdemir E. , Hancock J.F., Makaracı A.Z. . Türkiye'deki mevcut çilek (Fragaria sp) gen kaynaklarının toplanarak değerlendirilmesi ve çekirdek koleksiyonlarının oluşturulması, TOVAG 103O121, Proje sonuç raporu. TÜBİTAK, Türkiye (2007)

Yoon, M et al. Genetic diversity and population structure analysis of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using SSR markers. Electronic Journal of Biotechnology.

Vol:15. No:2. 2012