BİTKİ PARAZİTİ NEMATODLARDA ÖRNEK ALMA VE EKSTRAKSİYON
YÖNTEMLERİ
Doç. Dr. Gökhan AYDINLI
Örnek Alma Yöntemleri
Nematodların yaşama ortamlarının bilinmesi, örnek almada göz önünde tutulması gereken en önemli husustur.
Nematodların elde edilmesi için toprak ve bitki örnekleri alınır.
Örnek içerisindeki nematod miktarı, örneklemenin yapıldığı zamandaki nematod populasyonunu doğru bir şekilde göstermelidir. Bu nedende, örnek büyüklüğü, örnekleme derinliği, örnek alma zamanı, örnekleme deseni, örneklerin muamalesi, taşınması ve depolanması işlemleri dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
UNUTMA! Alınan örnekler ile o alanda zararlı nematod olup olmadığının kararı verilecektir.
Örneklemeyi, çalışmanın amacı ve örnekleme alanının ekili yada boş olması etkiler.
Bu bakımdan örnekleme araziyi temsil edecek şekilde olmalıdır.
Farklı örnekleme desenleri A) Ekilmemiş tarladan B) Meyve bahçesinden ve C) tek bir ağaçtan örnek alma deseni
Örnekleme için kürek, toprak sondası, toprak burgusu, bıçak, makas gibi aletler kullanılır.
Toprak örneği, genellikle 5 dekarlık bir alanın 50-60 farklı noktasından alınıp, paçal yapılır ve alanı temsil edecek 1 kg’lık örnek analiz için alınır.
1 hektardan daha büyük alanlarda, örnekleme yapılacak alan 1 hektarlık alanlara bölünür ve bu şekilde her 1 hektarlık alanı temsil edecek şekilde örnek alınmış olunur.
Toprak ekili ve üzerinde bitki var ise, alan hakim bir yerden gözlem yapılarak nematod ile bulaşık olabileceği tahmin edilen bitkilerin bulunduğu bölgeden mutlaka toprak örneği alınmalıdır.
Topraktan örnek alma derinliği 5-30 cm’dir.
Toprak derinliğini bitkinin kök derinliği belirlenmektedir.
Çok yıllık bitkilerde örnek alma derinliği 40-60 cm olup, 100 cm’e kadar gidebilir.
Toprak örnekleri alınırken toprağın tavında olması gerekir.
Kök örnekleri de toprak örnekleri gibi aynı zamanda ve aynı lokasyondan alınmalıdır.
Ölü bitkilerden örnek alınmamalıdır.
Bitkiler çekilerek çıkarılmamalı ve kılcal köklere zarar verilememelidir.
Bir kürek veya mala kullanarak bitkiler ve kökleri, kök sistemi zarar görmeden topraktan çıkarılmalıdır.
Kök üzerindeki toprak hafifçe vurarak uzaklaştırıldıktan sonra, köklerden bir bıçak veya makas ile rastgele örnekler alınır. Küçük bitkilerde bitki bütün kökleri alınabilir.
Örnekleme yapılan bitkiye bağlı olarak değişmekle birlikte genellikle 25-100 g kök örneği yeterlidir. Çeltik gibi ince köklere sahip bitkilerden daha az miktarlarda alınabileceği gibi, meyve ağaçları gibi çok yılık bitkilerden daha fazla miktarlar alınabilir.
Kök örnekleri, aynı alandan alınan toprakla birlikte aynı torbaya konulmalıdır. Çünkü toprak köklerin korunmasına yardımcı olacaktır.
Örnekler nemini kaybetmemesi için sağlam plastik torbalara yerleştirilir ve sıkıca kapatıldıktan sonra etiketlenir.
Örnek ile ilgili etiket aşağıdaki bilgileri içermelidir.
o İl/İlçe
o Köyü/Mevki (GPS koordinatı)
o Arazi sahibinin adı-soyadı, iletişim bilgisi o Arazi büyüklüğü (da, m2)
o Arazinin ne amaçla kullanılacağı o Arazide mevcut bitki çeşidi
o Bir önceki ürün
o Örneğin alındığı tarih o Örneğin alındığı derinlik o Örneği alanın adı-soyadı
Çalışmanın amacına göre ilave bilgiler eklenebilir.
Etiketler açık ve okunaklı bir şekilde kurşun kalemle veya suda ıslandığında mürekkebi dağılmayacak bir kalemle yazılarak torbanın içine ve dış kısmına olmak üzere ayrı ayrı bağlanır.
Pratik olması açısından örneklere kısa kodlar verilerek, gerekli etiket bilgileri bu kod ile arazi survey notlarının alındığı deftere veya dosyaya kaydedilebilir.
Örnekler taşıma aşamasında serin bir yerde tutulmalı, asla direkt güneş ışığına maruz bırakılmamalıdır.
Laboratuvara ulaşana kadar serin bir yerde muhafaza edilmelidir.
Laboratuvarda hemen işleme alınmayacaklarsa, 2 haftaya kadar buzdolabında (4°C) veya sıcaklığın 10°C’yi geçmeyeceği bir yerde muhafaza edilebilir.
Tropik bölgelerden alınan örneklerde, düşük sıcaklıkların nematod üzerinde olumsuz etkileri olabileceği unutulmamalıdır.
Ekstraksiyon Yöntemleri
Ekstraksiyon ; toprak veya bitkiden nematod elde etme işlemidir.
Örnekler toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede ekstraksiyon işlemine geçilmelidir.
Baermann Huni Yöntemi
Cobb Elek Yöntemi
Elek ve Şekerli Su+Santrifuj Yöntemi
İnkübasyon Yöntemi
Blender Yöntemi
Özel geliştirilmiş aletler
o Ooestenbrink Elütriator o Fenwick Aparatı
o Mister Cihazı
Baermann Huni Yöntemi
Hem toprak hem de bitki dokusundaki nematodları elde etmek için kullanılabilir.
Yöntemin esası nematodun hareketine dayanır.
Yöntem basit olarak huni, ucuna takılan plastik bir boru ve bu borunun alt kısmındaki bir kıskaçtan oluşur.
Huni su ile doldurulduktan sonra huniye, kağıt mendil içerisindeki toprak veya bitki parçaları yerleştirilir.
Genellikle 48-72 saat sonra hortumun ucundaki kıskaç açılarak az miktardaki su ile birlikte nematodlar toplanmış olur.
Avantajları
Basit ve ucuz bir metottur.
Özel ekipman gerektirmez.
Hareketli nematodların büyük bir bölümü elde edilebilir.
Nematodlar 24-48 saat sonra elde edilirler.
Dezavantajları
Sadece aktif hareket eden nematodlar elde edilebilir. Büyük ve yavaş hareket eden nematodların elde edilme başarısı düşüktür.
Nematodların elde edilme oranı ortam sıcaklığına ve bekletme süresine bağlı olarak değişir.
Nematodlar 48-72 saat sonra ancak elde edilir.
Huni borusundaki oksijen azlığından dolayı nematod ölümü gerçekleşebilir.
Cobb Elek Yöntemi
Farklı delik açıklarına sahip olan özel eleklerin kullanıldığı bir yöntemdir.
Bu yöntemde toprağın bilinen bir hacmi (örneğin 200 ml), içerisinde 6 litre su bulunan geniş ve temiz bir kova içerisine boşaltılır.
Toprak partiküllerinin homojen dağılımı için toprak elle karıştırıldıktan sonra büyük partiküllerin çökmesi için 30 saniye beklenir.
Dibe çökmüş kısıın karşımasına izin vermeden (suyun yaklaşık ¾’ü) üsten itibaren 90 ve 38 μm olarak yerleştirilmiş eleklerden süzülür.
Kovaya tekrar su doldurulur ve yukarıdaki işlemler 1-2 kez tekrarlanır.
Eleklerde toplanan nematodlar su yardımıyla beherlerde toplanır.
Behere alınan nematodların dibe çökmesi için 2-3 saat beklenir.
Beherin üstünde kalan fazla su dikkatlice dökülür ve altta kalan su gözlem kabında incelemeye alınır.
Ancak, örnekte kist nematodu mevcut ise kistlerin dibe çökmeden su yüzeyinde (beherin kenarlarında) kalacakları unutulmamalı ve fazla su dökülmemelidir.
Avantajları
Hareketli ve hareketsiz bütün nematodlar iyi bir ekstraksiyon sağlar.
Büyük ve yavaş hareket eden nematodlar için uygundur.
Yaş topraklardan nematod elde etmek için uygundur.
Topraktan kist ekstraksiyonu için kullanışlıdır.
Dezavantajları
Özel delik açıklıklarına sahip olan elekler oldukça pahalıdır.
Toprak su içerisinde iyi bir şekilde karıştırılmazsa, nematodlar toprak partikülleri ile çökebilir.
Nematodlar kolay zarar görebilir.
Elek ve Şekerli Su+Santrifuj Yöntemi
Toprakta yaşayan nematodların kısa sürede temiz bir şekilde elde edilmesi sağlar.
Elek yöntemi ile beherde toplanan sulu karışım santrifuj tüplerine boşaltılır.
Tüpler 4-5 dakika 1500–1750 rpm devirde santrifuj edilir ve 5 dakika beklendikten sonra tüpteki dibe çöken kısmın (pellet) üstünde kalan su bir hamlede dökülür.
Tüpte kalan kısmın üzerine, daha önce hazırlanmış olan şekerli su (454 g şeker/1 L su) eklenir ve tüpler çalkalanır.
Tüpler yeniden santrifuje konularak cihaz 500-1000 rpm devirde 1 dakika çalıştırılır.
Bu süre sonunda santrifujden alınan tüplerin sıvı kısmı 45 μm elek üzerine dökülür ve bol su ile hızla yıkanarak behere toplanır.
Avantajları
Aktif olmayan nematodların elde edilmesini sağlar.
Nematodlar kısa bir sürede temiz bir solusyon içerisinde elde edilebilir.
Dezavantajları
Santrifuj cihazını ve bazı kimyasallara ihtiyaç duyar.
Şeker uzun süre kaldığında nematoda zarara verebilir.
İnkübasyon Yöntemi
Bitki dokularındaki hareketli nematodları elde etmek için kullanılır.
Bitki kısımları dikkatlice yıkanır ve parçalara ayrılır.
Kesilen bitki parçaları su dolu bir kavanoza yerleştirilir ve kavanozun ağzı kapatılır.
Kavanozdaki su her gün bir beherde toplanır ve kavanoza yeni su doldurulur.
Düzenli olarak yapılan bu iş, kavanozdaki nematodların canlı kalmasını sağlayacaktır.
Bu işlem 2-7 gün süren inkübasyon periyodu süresince her gün tekrarlanır.
Ekstraksiyon süresi sonunda, beherde toplanan nematodlar dibe çöktükten sonra üstteki fazla su uzaklaştırılarak dipte kalan su incelenir.
İstenirse, suyun miktarını azaltmak için beherdeki su elekten geçirilebilir.
Avantajları
Basit bir yöntemdir.
Özel bir ekipman gerektirmez.
Dezavantajları
Ekstraksiyonun etkinliği kısmen yetersiz olabilir.
Oksijen eksikliğinden dolayı nematodlar genellikle kötü koşullarda kalır.
Blender Yöntemi
Bu yöntem genellikle elek, huni veya tepsi yöntemi ile kombine edilir.
Bitki dokularındaki hareketli ve hareketli olmayan nematodlar hızlı bir şekilde elde edilebilir.
Bitki parçaları yıkadıktan sonra küçük parçalara ayrılır ve içerisinde su bulunan blendere yerleştirilir.
Blender ince kökler için iki defa 5 saniye süre ile sert kökler için iki defa 10 saniye süre ile çalıştırılır ve iki süre arasında süspansiyonun çökmesi için bir süre beklenilmelidir.
Blenderdaki sulu bitki solüsyonu önce behere alınır.
Daha sonra bitki parçalarından nematodu ayırmak için bu solusyon ya elekten geçirilir yada tepsi yöntemi (veya huni yöntemi) kullanılır.
Avantajları
Kök dokusundaki aktif olmayan nematodların elde edilmesini sağlar.
Özel ekipman gerektirmez.
Dezavantajları
Blenderdan geçirme süresi oldukça kritik ve nematodlar zarar görebilir.
Bir yöntem ile kombine edilmelidir.
Özel geliştirilmiş aletler
Oostenbrink Elütriatör
Büyük miktardaki toprak örneklerinde (250-1000 ml) nematod elde etmek için kullanılan bir alettir.
Çok sayıda örneğin kısa süre ekstraksiyonuna olanak sağlar.
Pahalı bir ekipmandır.
Otomatik çalışan versiyonları bulunmaktadır.
Standardizasyon sağlamak kolaydır.
Dezavantajı çok su harcamasıdır.
Fenwick Aparatı
Toprak örneklerinden (250 ml) kistlerin elde edilmesinde kullanılan bir ekipmandır.
Çok sayıdaki örnekten hızlı bir şekilde kistlerin elde edilmesini sağlar.
Ekstraksiyonda kullanılacak olan toprağın önceden krurutlmuş olması gerekir.
Yapımı daha kolay olan bir alettir.
Çok su harcaması en önemli dezavantajıdır.
Mister Cihazı
Gövde, yaprak, kök gibi bitki parçalarından nematodları elde etmek için kullanılır.
Cihaz belirli süre aralıklarında (örneğin 2 dakikada 15 saniye), sabit bir basınç (örneğin 30 psi) ile su püskürten bir sisleme kabini şeklindedir.
Bu kabin içerisine, baermann hunisi veya tepsi (petri) yöntemine göre hazırlanmış örnekler yerleştirilir.
Bu örneklerden nematodlar her 24 veya 48 saatte bir toplanır ve ekstraksiyon işlemi örneğin durumuna bağlı olarak 4 haftaya kadar devam edebilir.
Bitki örneğindeki oksijenin tükenmesini engellemesi ve toksik ürünlerin yıkanarak uzaklaşmasını sağlaması önemli bir avantaj sağlar.
Fazla miktarda su tüketimi en önemli dezavantajıdır.
