Floresanlı Antikor (İmmunfloresans) Deneyleri
Doğrudan (Direkt) İmmunfloresans Yöntemi
Bu yöntemle materyalde antijen tespiti yapılır. Materyal kalitesi ne kadar iyi ise
(uygun yerden, uygun zamanda, uygun miktarda hücre içerecek şekilde) yöntemin duyarlılığı o kadar yükselir. Bu tür deneylerde içlerinde belirli antijenlerin (doğrudan
mikroorganizmalar ya da bunların antijenlerinin) varlığının araştırılması, istenilen
materyallerden hazırlanan preparatlar tespit edildikten sonra üzerlerine floresanlı antikor içeren bağışık serumların konulması, bir süre sonra antikor fazlasının yıkanması ve floresans mikroskobu ile incelenerek antikorların lamdaki antijenlerine yapışıp yapışmadığının ortaya çıkacak olan floresans ile araştırılması yöntemi uygulanır.
Bu tür deneyler için elde, aranacak olan her antijen için aynı özgül ve floresanlanmış antikorları içeren bağışık serumların bulunması gereklidir.
Preparatların hazırlanması
Sıvı besiyerlerinde üretilmiş bakterilerden preparat hazırlamak
Önce kültürler 2000 rpm‟ de 10 dakika santrifüj edilir.
Elde edilen bakteri çökeltisinin üst sıvısı uzaklaştırılır.
içine pH 7 tamponlu tuzlu su eklenerek yeniden süspanse edilir ve bu şekilde bir kez daha yeni sıvı ile yıkanması gerekir.
Sonunda tüpün üstündeki sıvı uzaklaştırılır.
Yavaş üreyen bakteriler için tüp dibindeki çökeltiden hemen, bol üreyenler için ise yukarıda bildirildiği oranda sulandırıldıktan sonra preparat hazırlanıp havada kurutulur.
Dokulardan preparat hazırlamak
Dokuların ya hastalıklı kısımlarından ezmek suretiyle preparat hazırlanır, ya da parafin bloklanmasından sonra yapılan kesitlerden özel yöntemle preparat hazırlanabilir.
Bu kesitlerin önce parafinsizleştirilmeleri gerekir.
Parafinli kesitlerin parafinsizleştirilmeleri için bu kesitler önce lamların üzerine konur.
Lama yapışmaları için 58 - 60 derecede 10 dakika bekletilir.
Arka arkaya iki kez ksilol içine konur
iki kez saf etanol‟e konur.
iki kez % 95‟ lik etanole konur.
iki kez saf suya bandırılıp çıkarıldıktan sonra havada kurutulur.
Not: Antijen araştırarak tanı koymak amacıyla, hastalık materyallerinden hazırlanacak preparatlar, materyalin türüne göre aşağıdaki yöntemle hazırlanır.
o irin ve balgamdan öze ya da eküvyonla,
o Beyin omurilik sıvısını santrifüj ettikten sonra çökeltiden, o Dışkı bir kaç kez tamponlu sıvı ile sulandırıldıktan sonra lama yaymak suretiyle preparatlar hazırlanıp havada kurutulur.
Preparatların Tespiti
Alevde tespit kullanılmaz.
Bazı kimyasal maddeleri nemli ortamda preparatların üzerlerine döküp belirli süreler bekletmekle yapılan tespit tercih edilir.
Aynı kaptaki kimyasal maddeye daldırma yönteminde preparattan preparata kirlenme olabileceğinden bu yöntem kullanılmamalıdır.
Kimyasal madde, preparatın üzerine dökülerek tesbit edilmelidir
Aseton ile 10 dakika, % 95‟lik etanolde 2-10 dakika, % 10‟ luk nötral formalin eriyiğinde 5 dakika, içerisinde kloroform formalin ve absolü etanol bulunan Kirk Patrik eriyiğinde 5 dakika tutularak tesbit yapılabilir.
Bu eriyiklerden herhangi birisi ile tesbiti tamamlanan preparatlar iki kez tamponlu tuzlu su ile bir kez de saf su ile yıkanır ve havada kurutulur.
Floresanlı Bağışık Serumların (Pozitif Serum) Titrasyonu
Homolog antijenden birkaç adet preparat hazırlanır. Üzerlerine floresanlı bağışık
serumun değişik sulandırımlarından damlatılarak yöntemine göre boyama yapılır. Floresanlı mikroskopla yapılan incelemede serum sulandırımlarından yalancı reaksiyon vermeyen en iyi boyama yapan sulandırımı saptanır. Sonuçlar 4+, 3+, 2+, 1+ diye değerlendirildiğinde 4+
veren en son sulandırımı o serumun titresini verir. Deneylerde bu sulandırımın iki kat daha yoğun olanı kullanılır. Örneğin: 1,5 lik sulandırımı ile 4+, 1.10 ile 4+, 1.20 ile 4+, 1.40 ile 4+, 1.80 ile 2+ vb. sonuç veren serumun titresi 1.40 olup deneylerde 1:20 sulandırımı kullanılacaktır. Floresanlanmış serumlar sıvı halde dayanıksız olup bir kez kullanılacak hacimlere bölünerek -20 OC‟de dondurularak saklanmalıdır.
Preparatların Floresanlı Antikor ile Boyanmaları
Doğrudan (direkt) floresanlı antikor yönteminde hazırlanan preparatların üzerine
floresanlı bağışık serum uygulanarak boyama yapılır. Kurumayı önlemek için bu işlem nemli ortamda dibinde ıslak süzgeç kâğıdı bulunan petri kutusu içinde yapılır. Kullanılacak
floresanlanmış serum, titresine göre kullanılmalıdır.
Bir petri kutusu alıp dibine ıslak bir süzgeç kâğıdı kaplanır.
Boyanacak preparatlar, petri kutusuna konan iki çöp üzerine bırakılır.
Üzerlerine, floresanlanmış bağışık serumlar pipetle damlatılarak yayılır.
Petri kutusunun kapağı kapatılır.
Oda derecesinde ya da 37 °C de 30 dakika boyanmaya bırakılır.
Bu süre sonunda preparatlar yıkanır. (Yıkamanın dikkatlice yapılması gerekir.
iki ayrı materyale ait preparat bir arada yıkanmaz.) En iyisi petri kutusu kapağına preparat kısmı yukarı gelecek şekilde bırakılan lamların üzerine yavaşça tamponlu tuzlu su damlatırken kapağı eğik tutarak preparatı bir süre yıkamak ve sonunda kapağı bu sıvı ile doldurarak beşer dakikadan iki kez değiştirmek suretiyle bu sıvı içerisinde bırakmaktır.
Son yıkamadan sonra da preparatlar bir kez saf su ile yıkanmalıdır.
Bir süzgeç kâğıdı üzerine eğik olarak bırakılan preparatların süzdürülerek kurumaları beklenir. Yıkamada kullanılan tamponlu tuzlu suyun pH‟sının 7,2 olması büyük önem taşır.
Preparatlar üzerine gliserol damlatılarak lamel ile kapatılır. Floresan mikroskobunda 10x ya da 40x objektif ile incelenir.
Dolaylı (indirekt) Floresanlı Antikor Yöntemi
Bu yöntemde, hasta serumunda antikor tespiti yapılır. Aynı zamanda antikor titresi hakkında ve boyanma paterni ile de spesifik antikor veya antikorlar hakkında bilgi verir.
Uzun zaman alan çeşitli bakteriyolojik, virolojik ve serolojik deneylerin aksine
floresanlı antikor deneyleri hemen bir iki saat içinde sonuç verir. Ancak özel aparey ve ayıraçların ve ayrıca deneyimli personelin olması gerekir. Buna dikkat edilmezse ortaya çıkabilecek nonspesifik sonuçların yanlış değerlendirilmesi gibi olumsuzlukları vardır.
Bununla birlikte bu gün daha çok belirli alanlarda vazgeçilemeyen önemli deneylerdir.
Floresanlanmış bağışık serumların (Konjuge serum) laboratuvarlarda hazırlanmaları
mümkündür. Ancak oldukça zaman alıcı ve duyarlı deneyleri gerektirdiğinden bu serumların doğrudan doğruya ticaretten sağlanmaları önerilir.
Doğrudan (Direkt) immunfloresans Yönteminde olduğu gibi hazırlanan ve tesbit edilen preparatların üzerine;
Antijen araştırmak için; antikorları belli bağışık serumlar, belirli antijenlere karşı hasta kanında antikor araştırmak için; antijeni belli preparatlar üzerine hasta serumları dökülür.
Nemli ortamda oda derecesi ya da 37 °C de 30 dakika bekletilir.
Süre sonunda preparatlar önce tamponlu tuzlu su ile sonra saf su ile yöntemine göre yıkanıp havada kurutulur. Bu ana kadar preparatlarda birbirlerine uygun antijen ve antikorlar var ise birbirleri ile birleşmiştir.
Bundan sonraki aşamada preparatlar ilk konan bağışık serumun kaynaklandığı hayvan türünün (ya da insanın) globulinlerine karşı floresanlanmış antiglobulin içeren serum ile boyanır.
Preparatlar, yine nemli ortama konur.
Üzerlerine floresanlı antiglobulin damlatılıp oda derecesinde ya da 37 °C de 30 dakika bekletilir.
Daha sonra yıkanıp kurutulur.
Preparatların Hazırlanması
Preparat, doğrudan (direkt) immunfloresans yönteminde olduğu gibi hazırlanır.
Preparatların Tespiti
Preparat, doğrudan (direkt) immunfloresans yönteminde olduğu gibi tespit edilir.
Floresanlı Antikorla Boyanmış Preparatların incelenmesi
Bu preparatları incelemek için önce lamelle örtülür. Preparatlar bekletilmeden
incelenir. Floresans mikroskopi sonuçları değerlendirilir.
Preparatların Lamel ile Örtülmesi
Preparatlar, genellikle üzerlerine lamel kapatılarak incelenir.
Bunun için lamın üzerine bir damla birleştirme sıvısı Mounting fluid ve
üzerlerine çok temiz bir lamel, hava kabarcıkları oluşmayacak biçimde kapatılır.
Birleştirme sıvısının pH derecesinin asit olmaması büyük önem taşır.
Lamelin kaymaması için bir ucuna küçük bir damla tırnak cilası ile tutturulur.
Preparatların incelenmesi
Preparatlar bekletilmeden incelenmelidir. Eğer bekletmek gerekli ise ya lamel kapatılmadan kuru olarak ya da lamel kapatılmış ise kurumalarının önlenmesi için lamelin
etrafını çepeçevre tırnak cilası ile çevreleyerek karanlıkta ve soğukta 24 en çok 48 saat
içinde incelenmek üzere saklanabilirler.
Floresan antikor inhibisyonu kontrolü: Preparat, önce floresanlanmamış
bağışık serum ile işlem görür sonra floresanlı bağışık serum ile karışlaştırılırsa
ilk serumdaki antikorlar antijene bağlanmış olacağından olumsuz sonuç alınır.
Bu durumda esas deneyde floresans görülmesinin bunun güvenilir olduğu
anlaşılır.
Preparat, uygun antikor içermeyen ancak floresanlanmış serumla işleme sokulduğunda floresans vermemelidir. Eğer verirse yalancı reaksiyonlar söz
konusudur.
Floresanlanmış bağışık serum, önce homolog antijen ile absorbe edildikten
sonra preparatla işleme sokulursa preparatta özgül antijen olsa bile floresans
vermemelidir.
