i
T.C.
NAMIK KEMAL ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ BİRİMİ
Proje No:
NKUBAP.00.10.AR.15.14
PROJENİN ADI
RN-18, HIV-1 Vif-APOBEC3G İNHİBİTÖRÜNÜN KARAKTERİZASYONU VE DFT YÖNTEMİYLE MOLEKÜLER MODELLENMESİ
Proje Ekibi:
Yürütücü:
Doç. Dr. Yelda YALÇIN GÜRKAN
Araştırmacı(lar) Yl Öğrenci Merve ÜRK Yl Öğrenci Gülnihal DOĞAN
Aralık 2015
TEKIRDAG
ii
Proje No:NKUBAP.00.10.AR.15.14 Proje Başlığı:
RN-18, HIV-1 Vif-APOBEC3G İNHİBİTÖRÜNÜN KARAKTERİZASYONU VE DFT YÖNTEMİYLE MOLEKÜLER MODELLENMESİ
Proje Yürütücüsü ve Araştırmacılar:
Doç.Dr. Yelda YALÇIN GÜRKAN(Yürütücü),Öğrenci Merve ÜRK, Öğrenci Gülnihal DOĞAN
Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi:
FEN EDEBİYAT FAKÜLTESİ KİMYA
Namık Kemal Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü
Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri:
08/06/2015-22/12/2015 Öz (en çok 70 kelime):
RN-18, HIV-1 Vif-APOBEC3G eksen inhibitör çalışmalarında yapı-aktivite ilişkisini ve optimizasyonunu tarif etmekte kullanılır. RN-18 halkasının C, B halkası, A halkasının, köprü A-B ve köprü B-C hedefli
modifikasyonlarının benzeri (4g ve 4i) ve geliştirilmiş 5, 8b ve 11 ile yeni inhibitörleri oluşturan çok önemli yapısal özelliklerini belirlemek için faaliyetleri gerçekleştirilmiştir. RN-18 analogları, iki etkili suda çözünür, aynı zamanda 17 ve 19’ların sonucunda ortaya çıkmıştir ve bu bileşik 19 ile farmakolojik çalışmaların sonuçlarını
açıklamıştır. Bu çalışmada ise bulgular sonucunda hedef RN-18 protein ve analoglarının tanımlanması için daha etkili inhibitörler geliştirilmiştir. Sentez sırasında etkili olan yeni inhibitorleri geliştirmek için yapısal temel anlama
üzerinde durulmuştur. Böylece A3G katalitik alanı yapısı önermek için RN-18 proteinden yola çıkılıp bir
homoloji modelleme yaklaşımı yapılarak, HIV-1 viral enfeksiyon faktörlerine karşı küçük molekül inhibitörlerinin
keşifleri geliştirilmiştir. Kuantum mekaniksel hesaplar gaz fazında yoğunluk fonksiyoneli teorisi DFT/B3LYP/631G*
yöntemiyle yapılmıştır ve her molekülün optimum geometrik parametreleri termodinamik ve elektronik özellikleri hesaplanmıştır. Kemoterapilerde özellikle, HIV-1 ters transkriptaz proteaz ve HIV-1 proteini hedef inhibisyonunda, kazanılmış bağışıklık eksikliği sendromu (AIDS) hastaların hayatlarını uzatmak için yardımcı olmuştur. HIV-1 replikasyonunun yüksek oranda ortaya çıkması, Anti-HIV’in kemoterapi alanında ilaca direnç gösteren türleri ortaya çıkartmıştır. HIV-1 (MDR) ilacı HIV-1 MDR mutantlarına önemli ölçüde karşı
direnç sağlamıştır. Sonuç olarak, sonuçlar VIF-APOBEC3G etkileşimi hedefleyen molekülleri optimize etmek ve yeni anti HIV ilaçların gelişiminde yol göstermek için kullanılabilir. Bu çalışma bilim açısından önemli bir yer edinecektir.
Anahtar Kelimeler: RN-18, HIV-1, VİF-APOBEC3G, DFT
Projeden Yapılan Yayınlar:
iii
PROJE SONUÇ RAPORU
Önsöz
Bu çalışmada ise bulgular sonucunda hedef RN-18 protein ve analoglarının tanımlanması için daha etkili inhibitörler geliştirilmiştir. Sentez sırasında etkili olan yeni inhibitorleri geliştirmek için yapısal temel anlama üzerinde durulmuştur. Böylece A3G katalitik alanı yapısı önermek için RN-18 proteinden yola çıkılıp bir homoloji modelleme yaklaşımı yapılarak, HIV-1 viral enfeksiyon faktörlerine karşı küçük molekül inhibitörlerinin keşifleri geliştirilmiştir. Kuantum mekaniksel hesaplar gaz fazında yoğunluk fonksiyoneli teorisi DFT/B3LYP/631G* yöntemiyle yapılmıştır ve her molekülün optimum geometrik parametreleri termodinamik ve elektronik özellikleri hesaplanmıştır. Kemoterapilerde özellikle, HIV-1 ters transkriptaz proteaz ve HIV-1 proteini hedef inhibisyonunda, kazanılmış bağışıklık eksikliği sendromu (AIDS) hastaların hayatlarını uzatmak için yardımcı olmuştur. HIV-1 replikasyonunun yüksek oranda ortaya çıkması, Anti-HIV’in kemoterapi alanında ilaca direnç gösteren türleri ortaya çıkartmıştır. HIV-1 (MDR) ilacı HIV-1 MDR mutantlarına önemli ölçüde karşı direnç sağlamıştır. Sonuç olarak, sonuçlar VIF-APOBEC3G etkileşimi hedefleyen molekülleri optimize etmek ve yeni anti HIV ilaçların gelişiminde yol göstermek için kullanılabilir. Bu çalışma bilim açısından önemli bir yer edinecektir.
Bu proje, Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir. Teşekkürlerimi bir borç bilirim.
iv İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ
... iii
İÇİNDEKİLER... ... iv
ŞEKİL LİSTESİ... vi ÇİZELGE LİSTESİ..……….…... vii
TABLO LİSTESİ……….………...ix
1. GİRİŞ………...1
1.1 AIDS ... 1
2 HIV ... 1
2.1 Tanım ... 1
2.2 Genetik Yapı ... 2
2.3 Replikasyon ... 5
3. MOLEKÜLER MODELLEME ... 8
3.1 Giriş ... 8
3.2 Moleküler Mekanik Yöntemler ... 9
3.3 Kuantum Mekanik Yöntemler ... 10
3.3.1 Giriş ... 10
3.3.2 Yarı Amprik Yöntemler ... 12
3.3.3 Ab inito Moleküler Orbital Yöntemleri ... 15
3.4 Schrödinger Denklemi ... 16
3.5 Born-Oppenheimer Yaklaşımı ... 17
3.6 Varyasyon Teoremi ... 18
3.7 Atomik Orbitalleri Doğrusal Kombinasyonu (LCAO) ... 19
v
4. MATERYAL VE HESAPLAMA METODLARI ... 20
4.1 Gaussian 09 ... 20
4.1.1 Gauss View 5.0.8 ... 20
4.2 Hartree-Fock Alan Teorisi, HF-SCF Yöntemi………21
4.3 Fonkionel Yoğunluk Yöntemleri (DFT)………. 23
4.3.1 Lee-Yang-Parr Korelasyon Fonksiyonu……… 25
4.3.2 B3LYP Karma Yoğunluk Fonksiyoneli Teorisi………. 25
4.3.3 Temel Setler ve 6-31-G (d) Temel Seti……… 26
5 ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA……… 28
5.1 Kuramsal Çalışmalar ……… 28
5.2 Kuramsal Yöntemler………. 28
5.2.1 Moleküler Mekanik Hesaplamaları………. 28
5.2.2 Moleküler Orbital Hesaplamaları……… 28
6 HESAPLAMALAR VE SONUÇ……… 29
6.1 Bileşiklerin Optimum Geometrik Yapısı………. 29
6.2 Titreşim Frekansları ………. 36
6.3 Mulliken Atomik Yükleri ………. 37
7 KAYNAKLAR ……… 43
8 ÖZGEÇMİŞ………. 47
vi ŞEKiLLER DiZiNi
Sayfa Şekil 2.1 : Hıv’ın Yapısı……….………..3 Şekil 2.2 : Hıv’ın Replikasyon Döngüsü………..………...7
vii ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 6.1 : RN-18 Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri……….31
Çizelge 6.2 : 4f Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri……..………....…..31
Çizelge 6.3 : 4l Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri……….32
Çizelge 6.4 : 5 Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………..32
Çizelge 6.5 : 8a Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………33
Çizelge 6.6 : 8b Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………33
Çizelge 6.7 : 11 Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………...….34
Çizelge 6.8 : 12 Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………....34
Çizelge 6.9 : 17 Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………35
Çizelge 6.10 : 19 Molekülünün Optimum Geometrik Parametreleri………..35
Çizelge 6.11 : Bileşiklerin Enerji-Entalpi-Gibbs Serbest Enerji Sonuçlar…………..…36
Çizelge 6.12 : RN-18’in Titreşim Frekansları.………...….……36
viii TABLOLAR DİZİNİ
Sayfa
Tablo 3.1 : Yarı-amprik Hesaplamalarla Kullanılan Yöntemler……….14
Tablo 6.1 : Antiviral Aktivite İçin Seçilen Bileşikler………..29
Tablo 6.2 : RN-18 Hesaplanan IR Değerleri...37
Tablo 6.3 : 4f Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………...37
Tablo 6.4 : RN-18 Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………...38
Tablo 6.5 : 4L Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………..38
Tablo 6.6 : 5 Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………39
Tablo 6.7 : 8a Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………..39
Tablo 6.8 : 8b Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………..40
Tablo 6.9 : 11 Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………..40
Tablo 6.10 : 17 Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………41
Tablo 6.11 : 19 Molekülünün Mulliken Atomik Yükleri………41
1 1.GİRİŞ
1.1. AIDS
AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome-Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu), bağışıklık sisteminin etkisiz hale gelmesi ile fırsatçı enfeksiyonların hastalık tablosuna eklendiği bir enfeksiyon hastalığıdır.
AIDS’in etiyolojik ajanı HIV (Human Immunodeficiency Virus-İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü) virüsüdür (Piot ve ark. 2001). HIV virüsü, insan vücudunun hastalıklara karşı direncini sağlayan bağışıklık sistemini etkisiz hale getirmektedir. Bağışıklık sisteminin etkisiz hale gelmesi, vücudun virüsten etkilenmeden önce kolayca mücadele edebildiği diğer hastalık etkenleriyle artık baş edemeyecek duruma gelmesi anlamına gelmektedir. Bu da basit bir enfeksiyonun bile ölümcül hale gelmesine sebep olabilmektedir. AIDS hastalarının yarısından çoğu bağışıklık sistemlerinin etkisiz hale gelmesi sonucu basit enfeksiyonlar nedeniyle hayatlarını kaybetmişlerdir (Kaya 2008).
AIDS hastalığı, ilk defa 1981 yılında ABD’de Hastalık Kontrol Merkezi (Centers for Disease Control; CDC) tarafından bir grup homoseksüel erkekte ve Haiti’den gelen göçmenlerde ender rastlanan Pneumocystis jiroveci (eski adıyla P. carinii) pnömonisi (PCP), ağır mukozal kandidoz ve Kaposi sarkomu (KS) vakalarının saptanması sonucu tanımlanmıştır (Anonim 1981a, 1981b, 1981c).
1983 yılında Fransa’da Pasteur Enstitüsü’nde F. Barré-Sinoussi ve L.
Montagnier tarafından etken virüs ilk kez izole edilmiştir (Barré-Sinoussi ve ark.
1983). Daha sonra Uluslararası Virüs Taksonomi Komitesi bu virüsü “insan immün yetmezlik virüsü” (human immunodeficiency virus; HIV), virüsün neden olduğu “sendrom”u da “edinilmiş bağışıklık eksikliği sendromu” (acquired immunodeficiency syndrome; AIDS) olarak adlandırmıştır (Coffin ve ark. 1986).
2. HIV 2.1. Tanım
AIDS hastalığını oluşturan HIV, genetik ve serolojik özelliklerine göre HIV-1 ve HIV-2 olmak üzere ikiye ayrılır (Ünal ve Sain 2002). Bu iki virüs tipi
2
orijinlerinin farklı olması nedeniyle birbirinden nispeten farklıdır ve nükleik asit serileri %40 oranında benzerlik gösterir (Lever 2009). HIV-1 ilk kez 1983 yılında Paris’te, HIV-2 ise ilk olarak 1986 yılında Batı Afrika’da izole edilmiştir (Ünal ve Sain 2002). Dünyada AIDS olgularının %98’inden HIV-1 sorumludur (Lever 2009). Bu virüs tipine Afrika, Asya, Avrupa, Kuzey ve Güney Amerika’da yaygın olarak rastlanmaktadır. HIV-2 ise özellikle Batı Afrika’da, daha az sıklıkla Avrupa’nın bazı ülkelerinde ve ABD’de rastlanan HIV tipidir (Özbal 2007). Her iki virüs tipi de AIDS’e neden olmakla birlikte prevalansı daha düşük olan HIV-2 HIV-1’e göre daha zayıf bir virüstür. Bulaşma özelliği daha azdır (Lever 2009), hastalığın oluşma süresi daha uzun olup (Levey 2007), klinik bulgular daha geç ortaya çıkar. HIV-2 ile oluşan enfeksiyonda mortalite de HIV-1 ile oluşan enfeksiyona göre daha düşüktür (Özbal 2007).
2.2. Genetik Yapı
HIV, Retrovirüsler ailesinin Lentivirüs alt ailesine üye bir virüs tipidir. Lenti yavaş anlamına gelir. Dolayısıyla bu tür virüslerin oluşturdukları enfeksiyonlarda kişinin enfekte olması ile ciddi semptomların ortaya çıkışı arasında uzun bir süre vardır. Genetik materyal olarak DNA taşıyan normal virüslerin tersine Retrovirüsler yapılarında RNA barındırırlar (Card ve ark. 2008).
HIV, 100-120 nm çapında büyüklüğe sahip sferik yapıda bir virüstür (Şekil 1). RNA genomunu içeren koni şeklindeki nükleokapsidi (özyapı) bir lipit membran çevreler (Sierra ve ark. 2005). Her virüste iki adet tek iplikli RNA bulunur. RNA’nın her bir ipliği virüs genlerinin kopyasına sahiptir. Kapsid içerisinde aynı zamanda iki molekül HIV revers transkriptaz enzimi (RT) bulunur (Card ve ark. 2008). Retrovirüsler, genetik bilgilerini bu enzimi kullanarak dönüştürme yeteneğine sahiptir. RT enzimi RNA genomunu çift iplikli DNA haline çevirir. Bu DNA daha sonra enfekte hücre kromozomuna entegre edilir ve
‘provirüs’ adını alır (Lever 2009).
Viral zarf yüzeyinden dışarıya doğru yönelmiş kompleks proteinler ‘çıkıntı’
olarak ifade edilir. Bu çıkıntılar HIV’in konak hücreye bağlanmasını sağlayan donanımlardır. Her HIV virüsü ortalama 72 adet çıkıntıya sahiptir. Her bir çıkıntı gövde ve başlık olmak üzere iki kısımdan oluşmuştur (Card ve ark 2008). Her bir gövde 3 transmembran glikoprotein (gp41) ve her bir başlık 3 yüzey
3
glikoproteinden (gp120) oluşur. Bunlar non-kovalent bağlarla birleşmiş haldedir (Roux ve Taylor 2007, Card ve ark. 2008).
Şekil 2.1. Hıv’ın yapısı (Anonim 2015a)
HIV, 3 adet gene sahiptir: Grup spesifik antijen (Gag), polimeraz (Pol) ve zarf (Env). Bu genlerin yanısıra iki düzenleyici protein (Transkripsiyonel transaktivatör-Tat ve virüs gen ekspresyonunu düzenleyici-Rev) ve dört yardımcı protein (Negatif efektör-Nef, viral enfektivite faktörü-Vif ve viral proteinler r [Vpr] ve u [Vpu]) de HIV virüsünde bulunur (Sierra ve ark. 2005).
Bunlar kopyalama, hücre içi taşınma, viral RNA dönüşümünün kontrolu ve enfektivitenin devamını sağlama gibi önemli görevler üstlenir (Lever 2009).
Env geni prekürsör bir glikoprotein olan gp160’a dönüştürülür (Lever 2009). Golgi aparatında bulunan proteaz enzimleri aracılığıyla gp160, gp41 ve gp120’yi oluşturmak üzere ikiye ayrılır (Levey 2007, Lever 2009). Gp41 önce hücre membranının içerisindeki zarf glikoprotein kompleksine sonra virüs zarfına bağlanır. Gp120 hücre yüzey reseptör proteinleri için tanıma yöresi taşır.
HIV bu yöre vasıtasıyla başta CD4 hücrelerine ve koreseptörlere bağlanır. Viral zarf ve hücre membranının füzyonunu ise gp41 sağlar (Yılmaz 1999, Freed ve Martin 2007).
Gag geni de viral proteazlar tarafından açılan bir poliprotein prekürsörü (Pr55) oluşturmak üzere dönüşüme uğrar. Pr55 tomurcuklanmaya hazırlanan virüs ile birleşir ve bölünme gerçekleşir. Sonuçta virüs partikülünün iç zarını
4
oluşturan p17 matriks protein (MA) ortama salınır (Lever 2009). MA, gag proteininin toplanma yöresini hedeflemesi için gerekli sinyalleri sağlar (Adamson ve Freed 2010). Diğer bölünme ürünlerinden p24 kapsid proteini (CA) yüksek hidrofob özelliği ile kapsid yapısının temel elemanıdır. Olgunlaşmamış virüs partiküllerinin toplanması için gerekli gag-gag etkileşimlerine aracılık eder (Ustaçelebi 1998,1999, Lever 2009). Diğer bir bölünme ürünü p9 nükleokapsid proteindir (NC). Virüs partikülünde RNA genomuna bağlanarak onu örter. Ayrıca toplanma sırasında gag-gag etkileşimlerini destekler. Gag prekürsöründen ayrıldıktan sonra revers transkripsiyonu ve entegrasyonu stimüle etmek görevini üstlenir (Lever 2009, Adamson ve Freed 2010). Son bölünme ürünü ise virüsün tomurcuklanmasını olanaklı kılan ve vpr proteinine bağlanan p6 proteinidir (Lever 2009).
Pol geni gag-pol füzyon poliproteinini (pr160) oluşturur. Bu lipoprotein, önce virüs partikülü ile birleşir; sonra virüsün enzimatik komponentlerini oluşturmak üzere bölünür. Bölünme sonucunda replikasyon sırasında RNA’nın çift zincirli DNA şeklinde kopyalanmasını sağlayan RT enzimi, partikül içerisinde yarılarak gag proteinlerini oluşturan proteaz (PR) ve hedef hücre kromozomlarındaki çift iplikli proviral DNA (dsDNA) içerisine girerek proviral DNA’nın konak hücre genomu ile birleşmesini sağlayan integraz (IN) enzimleri oluşur (Ustaçelebi 1998,1999).
Yardımcı proteinlerden vif düzenleyici bir viral proteindir. Vif proteininin APOBEC3G’nin virüslere entegrasyonunu bloke ettiği ve parçalanmasını sağladığı son zamanlarda saptanmıştır (Wang ve ark. 2007,Lever 2009). Diğer yardımcı protein vpr, hücre döngüsünün durmasını sağlayabilir ve enfekte hücrelerdeki doğal öldürücü hücrelerin reseptörlerini etkileyebilir. Vpu ise hücreden virüsün çıkmasını kolaylaştırır. Ayrıca son zamanlarda yapılan çalışmalar ile virüs tomurcuklanması üzerinde inhibitör etkiye sahip tetherini etkisiz hale getirdiği gösterilmiştir (Lever 2009). HIV-2 virüsü vpu yerine vpx proteini barındırır (Levey 2007).
Düzenleyici bir protein olan Tat transkripsiyonun güçlü bir düzenleyicisidir.
HIV replikasyonunu düzenlemede transaktivatör rolü oynar. Bunun için yeni kopyalanmış viral mRNA’ların 5’ ucunda bulunan “Tat-duyarlı bölge’ye (Transaktivasyon yanıt bölgesi, TAR) bağlanarak hücresel RNA polimeraz II’nin aktivitesinin çok artmasına neden olur. Bu da viral protein miktarının çoğalması
5
ile sonuçlanır (Levey 2007, Fred ve Martin 2007, Lever 2009).
Diğer düzenleyici protein Rev, viral RNA’da bulunan “Rev’e duyarlı element”e (RRE) bağlanarak birbirine eklenmemiş RNA’ların nukleustan çıkarak sitoplazmaya girmelerini ve progeni üretimi için gerekli tam uzunlukta proteinlerin oluşmasını sağlar. Ayrıca hücre döngüsünün erken ve geç aşamalarını kontrol eder (Levey 2007, Fred ve Martin 2007, Lever 2009).
Viral patojenezin önemli bir etkeni olan Nef proteini CD4 ve majör doku uyuşması kompleksi (MHC-I) sayısını baskılar. Böylece immün yanıtlardaki normal hücre-hücre etkileşmelerini bozmuş olur. Ayrıca hücre aktivasyon yolaklarını module eder ve partikül enfektivitesini artırır (Fred ve Martin 2007, Lever 2009).
2.3 Replikasyon
HIV’in replikasyon döngüsü kompleks ve hem viral hem de konak hücre faktörlerine bağlı çok aşamalı bir işlemdir (Fred ve Martin 2007) (Şekil 2). HIV virüsünün vücuttaki hedefi, bağışıklık sisteminde görevli bir tür lenfosit olan T hücreleridir. Bu hücrelerin yüzeyinde bulunan CD4 reseptörü ile HIV lipid membranında bulunan yüzey glikoproteini gp120 arasında kimyasal bir bağ oluşur. Daha sonra gp120, konak hücre yüzeyinde bulunan CCR5 veya CXCR4 koreseptörlerine bağlanır. Lentivirüslerin hücre membranı ile füzyon yapabilmek için fıçı şeklindeki bu kemokin reseptörlerine ihtiyaçları vardır (Rollins 1997,Kwong ve ark. 1998, Card ve ark.2008). Koreseptöre bağlanma membran füzyonuna aracılık eden gp120 ve gp41’de bir seri konformasyonel değişikliğe neden olur (Doms 2000, Melikyan 2008). Birkaç gp41 molekülü hidrofobik bir uca sahip sarmal bir yapı oluşturur. Bu uç, hedef hücre membranına penetrasyona izin verir. Virüs zarfı hücre membranına yaklaşır ve füzyon oluşur (Lever 2009). Füzyon sonucu kapsid hedef hücrenin sitoplazmasına salınır.
Kapsid yapısının içerisindeki RT enzimi diploid RNA genomunu dsDNA haline dönüştürmeye başlar. Bunun için önce RNA ipliği RT enziminin ribonükleaz H (RNaz H) fonksiyonu tarafından degredasyona uğratılır ve DNA iplikleri sentez edilir. HIV DNA’sının her iki ucunda uzun terminal tekrar dizileri (LTR) vardır.
LTR’ler transkripsiyonu aktive etme yeteneğine sahip hücresel proteinler için bağlanma yöreleri taşır (Joshi ve Joshi 1996, Hardy 2004, Stevenson 2006).
6
Oluşan proviral DNA konak hücrenin nukleusuna girer ve p17 proteinde bulunan nuklear bir lokalizasyon sinyali (NLS), vpr ve integraz enzimi bu taşıma işlemine yardımcı olur. IN, önce virüs DNA’sı içine girerek kademeli bir kesme işlemi yapar ve DNA’yı konak hücre DNA’sına kovalan bağlarla birleştirir. Bu işleme entegrasyon adı verilir. Konak hücre DNA’sına giren HIV DNA’sı ise provirüs olarak adlandırılır. Provirüs kendi başına replikatiftir. Virüs bu safhaya ulaşırsa enfeksiyon kalıcıdır. Provirüs bu entegrasyon işlemini gerçekleştirdiğinde yıllarca sessiz kalabilir veya aktif olarak yeni virüsler yapabilir (Zhu 2004, Rubbert ve ark 2006).
Provirüs transkripsiyon işlemi sırasında RNA molekülleri üretmeye başlar.
Daha sonra Tat ve Rev proteinleri sitoplazmadan nukleusa geçer. Nukleusta Tat proteininin TAR RNA yapısına bağlanması ile viral RNA polimeraz aktive olur ve DNA’yı iki parçaya ayırır. Ayrılanların her biri yeni bir RNA oluşturmak için kullanılır. Translasyon esnasında konak hücre sitoplazmasındaki yapılar mRNA’yı protein ve enzimlerin yapımında kullanırlar. Sonuçta MA, CA, NC ve p6 proteinlerinden oluşan gag poliprotein prekürsörü, viral enzimler proteaz (PR), RT ve IN’i kodlayan gag-pol poliprotein prekürsörü ile env glikoprekürsörü (gp160) oluşturulur (Swanstrom ve Wills 1997, Lever 2009).
Oluşan bu protein komponentleri ile birlikte viral RNA konak hücre membranının içerisinde bir araya gelir. Viral komponentlerin her birinin birleşmesini kontrol eden gag tarafından toplanma yönlendirilir. Virüs partikül üretimi yeni oluşmuş virüsün plazma membranından tomurcuklanması ile tamamlanır (Adamson ve Freed 2007, Lever 2009). Viral partikül enfekte konak hücreden dışarı çıktığında proteinleri konak hücre membranından alır. Bunlar partikülün viral zarfı olacaktır. HIV-1 virüsü ile birleşmiş bir hücresel protein olan siklofilin virüsü diğer hücresel bir protein olan tripartit motif protein 5α’nın (TRIM 5α) giriş sonrası inhibitör etkisinden korur. Viral döngünün son aşamasında PR, HIV partikül özyapısındaki uzun protein ve enzim zincirlerini keser ve partikül bulaşıcı hale gelir. Bu aşamada HIV partikülü artık olgun hale gelmiştir (Card ve ark. 2008, Lever 2009).
7
Şekil 2.2 Hıv’in replikasyon döngüsü.(Anonim 2015b)
8 3. MOLEKÜLER MODELLEME
Bir molekülün atomlarının Kartezyen koordinatlarının, bağ uzunluklarının, bağ açılarının ve dihedral açılarının ( atomik pozisyonlarının );
Atom pozisyonlarına ve atom yarıçaplarına bağlı olarak moleküler yüzeylerinin;
Atomik mesafeleri, atom tipleri ve bağ düzenlemelerinden türetilerek enerjilerinin
matematiksel olarak ifadesine Moleküler Modelleme denir.
Diğer bir ifadeyle; moleküler modelleme, moleküler yapı , model inşası ve birleşimi için kullanılan fonksiyonlar üzerinde çalısan bir bilimdir. Moleküler modelleme, bir nesnenin sanal ortamda moleküler düzeyde simülasyonu üzerinde çalısır. Moleküler modellemede, maddenin moleküler yapısından yola çıkılarak, nesnelerin dısarıdan deformasyona uğraması ile olusan iç ve dış kuvvetlerin hesaplanmasını da göz önünde bulundurarak, nesnelerin deformasyon sonrası yeniden modellenmesini de ifade etmektedir. Ayrıca fiziksel potansiyel formüllerden yola çıkılarak nesnenin en son hali, deforme olmus nesnenin iç ve dış kuvvetleri hesaplanarak simüle edilmektedir (Yayla 2012).
İlk teorik hesaplamalar 1927 yılında Walter Heitler ve Fritz London tarafından yapılmıştır. 1940’larda bilgisayar ile karmaşık atomik sistemlerin dalga fonksiyonu çözümü yapılmıştır. Bilgisayar ile semi-empirik atomik orbital hesaplamaları 1950’ lerde İngiltere’ de yapılmıştır (Smith 1997).
Moleküler Modelleme; Fizik, Kimya, Biyoloji ve İlaç Sanayinde deneysel çalışmaları desteklemek ya da deneysel çalışma yapmadan elde edilecek sonuçları önceden tahmin edebilmek amacıyla kullanılmaktadır.
3.1 Giriş
Moleküler modelleme moleküllerin davranışını modellemek veya taklit etmek için kullanılan tüm teorik yöntem ve hesaplama teknikleri kapsar. Bu modelleme icin günümüzde bir çok bilgisayar paket programları mevcuttur.
Schrödinger denkleminin farkli yaklaşımlarla çözülmesi sonucu farklı programlar
9
ortaya çıkmıştır diyebiliriz. Moleküler Modelleme Yazılımlarını Kimyacılar çok yaygın olarak kullanmaktadır. Örneğin, farmakolojide yeni ilaçların geliştirilmesinde kimyacılar bilgisayar yazılımlarını kullanarak sentezden önce ilaçların yapıları hakkında ön bilgiye sahip olurlar.
Bu programlar sayesinde, moleküler modelleme ile,
Moleküler geometri
Moleküllerin geçiş halleri ve enerjileri
Kimyasal reaktivite
IR, UV ve NMR spektrumları
Substrate-enzim etkileşimleri
Self-assembly sistemlerin morfolojik özellikleri
Fizikokimyasal özellikler
hesaplanır. Deneysel çalışmaları desteklemek ya da deneysel çalışma yapmadan elde edilen sonuçları önceden tahmin edebilmek amacıya uygulanan hesapsal yöntemler şunlardır:
Moleküler Mekanik Yöntemler ( MM )
Elektronik Yapıya Dayalı Yöntemler
Yarı ampirik yöntemler
Ab initio yöntemler
Fonksiyonel Yoğunluk Moleküler Orbital Yöntemi 3.2 Moleküler Mekanik Yöntemler
Klasik mekaniğin moleküllere uygulanmasıyla yapılan hesapsal yöntemler moleküler mekanik hesaplamalardır. Bu yöntemde atomlar küreler olarak düşünülür ve kütleleri elementlerin türüne bağlıdır. Bu yöntemde kimyasal bağlar ise yaylar olarak ele alınır ve bağların tekli, ikili, üçlü olmasına göre yayların sertliği değişir. Moleküllerde birbirine bağlı atomlar arasında farklı kuvvetler olabilmektedir. İtme ve çekmelere sebep olabilecek yükler bulunabilmektedir. Bu da bağ açısı, dihedral açılar gibi değişimlere neden olabilmektedir. Bu tür parametreleri tanımlamak içi deneysel ve teorik metotlar kullanılmaktadır.
10
Moleküler mekanikte klasik fizikten farklı olarak Kolomb etkileşimleri gibi bazı eşitliklerde kullanılır. Sistemin toplam enerjisini hesaplayabilmek için mümkün olabilecek tüm etkileşimler göz önünde bulundurulmalıdır. Her bir enerji terimini hesaplamada kullanılan eşitliklerin tamamı ve birleştirilmiş parametreler kuvvet alanı olarak adlandırılmaktadır. Farklı molekül türleri için geliştirilmişfarklıkuvvet alanlarıbulunmaktadır.
Moleküler mekanik metodlar hızlı olması sebebiyle özellikle büyük moleküllerin hesaplanmasında oldukça iyi bir metottur. Fakat birçok bileşik çeşidi için elde edilebilecek parametrelerin eksik olmasından dolayı eksiklikleri bulunmaktadır. Bununla birlikte elektronları ve orbitalleri hesaba katmadığı için moleküllerin reaktivitesi ve kimyasal reaksiyonlar üzerinde çalışmalar için uygun değildir (Can 2015).
Moleküler mekanik çok hızlıdır.
Klasik fizik kanunlarının basit formülasyonlara sahip olması
Kullanılan kuvvet alanları deneysel verilerle birleştirilmiştir
Moleküler mekanik bağ yapmayan etkileşimleri belirleyemez.
Elektronik etkileri hesaba katmadığı için
Moleküler mekanik ilaç tasarımında çok kullanılır.
Kenetlenme (docking) teknikleri moleküler mekaniğe dayanır.
Gaussian, Amber, Cham, Hyperchem moleküler mekanik metodunu içeren paket programlarından birkaçıdır.
3.3 Kuantum Mekanik Yöntemler 3.3.1 Giriş
Elektronik yapı yöntemlerinin esas amacı atomların ve moleküllerin elektronik yapılarını belirlemektir. Elektronik yapı yöntemleri, kuantum mekaniği ilkelerini kullanarak moleküle ilişkin enerji ve diğer parametreleri Schrödinger denklemini çözerek elde eder.
11
Temelde elektronik yapı yöntemleri, moleküler orbitalleri atomik orbitallerin doğrusal bileşimleri olarak ifade ederek, çeşitli seküler determinantlar kurarlar.
Bu determinantlardan birçok integraller oluşur. Seküler determinantları çözerek dalga fonksiyonlarını belirler (Tekpetek 2014).
Çok küçük sistemler için dahi hesapların yapılabilmesi ve belli sonuçların elde edilmesi oldukça zordur. Bu nedenle elektronik yapı yöntemlerinde çözüm için bazı matematiksel ve fizikokimyasal yaklaşımlar kullanılır. Tüm bu yaklaşımlarda, elektronik dalga fonksiyonu ve elektronik enerji hesaplanır. Bu büyüklüklere dayalı olarak molekülün tüm fiziksel ve kimyasal bilgileri elde edilir.
Bu hesaplamalar aşağıda sıralandığı şekilde gerçekleşir:
i) Sistemin Hamilton operatörü yazılır ve Schrödinger denklemi kurulur.
ii)Dalga fonksiyonu için uygun bir matematiksel fonksiyon seçilir ve bu fonksiyonun değişken parametreleri bulunur.
iii) Parametrelerdeki değişkenlere göre molekülün enerjisi için;
d
d E H
*
*
(3.1)
eşitliğinin minimum değeri hesaplanır. Bu eşitlikte;
H : Hamilton Operatörü
: Moleküler dalga fonksiyonu :
* Dalga fonksiyonunun eşlenik kompleksi dir (Levine, 1988).
Elektronik Yapı Hesaplamaları, günümüzde kullanıldığı hali ile üç ana bölüme ayrılabilir.
1. Yarı ampirik yöntemler 2. Ab initio yöntemler
12 3. Fonksiyonel yoğunluk yöntemi
Daha çok sayıdaki molekülün yapısını belirleyebilmek için yarı ampirik yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler bazı yaklaşımlara göre Hamilton operatörünün basitleştirilmiş şeklini kullanırlar. Aynı zamanda, deneysel bulgulara dayalı özel parametrelere ihtiyaç duyarlar. Her iki yöntemin sonucunda da esas olarak elektronik dalga fonksiyonu ve elektronik enerji hesaplanır. Daha sonra bu büyüklüklere bağlı olarak molekülün tüm fiziksel ve kimyasal bilgileri elde edilebilir. Örneğin dayanıklı bir molekülün en düşük enerjisi bu molekülün temel konumundaki yapısına karşılık gelir ve bu şekilde moleküldeki tüm bağ uzunlukları ve bağ açıları hesaplanmış olur. Ayrıca bir reaksiyonda meydana gelen geçiş konumu komplekslerinin geometrik yapıları ve enerjileri de aynı yöntemlerle bulunabilir.
3.3.2 Yarı Amprik Yöntemler
Yarı ampirik yöntemler, moleküler mekanik yöntemleri gibi deneysel olarak belirlenmiş parametreleri kullanırlar. Ab initio yöntemleri gibi esas olarak kuantum mekaniksel yöntemlerdir. Yarı ampirik yöntemlerle ab initio yöntemler arasındaki esas fark, yarı-ampirik yöntemlerde büyük ölçüde yaklaşımların yapılmış olmasıdır. Bu yaklaşımlar sonucu, çok büyük sayıdaki terim hesaplanmaz. Yaklaşımlarda kullanılan parametrelerin deneysel bilgiye dayanarak kullanılıyor olması yöntemin kimyasal açıdan kullanılabilir ve güvenilir olmasını sağlar.
Yarı ampirik yöntemlerde integrallerin çoğu, spektroskopik veriler veya iyonlaşma enerjileri gibi fiziksel özelliklerden faydalanarak ve belli integralleri sıfıra eşitlemek için bir dizi kural kullanılarak hesaplanır.
Daha önce açıklanmış olan hesaplama yöntemlerinin çok sayıda elektron içeren büyük moleküllere uygulanması imkansızdır. Bilgisayar teknolojisinin gelişimi, ab initio hesaplamaların yapılabilmesini sağlamış olsa da polimer ve biyolojik moleküller gibi düzinelerce atom içeren büyük moleküller için bu yöntemler hala kullanılamamaktadır. Bu nedenle yarı ampirik yöntemlerin geliştirilmesi zorunlu olmuştur.
13
Yarı ampirik yöntemler bazı yaklaşımlara ve deney sonuçlarına dayalı olan parametrelere ihtiyaç duyarlar. Bu yöntemler, Hartree-Fock SCF yöntemi esasına dayanırlar. Yaklaşımlar yapılarak Fock matrisinin hesaplanması kolaylaştırılmıştır. Yöntemlerin güvenilirliği her şeyden önce parametrelerin doğru olmasına bağlıdır. Yarı ampirik yöntemler günümüzde yaygın olarak kullanılan popüler yöntemler olmakla birlikte, yeterli deneysel bilginin olmaması, uygulamalarında sorunlar çıkarmaktadır. Ayrıca parametrelerin optimize edilmesi çok fazla zaman almakta, birden fazla parametrenin aynı anda optimize edilmesi bazı zorluklar çıkarmaktadır. Çünkü parametrelerin bir bölümü birbirine bağlıdır.
Bir parametre optimize edilirken yapılan değişiklik, diğer parametrelerinde değişmesine neden olur. Kuantum mekaniksel yarı-ampirik yöntemler ilk olarak konjuge π sistemli moleküller için geliştirilmiştir.
Yarı ampirik yöntemler kuantum mekanik esaslara dayanır. Bu yöntemlerde hesaplamayı basitleştirmek için, deneysel verilerden çıkarılan parametreler mevcuttur. İncelenen kimyasal sistem için uygun mevcut parametrelere bağlı olarak Schröndinger eşitliği yaklaşık olarak çözülür.
Etkileşim integralleri için yaklaşık fonksiyonların kullanılmasıyla hesaplama süresi ab initio yöntemlerin hesaplama süresi ile karşılaştırılamayacak kadar azdır. Çok küçük sistemler için kullanılabilmesinin yanı sıra büyük kimyasal sistemler için de kullanılabilir (Foresman ve Frisch 1996).
Yarı-ampirik yöntemlerde hesaplamalar MOPAC, AMPAC, HYPER CHEM ve GAUSSIAN paket programları kullanılarak gerçekleştirilir. Pople ve arkadaşları (1965) tarafından geliştirilen CNDO, Austin Model l adı verilen AM1 yöntemi de Dewar ve arkadaşları (1985) tarafından, MNDO, yönteminden geliştirilmiştir. Bu yöntem esas olarak moleküldeki büyük itmeleri ortadan kaldırmak için MNDO yönteminin çekirdek-çekirdek itme fonksiyonlarında küçük bir değişiklik yapılmasıyla oluşturulmuştur. MNDO-PM olarak adlandırılan ve MNDO' nun üçüncü parametrizasyonu olduğunu göstermek için PM3 şeklinde gösterilen program ise en son geliştirilen yöntemlerden birisidir. Çok sayıda element için parametreleri aynı anda optimize edebilen bir yaklaşımdır. Son yıllarda MOPAC ve AMPAC gibi çeşitli moleküler orbital yöntemlerini yapısında bulunduran paket programlar geliştirilmiştir. Tablo 3.1’ de yarı ampirik hesaplamalarda kullanılan yöntemler gösterilmiştir.
14
Yarı deneysel Moleküler Orbital (MO) yöntemlerinde ab initio yöntemlerden farklı olarak, Fock matriksini oluşturan iki elektron integrallerinin büyük bir kısmı ihmal edilir. Bu yöntemler çok büyük moleküllere pratik olarak uygulanabilir. Bu nedenle, büyük sistemler için, genellikle büyük sistemlerde ab initio veya DFT (Yoğunluk Fonksiyonel Teori) optimizasyonları için başlangıç yapıyı oluşturmada kullanılır. Bir molekülün, moleküler orbitalleri, atomik yükleri ve titreşim modları gibi kalitatif bilgilerini elde etmekte ve ayrıca konformasyon ve sübstitüent etkilerinde enerjinin öngörülmesinde kullanılabilir. Kristal yapıların incelenmesinde deneysel X-Ray yapılarına uyumlu geometriler elde edilmesinde ve yapı-aktivite ilişkilerinin incelenmesinde kulanılabilir (Tekpetek 2014).
Tablo 3.1: Yarı-ampirik hesaplamalarda kullanılan yöntemler
Kısaltma Tanım
CNDO Complete Neglect of Differential
Overlap
INDO Itermediate Neglect of Differential
Overlap. Özellikle singlet
ve triplet yarılmalarında iyi sonuçlar verir.
MINDO/3 Modified INDO. Olusum ısılarında
dogruya yakın sonuçlar verir.
NDDO Neglect of Diatomic Differential
Overlap. Farklı atomlar
üzerindeki orbitaller arasındaki örtüsmeyi ihmal eder
MNDO Modified Neglect of Diatomic Overlap.
NDDO yaklasımına
benzer. Özellikle olusum ısıları ve diger moleküler özellikler
hakkında iyi sonuçlar verir.
AM1 Austin model 1. MNDO yönteminin
çekirdek-çekirdek itme
15
fonksiyonlarında küçük bir degisiklikle olusturulmustur.
PM3 MNDO yönteminin üçüncü
paremetrizasyonudur. En son
gelistirilen semiempirik moleküler orbital yöntemlerdendir.
PM5 Parametre metodu 5. en son gelistirilen
semiempirik yöntemdir.
1) MNDO, AM1, PM3 genellikle temel haldeki geometrilerin tespiti için uygundur. Ancak bu modellerin hiçbiri en düşük seviyeli ab initio hesabı kadar bile hassas değildir.
2) Yapı tespit edilmesinde PM3 genellikle üç yarı-deneysel model arasında en iyisidir. Özellikle periyodik cetvelin 2. sırasındaki ve daha ağır elementler için AM1 ve MNDO dan daha iyi sonuçlar vermektedir.
3) Yarı-deneysel yöntemlerin hepsi, normal temel durum ve nötral moleküllerle kıyaslandığında iyon ve serbest radikal halindeki molekülleri hesaplamada daha az başarılıdırlar. Ayrıca MNDO ve AM1 hidrojen bağı içeren sistemlerin tarifinde yeterince iyi değildirler. PM3 daha başarılıdır.
4) Her yarı-deneysel metodun kendine özgü bir yanı vardır. Örneğin PM3 ün amidlerin düzlemselliğini iyi bulamadığı ve bağlı olmayan hidrojenler arasındaki zayıf çekimleri iyi gösteremediği bilinmektedir. Genelde bu bilinen problemler çok sınırlı ve özel çeşit moleküllerde ortaya çıkar. Ve asıl nedeni böyle moleküllerin iyi parametrize edilmemişolmasıdır (Can 2015).
3.3.3 Ab initio moleküler orbital yöntemleri
Kuantum mekaniğine dayanır, bu yöntemler ile molekül yapısı ve buna bağlı özellikler hesaplanabilir, bir tepkime mekanizması tam olarak modellenebilir. Hesaplama süreci moleküler mekanik yöntemlere göre binlerce kere daha fazladır.
Gaussıan, Games Hyperchem, Cache vs... Ab-Initio yöntemlerinin kullanıldığı bazı paket programlardır.
Ab-Initio latincede ‘başlangıçtan itibaren’ anlamına gelir. Bu yöntem MM
16
ve yarıdenel yöntemlerden farklıdır, deneysel parametre kullanılmaz. Ab-Initio heseplamalarında iki farklı matematiksel yaklaşım kullanılır; Hartree Fock Self Consistent Field (HF-SCF) ve Density Functional Theory (DFT).
HF modelinde, enerji molekül dalga fonksiyonu ψ ye göre ifade edilir. HF modeli korelasyon yani etkileşim enerjisini dikkate almaz. Bu yaklaşım, molekül frekanslarının hesaplanması ve molekül geometrisinin tayini için uygundur.
DFT modelinde, molekül dalga fonksiyonları yerine, elektron olasılık yoğunluğu (ρ) hesaplanır, molekül özelliklerinin tayininde çok daha doğru sonuçlar verir.
Ab-Initio hesaplamaları varyasyonel bir hesaplama olduğundan hesaplanan yaklaşık enerji değeri, gerçek enerji değerine eşit veya gerçek enerji değerinden büyüktür (Akgün 2013). Ab initio ve yarı-denel molekül orbital yöntemlerinin her ikisi de orbitalleri hidrojen benzeri orbitaller olarak tanımlar.
Dalga fonksiyonlarında Slater veya Gaussian tipi orbitalleri kullanırlar. Bir sistemin değişim (varyasyon) yöntemi ile hesaplanması aşağıdaki basamakları içerir;
a- Sistem için bir Hamiltoniyen (H) yazılır,
b- Değişken parametreler içeren bir dalga fonksiyonu (Ψ) seçilir, c- Enerji minimuma ulaşması sağlanır (Tekpetek 2014) .
Ab-Initio hesaplamalarının avantajı, geniş aralıklı sistemler için kullanışlıdır, deneysel sonuçlara dayanmaz, bozulmuş ya da uyarılmış durumları hesaplar. Birçok sistem için yüksek kalitede sonuçlar sağlar.
Kullanılan molekül küçüldükçe doğruluk oranı artar. Dezavantajları, pahalı bir yöntemdir. Bilgisayarda çok büyük miktarda hafıza ve hard disk kaplar (Akgün 2013).
3.4 Schrödinger Denklemi
Kuantum mekaniksel hesaplamalarda, sistemlerin konumları dalga fonksiyonu ile gösterilir. Dalga fonksiyonu; sistemin koordinatlarına ve zamana bağlı olan bir fonksiyondur. Potansiyel enerji zamana göre değişmediğinden dalga fonksiyonu koordinatlara ve zamana bağlı olan iki ayrı fonksiyonun çarpımı olarak yazılabilir. Bunun sonucunda Schrödinger denklemi iki ayrı parçaya ayrılmış olur. Kimyasal hesaplamalarda odak nokta, zamandan bağımsız olan olaylardır ve bu nedenle zamandan bağımsız Schrödinger
17
denklemi kullanılır. Schrödinger denkleminin özdeğerleri değişik durağan hallere karşılık gelir.
Kuantum mekaniğinin temeli olan Schrödinger denklemi;
H=E (3.2)
şeklinde yazılabilir. Bu eşitlikte; H, Hamilton operatörü; E, sistemin toplam enerjisi; , dalga fonksiyonunu göstermektedir (Hanna 1981). Hamilton operatörü sistemin toplam enerji operatörüdür. E, sabit bir değer olup Hamilton operatörünün özdeğeridir. Dalga fonksiyonu ise Hamilton operatörünün öz fonksiyonudur. Moleküler sistemin Hamilton operatörü, elektronların ve çekirdeklerin kinetik enerji operatörleri, molekülde yer alan tüm yüklü tanecikler arasındaki elektrostatik etkileşimler, çekirdeklerin ve elektronların spin ve orbital hareketlerinden kaynaklanan manyetik momentler arasındaki etkileşimleri içerir. Bu nedenle, moleküler orbital hesaplamaları yapılırken moleküle ait olan Hamilton operatörünün tamamı kullanılmaz. İleride açıklanacak olan bazı yaklaşımların kullanımı ile çekirdeklere ait olan kinetik enerji operatörleri ihmal edilir ve manyetik etkileşimlerin olmadığı kabul edilir.
Sonuçta, molekülün elektronik enerjisi E'ye karşılık gelen Hamilton operatörü;
N n
i
n
i n
i J
ij i
n
i
r r
Z H
1 1
1
1 1
1
2 / 1/
2 1
(3.3) şeklini alır (Lowe, 1993).
Bu eşitlikte i ve j altlıkları n tane elektron için, ise N tane çekirdek için kullanılmıştır. Eşitlik (2.3)'deki birinci terim elektronların kinetik enerjisini, ikinci terim çekirdekler ile elektronlar arasındaki Coulomb çekme enerjisini, üçüncü terim ise elektronlar arasındaki itme enerjisini göstermektedir. Diğer taraftan çekirdekler arasındaki itme enerjisi bu eşitliğe konulmamıştır.
Çekirdekler arasında itme enerjisi;
1
1 1
) /
N N (
nn Z Z r
V (3.4)
18 dir. Bu eşitlikte;
Vnn : Çekirdek - çekirdek itme enerjisini, Z : Çekirdeklerin atom numarasını, r : Çekirdekler arası uzaklığı
göstermektedir. Moleküldeki toplam çekirdek sayısı N’dir. , altlıkları çekirdekler için kullanılmıştır.
3.5 Born-Oppenheimer Yaklaşımı
Kuantum mekaniği prensipleri ile molekülün yapısı açıklanırken, molekülü oluşturan atomların enerjileri ayrı ayrı hesaplanır. Daha sonra molekülün enerjisi bulunur. Molekülün enerjisi, atomların enerjilerinin toplamından küçükse molekül dayanıklıdır. İki enerji arasındaki fark moleküldeki bağ kuvvetinin bir ölçüsüdür. Fakat en basit molekül için bile kuantum mekaniği prensipleri kullanılarak hesapların yapılması ve sonuçların elde edilmesi çok zordur. Bu nedenle moleküler eşitliklerin yazılışında “Born-Oppenheimer Yaklaşımı” kullanılır.
Kuantum mekaniksel yarı-ampirik yöntemler ve ab inito yöntemlerin her ikisi de Born-Oppenheimer yaklaşımına dayanır. Hesaplamaların kolaylaşması açısından Born-Oppenheimer yaklaşımı büyük önem taşır.
Elektronlar ve çekirdekler arasındaki kütle farkı göz önünde bulundurulduğunda, elektronlar çekirdeklere oranla çok daha hafiftir.
Elektronların çekirdeklere göre çok büyük bir hızla hareket etmeleri Born- Oppenheimer yaklaşımının dayanak noktasını oluşturur. Born-Oppenheimer yaklaşımına göre, Schrödinger denklemini molekülde bulunan tüm tanecikler için çözmek yerine, çekirdekleri sabit noktalarda kabul ederek, sadece çekirdeklerin bu belirli yerlerinden doğan etki alanı içindeki elektronlar için çözmek yeterlidir (Lowe 1993).
Moleküler orbital dalga fonksiyonu nükleer ve elektronik dalga fonksiyonunun çarpımı olarak;
e
N
. (3.5)
19 yazılabilir.
Burada N, çekirdeklerin hareketini gösteren nükleer dalga fonksiyonu ve e, elektronların hareketini gösteren elektronik dalga fonksiyonudur. Born- Oppenheimer yaklaşımına göre, çekirdekler elektronlardan daha ağırdır ve bu nedenle hareketleri çok yavaştır. Çekirdeklerin hareketleri elektronların hareketleri yanında ihmal edilebilir. Ve molekülün dalga fonksiyonu olarak e
kullanılabilir. Born-Oppenheimer Yaklaşımının kullanılması ile molekülün enerji;
E=∫*H.dτ (3.6) ile gösterilir.
Bu eşitlikte; , moleküldeki tüm elektronların hareketlerini gösteren dalga fonksiyonu; H, çekirdeğin etki alanı içinde hareket etmekte olan elektronların toplam enerji operatörüdür.
Daha sonra çekirdeklerin yerleri değiştirilerek aynı hesaplamalar tekrar edilebilir ve bu şekilde molekülün potansiyel enerji yüzeyi elde edilebilir. Born- Oppenheimer yaklaşımının güvenilirliği ekzite haller için az olup, normal haldeki moleküller için iyidir.
3.6 Varyasyon Teoremi
Bu teorem molekülün gerçek dalga fonksiyonu yerine uygun olan yaklaşık bir fonksiyonun kullanılmasını sağlar.
*Hd E0’dır. (3.7)Burada,
: Elektronların hareketini gösteren yaklaşık dalga fonksiyonu,
Eo: Molekülün temel halindeki mümkün olan en düşük enerjisi
dir. Bu eşitlik “Varyasyon Teoremi” olarak bilinir. Varyasyon teoremi ile molekülün dalga fonksiyonu ve molekülün enerjisi kolaylıkla hesaplanabilir.
İntegralin minimum değeri molekülün enerjisinden biraz daha yüksektir, fakat
20
gerçek değerine oldukça yakın bir değerdir. Varyasyon teoremi ile moleküler orbital dalga fonksiyonu ve molekülün enerjisi hesaplanır. Bu teorem ile moleküler orbital hesaplamalarında molekül bir bütün olarak düşünülür ve atomik orbitallerin kullanılması ile moleküler orbital ve moleküler enerji seviyeleri hesaplanır (Hanna 1981).
3.7 Atomik Orbitallerin Doğrusal Kombinasyonu (LCAO)
LCAO "Atomik Orbitallerin Doğrusal Kombinasyonu" yöntemi; moleküllerin gerçek dalga fonksiyonları yerine kullanılabilecek uygun bir dalga fonksiyonu yazmak için kullanılan en yaygın yöntemdir. Buna göre, bir molekülde bulunan çekirdekler birbirlerinden çok uzak mesafelerde iseler kovalent bağları oluşturan elektronların atomik orbitallerde bulundukları kabul edilir. Bu nedenle, LCAO metodunda molekülün dalga fonksiyonu, kendisini oluşturan atomların dalga fonksiyonlarının toplamı olarak yazılabilir (Levine 1988).
=C11 + C22 + C3 3 +... + Cnn (3.8)
Bu eşitlikte;
: Moleküler dalga fonksiyonu
1, 2, 3 ,..., n : Atomik orbital dalga fonksiyonları C1, C2, C3,..., C4 : Dalga fonksiyonunun katsayıları
‘dır.
21 4. MATERYAL VE HESAPLAMA METODLARI 4.1 Gaussian 09
Bu çalışmada Gaussian 09W paket programı kullanılmıştır. Gauss 09 programlarının Gauss serisinin son ürünüdür. Bu elektronik yapı modelleme için state-of-the-art yetenekleri sağlar. Gauss 09 bilgisayar sistemleri geniş bir yelpazede için lisanslanmıştır. Gaussian 09W Moleküler mekanik, yarı-denel ve ab initio yöntemleri içeren oldukça kapsamlı bir programdır. Her üç yöntem için de çok sayıda teori ve temel set seçeneğine sahiptir. Gaussian 09W programı ile atom ve moleküllerin enerjileri hesaplanabilir, geometrik optimizasyonları yapılabilir ve enerji ye bağlı olan titreşim frekansları, kuvvet sabitleri ve dipol momentleri hesaplanabilir. Program potansiyel enerji yüzeyinde dolaşarak minimumlar, geçiş halleri ve tepkime güzergahını tarayabilir. Molekül dalga fonksiyonunun kararlılığını test edebilir. Ayrıca IR ve Raman spektrumları, termokimyasal özellikleri, bağ ve tepkime enerjileri, molekül orbitalleri, atom yükleri, çok kutuplu momentler, NMR ve manyetik duyarlılık titreşimsel şiddetleri, elektron ilgisi ve iyonlaşma enerjileri, kutuplanabilirlik ve hiperkutuplanma, elektrostatik potansiyel ve elektron yoğunluğu gibi pek çok özelliğin atomlar ve moleküller için hesaplanmasına sağlar. Tüm bu özellikler gaz fazında, çözelti içinde ve kristal yapılarında hesaplanabilir (Frish M. J. ve ark. 2009).
4.1.1 Gauss View 5.0.8
Gauss View 5.0.8 Gaussian paket programları için giriş (input) dosyaları hazırlamak ve gaussian çıktılarını görselleştirmek için hazırlanmış bir grafik ara yüzdür. Gauss view molekülleri görsel hale getirir onları istediğimiz gibi döndürmemize, hareket ettirmemize ve moleküllerde değişiklik yapmamıza olanak sağlar. Ayrıca karmaşık hesaplamalar için dahi kolaylıkla giriş dosyaları hazırlamamızı sağlar. Gaussian programı tarafından hesaplanan sonuçları grafiksel olarak incelememizi sağlar. Bu sonuçlar; optimize edilmiş moleküler yapılar, moleküler orbitaller, elektrostatik potansiyel yüzeyi, atomik yükler, IR, Raman, NMR, VCD spektrumları, titreşim frekanslarına bağlı normal mod animasyonları gibi sıralanabilir ( Foresman ve Frisch 1996 ).
22
4.2 Hartree-Fock Alan Teorisi, HF-SCF Yöntemi
Yarı-ampirik kuantum mekaniksel yöntemlerin ve ab initio yöntemlerin bir çoğunun başlangıç noktası Hartree-Fock alan yöntemidir. Yöntem ilk olarak D.R. Hartree tarafından ortaya atılmış ve daha sonradan V. Fock ve J.C. Slater tarafından geliştirilmiştir. Bazı geçiş yapılarını, kararlı moleküllerin yapılarını ve titreşim frekanslarını hesaplamada oldukça iyi olan bir metottur. Hartree-Fock teorisinin dayandığı yaklaşım, moleküldeki bir elektronun, diğer elektronların ve çekirdeklerin etkilerinden doğan enerjinin ortalaması kadar enerjili, küresel bir alan içinde hareket ettiğidir. Bu yaklaşımla Schrödinger denklemi sadece bu elektron ve ortalama potansiyel enerji için çözülür.
Moleküler orbital hesaplarını en karmaşık hale getiren elektron-elektron itme enerjisinin varlığıdır. Bu enerji elektron-elektron uzaklığı olan rij’ye bağlıdır.
Hartree-Fock alan teorisinin dayandığı yaklaşım, moleküldeki bir elektronun, diğer elektronların ve çekirdeklerin etkilerinden doğan enerjinin, ortalaması kadar enerjili küresel bir alan içinde hareket ettiğidir. Bu yaklaşım kullanılarak Schrödinger denklemi sadece bu elektron ve ortalama potansiyel enerji için çözülür. Bu çözümde, kürenin içindeki toplam elektrik yükünün elektronun yerine bağlı olduğu, elektron ile çekirdek arasındaki uzaklık değiştikçe bu yükünde değişeceği kabul edilir. Bu yaklaşım, diğer elektronların dalga fonksiyonlarının bilindiğini kabul eder. Gerçekte bu doğru olmadığından hesaplamalar dalga fonksiyonlarının yaklaşık şekillerinden başlar. Schrödinger denklemi bu elektron için çözülür ve atom veya moleküldeki tüm elektronlar için tekrarlanır. Birinci hesaplama aşamasının sonunda moleküldeki tüm elektronlar için geliştirilmiş dalga fonksiyonları elde edilir. Bu fonksiyonlar kullanılarak ortalama potansiyel enerji hesaplanır ve hemen ardından ikinci hesaplama aşamasına geçilir.
Hesaplamalara, bir aşama sonunda elde edilen geliştirilmiş dalga fonksiyonları, aşamanın başlangıcındaki dalga fonksiyonları ile aynı kalıncaya kadar devam edilir.
Bu teorinin en önemli problemi, moleküler bir sistem içindeki özellikle karşıt spinli elektronlar arasındaki korelasyonları tanımlamada yetersiz oluşudur. Elektron korelasyonu, elektronların birbiriyle etkileşmesinden gelen enerji katkıları olarak tanımlanır. HF dalga fonksiyonu, elektron korelasyonunu antisimetri nedeniyle kısmen göz önüne alır. SCF (self consistend field)
23
metodunda elektronların, diğer elektronların ortalama bir potansiyeli içinde hareket ettiği kabul edilir ve bir elektronun anlık konumu bir komşu elektronun varlığından etkilenmez. Gerçekte HF enerjisi, en düşük enerji ya da en doğru enerji değildir. Sistemin non-rölativistik enerjisi (deneysel enerji) ile HF enerjisi arasındaki fark korelasyon enerjisi olarak tanımlanır. Elektron korelasyonun ihmali bu teoriyi bazı amaçlar için uygunsuz yapar. Örneğin, korelasyonun ihmal edildiği bir hesaplama, H2 tamamıyla ayrışmış olsa da, H2 molekülündeki elektronların her iki çekirdek etrafında eşit zaman geçirdiğini varsayar. Denge yapıları için HF geometrileri ve enerjileri genellikle deneysel sonuçlarla uyum içindedir. Dengedeki türlerle ilgilenildiğinde korelasyon etkileri çok önemli değildir. Fakat yine de kantitatif sonuçlar gerektiğinde elektron korelasyon etkilerini göz önünde bulundurmak gerekir. Elektron korelasyon metotları post- SCF (variasyon teorisi) metotları olarak adlandırılır. Çünkü onlar, temel HF modeline korelasyon düzeltmeleri ekler.
Hartree-Fock metodu, N elektronun ortalama potansiyelinde elektronun enerji seviyeleri hesabıdır. Matematiksel olarak ifadesi, elektronların dalga fonksiyonu, N elektronun tek elektron fonksiyonlarının çarpımı olarak alınmasıdır.
N elektronlu bir sistem için Hamiltonianin genel formu:
(4.1)
Burada elektronlar 1,2,3,..., çekirdekler A,B,C,... olarak işaretlenmiştir.
Enerji ifadesini, sistemin toplam elektronik enerjisine etki eden üç tip etkileşimin genel bir formu şeklinde yazmak daha uygun olacaktır. Bunlardan ilki, çekirdek alanında hareket eden her bir elekronun potansiyel enerjisi vardır.
Enerjiye ikinci katkı, elektron çiftleri arasındaki elektrostatik itmelerden gelir. Bu etkileşimler, elektron-elektron arasındaki uzaklığa bağlıdır. Enerjiye üçüncü katkı ise değiş tokuş etkileşimidir (Tekpetek 2014).
24 4.3 Fonksiyonel Yoğunluk Yöntemleri (DFT)
DFT, 1964 yılında Hohenberg ve Kohn tarafından, atom ve moleküllerin elektronik yapısını incelemek için geliştirilen bir yöntemdir. Bu teori kuantum mekaniğinde Slater’ in çalışmalarına göre geliştirilmiştir.
Bu yöntem elektron yoğunluğuna ait genel bazı fonksiyoneller ile elektron korelasyonunu modellemektedir. DFT yöntemleri çok elektronlu dalga fonksiyonu ψ (r1,r2,….), yerine elektron yoğunluğunu ρ ( r ) kullanır. Yoğunluk Fonksiyonel Yöntemi’nin en önemli noktası korelasyon faktörlerini devreye katmasıdır. Hartree – Fock’ dan farklı olarak, korelasyon faktörünü eklemek çok büyük bir hesabı gerektirir. Fakat bu değişim katkısını tam olarak hesaplamak için bu teori gereklidir. Bu durumda en uygun tercih Yoğunluk Fonksiyonel Yöntemi ile bölgesel yoğunluk yaklaşımı yöntemini hibritleyerek korelasyon faktörünü hesaplamak ve bu enerjiyi Hartree – Fock enerjisine eklemektir.
Bir molekülün enerjisi veya diğer fiziksel büyüklükleri (kuantum mekaniğinin dalga fonksiyonu gösteriminde) Schrödinger denkleminin çözülmesi ile elde edilir. Schrödinger denklemi,
Hˆψ=Eψ (4.2 )
eşitliği ile verilir.
Burada H moleküldeki etkileşmeleri tanımlayan bir operatör, ψ moleküler dalga fonksiyonu, E ise moleküler sistemin farklı kararlı durumlarına karşılık gelen enerjileridir.
Bir molekülün elektronik enerjisi kuantum mekaniksel olarak kapalı formda,
Ee = ET + EV + EJ + EXC (4.3)
formülü ile ifade edilebilir.
Burada ET elektronların hareketinden kaynaklanan kinetik enerjisini, EV çekirdek - elektron çekim ve çekirdek çiftleri arasındaki itme potansiyel enerjisini, EJ elektron - elektron itme terimi (elektron yoğunluğunun Coulomb öz- etkileşimi olarak da tanımlanır), EXC = EX + EC ise değiş tokuş (EX) ve korelasyon (EC) terimidir ve elektron-elektron etkileşmelerinin geri kalan kısmını kapsar. Daha doğrusu; değiş tokuş enerjisi aynı spinli elektronlar arasındaki
25
etkileşim enerjisidir. Kuantum mekaniksel dalga fonksiyonunun antisimetrikliğinden dolayı ortaya çıkar. Korelasyon enerjisi ise farklı spinli elektronlar arasındaki etkileşme enerjisidir. Bu enerjinin büyüklükleri hakkında bir fikir edinmek için Ne atomunun enerjilerini verebiliriz. Atomik birimler cinsinden Ne atomunun hesaplanmış enerjileri:
Ee=129.4, ET =129 EV=312 EJ=66, EX=-12 EC =-0.4 atomik birim (Hartree) dir.
(1hartree(H) = 27.192 eV dur).
Eğer enerjinin açık ifadesi moleküler dalga fonksiyonu ψ' ye bağlı ise bu Hartree- Fock metodu olarak bilinir. HF modeli korelasyon yani etkileşim enerjisini dikkate almaz demiştik. Eğer enerji ifadesi elektron yoğunluğu ρ ‘ya bağlı ise bu yoğunluk fonksiyonu modeli DFT olarak bilinir. Yani yoğunluk fonksiyonu teorisi (DFT)' nin temel dayanak noktası; Elektronik sistemin enerjisini elektron yoğunluğuna bağlı olarak ifade etmesidir.
Yoğunluk fonksiyonu teorisinde ( DFT ) sıkça kullanılan üç temel kavramın tanımı şu şekildedir:
1. Elektron yoğunluğu, ρ= ρ(r): Herhangi bir noktadaki elektron yoğunluğudur.
2. Tek düze elektron gazı modeli: Bir bölgedeki yük dağılımının, sisteme düzenli dağılmış n tane elektron ve sistemi nötralize edecek kadar pozitif yükten oluştuğu varsayımına dayalı idealize edilmiş bir modeldir. Klasik DFT modelinde enerji ifadeleri elde edilirken elektron dağılımının, V hacimli bir küp içinde olduğu ve elektron yoğunluğunun p=n/V ile verildiği sistemde n, V → ∞ olduğu varsayımı yapılmıştır, yani p sabit kabul edilmiştir.
3. Fonksiyonel: Bağımsız x değişkenine bağımlı değişkene fonksiyon denilir ve F[/] ile gösterilir. Fonksiyonel kavramı yerine fonksiyon kavramı tercih edilecek fakat sembol gösterimi olduğu gibi kullanılacaktır. Örneğin Coulomb fonksiyoneli yerine Coulomb fonksiyonu veya Coulomb enerjisi ifadeleri kullanılacaktır Ee =
26
ET + EV + EJ + EXC ile verilen ve bizim bu çalışmamızda kullandığımız enerji fonksiyonlarını (fonksiyonelleri) daha detaylı olarak aşağıda incelenmiştir.
4.3.1. Lee -Yang-Parr korelasyon fonsiyonu
Lee-Yang-Parr 1988 yılında korelasyon enerjisi için yeni bir ifade türetti.
Bu ifade 1989 yılında Miehlich ve arkadaşlarınca daha sade ve hesaplama zamanını azaltacak şekilde sadeleştirildi. LYP korelasyon enerjisinin Miehlich formu şu şekildedir;
(4.4)
LYP korelasyon enerjisi He atomunun verilerinden türetilen 4 tane parametre içermektedir.
a=0,04918 b=0,132 c=0,2533 g=0,349 ile verilmektedir.
4.3.2 B3LYP Karma Yoğunluk Fonksiyoneli Teorisi
Dalga mekaniğine dayanan HF teorisinin değiş tokuş enerjisi için iyi sonuç vermemesi ve korelasyon enerjilerini hesaplayamaması diğer yandan
27
kinetik enerji için uygun bir İfade vermesi; saf DFT modellerinin ise değiş tokuş ve korelasyon enerjilerini daha iyi vermesi sebebiyle tam enerji ifadesi için saf HF veya saf DFT modelleri yerine bu modellerin her ikisinin de enerji ifadelerinin toplam elektronik enerji ifadesinde kullanılmaları neticesinde karma (melez, hibrit) modeller üretilmiştir. Bu modeller toplam enerji, bağ uzunlukları, iyonizasyon enerjileri v.b. büyüklükleri saf modellere nazaran daha iyi hesaplamaktır.
Bir hibrit model ile bu enerji ifadelerini birleştirerek yeni bir enerji ifadesi elde edebilir. Becke değiş tokuş ve korelasyon enerjisi XC için aşağıdaki karma modeli önermiştir;
( 4.5 )
Burada c' ler sabitlerdir. Becke' nin önerdiği karma modeller BLYP ve B3LYP’dir. Bu karma modellerden en iyi sonuç verenlerden biri; LYP korelasyon enerjili üç parametreli Becke karma modeli (B3LYP)' dir. B3LYP modelinde değiş tokuş ve korelesyon enerjisi,
(4.6) ifadesi ile verilmektedir.
Burada c0 , c1 ve c2 katsayıları deneysel değerlerden türetilmiş sabitlerdir ve değerleri sırası ile 0.2, 0.7, 0.8 dir. Dolayısı ile B3LYP modelinde bir molekülün toplam elektronik
(4.7) eşitliği ile ifade edilir.
Burada en önemli nokta, değiş tokuş ve korelasyon enerjileri ile ilgili ifadelerin tam olmaması nedeniyle bu enerjiler ile ilgili olarak DFT modelinde atomik ve
28
moleküler sistemlerde daha iyi sonuç verecek fonksiyonlar ile ilgili çalışmalar literatürde yoğun olarak devam etmektedir.
4.3.3 Temel setler ve 6-31-G(d) temel seti
Orbitallerin matematiksel tanımına temel set olarak tanımlanır. Bir moleküler orbital; moleküllerin atomlardan oluşması ve aynı cins atomların farklı cins moleküllerde benzer özellikler göstermeleri nedeni ile atomik orbitallerin çizgisel toplamları olarak yazılabilir. ψι orbitali ile φμ atomik orbitalleri arasındaki bağıntısı;
(4.8) eşitliği ile ifade edilir.
Burada Cμι moleküler orbital katsayıları olarak tanımlanmıştır. φμ atomik orbitallerini ise temel fonksiyonlar olarak adlandırabiliriz. Temel fonksiyonlar (basis functions),
(4.9)
Gaussian-tipi atomik fonksiyonlar şeklinde belirtilebilir. Burada a, fonksiyonun genişliğini belirleyen bir sabit; c ise α, l, m ve n ye bağlı bir sabittir.
6 ’ nın anlamı, dolu (core) orbitaller için altı tane Gaussian tipi orbital kullanıldığını gösterir. 31 valans elektronlarını belirtir. (d) ise d orbitallerinin dikkate alındığını belirtir.
29 5. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 5.1 Kuramsal Çalışmalar
Bu çalışmada, RN-18 yapısından yola çıkılarak oluşan yeni tür inhibitörlerin en uygun kuantum mekaniksel yöntem ile hesapsal olarak ayrıntılı bir şekilde incelendi ve yeni tür inhibitörler tanımlanması ve optimizasyonu gerçekleştirilmiştir.
5.2 Kuramsal Yöntemler
5.2.1 Moleküler Mekanik Hesaplamaları
Bu çalışmada incelenen, RN-18 yapısından yola çıkılarak oluşan yeni tür inhibitörlerin daha önce açıklanmış olan moleküler mekanik MM Yöntemi ile konformasyon analizi yapılmış ve en dayanıklı konformerleri belirlenmiştir. Her molekülün optimum geometrik parametreleri, termodinamik ve elektronik özellikleri hesaplanacaktır. Moleküler modelleme ve moleküler mekanik hesaplamaları için Gaussian 09w paket programı kullanılmıştır.
5.2.2 Moleküler Orbital Hesaplamaları
RN-18 yapısından yola çıkılarak oluşan yeni tür inhibitörlerin hesaplamaları gaz fazı ve sulu faz olarak iki ayrı fazda düşünülmüştür.
Moleküler mekanik yöntemi ile her birleşiğin en dayanıklı konformeri moleküler orbital hesaplamaları DFT/B3YLP/6-31G* yöntemleri ile yapılmıştır. Tüm moleküler orbital hesaplamalarında Gaussian 09w paket programı kullanılmıştır.
1 6. HESAPLAMALAR VE SONUÇ
6.1 Bileşiklerin Optimum Geometrik Yapısı
MM hesaplamaları sonucu elde edilen en dayanıklı konformerin geometrik yapısı DFT/B3LYP/6-31G* yöntemleri ile optimize edilmiştir. DFT hesaplamaları sonucu bulunan optimum geometrik yapı Tablo 6.1 de, optimum geometrik parametreler ise çizelge 6.1-10 da gösterilmiştir.
Tablo 6.1 Antiviral Aktivite İçin Seçilen Birleşikler
Bileşikler
RN-18 Molekülü
4f Molekülü
4l
Molekülü 5 Molekülü
2
8a Molekülü 8b Molekülü
11 Molekülü 12 Molekülü
17 Molekül 19 Molekül
