Klinik Enterobacterales İzolatlarında Plazmit Aracılı
mcr Kolistin Direnç Geninin Araştırılması
Investigation of Plasmid Mediated mcr Colistin Resistance Gene
in Clinical Enterobacterales Isolates
Esra ÖZKAYA1(ID), Celal Kurtuluş BURUK1(ID), İlknur TOSUN1(ID), Bayram TORAMAN2(ID), Neşe KAKLIKKAYA1(ID), Faruk AYDIN1(ID)
1 Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Trabzon.
1 Karadeniz Technical University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Trabzon, Turkey. 2 Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Trabzon.
2 Karadeniz Technical University Faculty of Medicine, Department of Medical Biology, Trabzon, Turkey.
* Bu çalışma, 5. Ulusal Klinik Mikrobiyoloji Kongresi (28 Ekim-01 Kasım 2019, İzmir, Türkiye)’nde sözlü sunum olarak sunulmuştur.
ÖZ
Çoklu ilaca dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlarda karbapenemler, karbapeneme dirençli olanlarda ise kolistin (polimiksin E) son çare olarak kullanılmaktadır. Gram-negatif bakterilerin sitoplazmik membranının geçirgenliğini bozarak hücre ölümüne neden olan kolistinin tüm dünyada kullanımının artışı direnç sorununu gündeme getirmiştir. Aktarılabilir kolistin direnci enzimi olan mcr, lipid A’ya fosfoetanola-min eklenip lipopolisakkaritleri modifiye ederek polimiksin direncine yol açan bir fosfoetanolafosfoetanola-min transfe-razdır. Bu çalışmada kolistine dirençli Enterobacterales izolatlarında en yaygın görülen plazmit aracılı bazı kolistin ve karbapenemaz direnç genlerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada Karadeniz Teknik Üni-versitesi Tıp Fakültesi Farabi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarında Ekim 2016-Eylül 2018 tarihleri arasında klinik birimlerde tedavi gören hastaların numunelerinde tespit edilen Enterobacterales izolatları kul-lanılmıştır. İzolatlar klasik yöntemlere ilaveten MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics, Almanya) ile tür düzeyinde tanımlanmıştır. Enterobacterales izolatlarının antibiyotik duyarlılıkları Phoenix (Becton Dickinson, ABD) oto-matize mikrobiyoloji sistemi ile çalışılmıştır ve “European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)” önerilerine göre değerlendirilmiştir. Kolistine dirençli bulunan izolatlarda ve duyarlı saptanan ancak kolistin duyarlılık test sonucu hasta raporuna eklenmesi gereken izolatlarda kolistin duyarlılık testleri EUCAST standartlarına uygun olarak sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle tekrarlanmıştır. Kolistine dirençli Ente-robacterales izolatlarında EUCAST önerileri doğrultusunda genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL), AmpC beta-laktamaz ve karbapenemaz varlığı fenotipik yöntemlerle araştırılmıştır. Ayrıca, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiyle mcr-1-5, blaOXA-48, blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP direnç genleri araştırılmış, ardından amplifiye edilen ürünlerin nükleotit dizi analizleri yapılmıştır. Çalışmamızda, farklı klinik birimlerde tedavi gören 7535 hastaya ait 14657 Enterobacterales izolatı retrospektif olarak irdelendiğinde en sık
Esche-richia coli %61.2 (n= 8968), Klebsiella pneumoniae %22.7 (n= 3334) ve Enterobacter cloacae %6.9 (n= 1005)
olduğu görülmüştür. Karbapenem direnci toplamda 894 izolatta tespit edilmiş olup; Ekim 2016-Eylül 2017 Geliş Tarihi (Received): 21.07.2019 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 10.12.2019
tarihleri arasında izole edilen 7135 izolatın %5.8 (n= 412)’i, Ekim 2017-Eylül 2018 tarihleri arasında izole edilen 7522 izolatın %6.4 (n= 482)’ü dirençli bulunmuştur. Tüm izolatlar içinde kolistine dirençli bulunan izolatlar Ekim 2016-Eylül 2017 tarihleri arasında 65 (%0.9) iken, Ekim 2017-Eylül 2018 tarihleri arasında 97 (%1.3)’dir. Aynı hastaya ait farklı örneklerdeki aynı etken üremelerinde sadece ilk izolatlar çalışmaya dahil edilerek kolistine dirençli 46 izolat seçilmiştir. Stok kültürden üretilemeyen 6 izolat çalışma materyalinden çıkarılmıştır. Çalışmaya dahil edilen kolistine dirençli 40 Enterobacterales izolatının 13 (%32.5)’ü 2017, 27 (%67.5)’si 2018 yılında izole edilmiştir. Bu izolatların 22’sinde GSBL, 6’sında AmpC beta-laktamaz, 15’inde karbapenem direnci fenotipik yöntemlerle tespit edilmiştir. Bu işlemlerin ardından PCR yöntemiyle 2 izolatta
mcr-1, 2 izolatta blaOXA-48, 1 izolatta blaVIM, 1 izolatta blaKPC ve blaOXA-48 birlikteliği, 5 izolatta blaNDM ve
bla-OXA-48 birlikteliği tespit edilmiştir. mcr-1 saptanan izolatlarda nükleotit dizi analizi ile doğrulama yapılmıştır.
Tespit edilen mcr-1 genleri hastanemizde tedavi gören 65 yaş üstü 2 kadın hastanın idrar kültürü örneklerin-de üreyen E.coli izolatlarında bulunmuştur. Bu hastalardan 1’inörneklerin-de test edilen antibiyotikler arasında saörneklerin-dece ampisiline direnç gözlenmiş, diğerinde ise ampisilin, amoksisilin-klavulonik asit ve siprofloksasine direnç belirlenmiştir. Sonuç olarak, yayınımız literatürde ulaşabildiğimiz kadarıyla ülkemizde klinik örneklerde mcr-1 geni varlığını gösteren ve DNA dizi analizi ile doğrulanmış ilk çalışmadır. Çoklu ilaç direnci görülmeyen izolatlarda mcr geninin saptanmış olması tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında kolistin duyarlılık testi çalı-şılmasının önemini bir kez daha gözler önüne sermektedir. Ayrıca çalışmamızda farklı direnç genlerini bir arada içeren izolatların saptanmış olması, karbapenem ve kolistin direncinin yayılımının beklenenden daha hızlı olabileceğini bir kez daha hatırlatmıştır.
Anahtar kelimeler: Enterobacterales; kolistin direnci; karbapenem direnci; mcr-1 geni.
ABSTRACT
Carbapenems are used in the treatment of infections caused by multidrug-resistant bacteria and co-listin (polymyxin E) is used as the last choice of antimicrobial agent in those resistant to carbapenems. The worldwide and increased use of colistin, which causes cell death by disrupting the permeability of the cytoplasmic membrane of gram-negative bacteria, raised the problem of resistance. The transferable colistin resistance enzyme mcr, is a phosphoethanolamine transferase that adds phosphoethanolamine to lipid A and modifies lipopolysaccharides, leading to polymyxin resistance. The aim of this study was to investigate some of the most prevalent plasmid mediated colistin and carbapenemase resistance genes in colistin resistant Enterobacterales isolates. Enterobacterales isolates which were isolated in the samples of patients treated in the clinical units between October 2016 and September 2018 in the Karadeniz Techni-cal University Faculty of Medicine Farabi Hospital MediTechni-cal Microbiology Laboratory were included in the study. In addition to conventional methods, isolates were identified to the species level by MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Germany). The antibiotic susceptibilities of Enterobacterales isolates were studied by an automated microbiology system (Phoenix, Becton Dickinson, USA) and evaluated according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) criteria. In isolates that are resistant to colistin, and the isolates that are found to be sensitive but should be included in the patient report of the colistin susceptibility test, colistin susceptibility tests were repeated with liquid microdilution method in accordance with EUCAST standards. The presence of extended spectrum beta-lactamase (ESBL), AmpC beta-lactamase and carbapenemase were determined by phenotypic methods according to EUCAST recommendations in colistin resistant Enterobacterales isolates. Furthermore, resistance genes of mcr-1-5, blaOXA-48, blaKPC,
detected in 22, AmpC beta-lactamase was detected in 6, carbapenem resistance was detected in 15 of them by phenotypic methods. As a result of PCR analysis, mcr-1 gene detected in 2 isolates, blaOXA-48 in 2 isolates, blaVIM in 1 isolate, blaKPC and blaOXA-48 in 1 isolate, blaNDM and blaOXA-48 in 5 isolates. These results were confirmed by sequencing of the PCR products. The mcr-1 genes were found in E.coli isolates grown in urine culture samples of 2 women over 65 years of age treated in our hospital. Among the antibiotics tes-ted, only ampicillin resistance was observed in 1 of the patients, whereas ampicillin, amoxicillin-clavulanate and ciprofloxacin resistance were detected in the other. In conclusion, as far as we can reach in the literature our publication is the first study showing the presence of mcr-1 gene in clinical samples in our country and confirmed by DNA sequence analysis. The detection of mcr gene in isolates without multidrug resistance showed once again the importance of colistin susceptibility testing in the laboratories. In addition, the presence of isolates containing more than one resistance genes in our study, suggests that the spread of carbapenem and colistin resistance may be faster than expected.
Keywords: Enterobacterales; resistance to colistin; resistance to carbapenems; mcr-1 gene.
GİRİŞ
Karbapenemler ve kolistin günümüzde özellikle immün sistemi baskılanmış hastalar-daki gram-negatif bakteri enfeksiyonlarında hayat kurtarıcıdır. Nitekim, genişlemiş spekt-rumlu beta-laktamaz (GSBL) üreten çoklu ilaca dirençli bakterilerin neden olduğu enfek-siyonlarda karbapenemler, karbapeneme de dirençli olanlarda ise kolistin (polimiksin E) son çare olarak kullanılmaktadır1,2. Gram-negatif bakterilerin sitoplazmik membranının
geçirgenliğini bozarak hücre ölümüne neden olan kolistinin tüm dünyada kullanımının artışı direnç sorununu yanında getirmiştir1,3. Çin’de Lui ve arkadaşları, 2015 yılında
Ente-robacterales izolatlarında plazmit aracılı mcr-1 kolistin direnç geninin varlığını gösterene kadar, kolistin direncinin yalnızca kromozomal mutasyonlardan kaynaklandığı bilinmek-teydi1,4. Mcr-1 enzimi, lipid A’ya fosfoetanolamin eklenip lipopolisakkaritleri modifiye
ederek polimiksin direncine yol açan bir fosfoetanolamin transferazdır3. mcr-1’in
tespi-tinden kısa bir süre sonra diğer Mcr homologlarının (mcr-2-9) bildirimleri yapılmıştır ve direnç genlerinin izolatlar arasında transfer olabileceği gösterilmiştir5,6.
Çalışmamızda Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi Farabi Hastanesi Tıbbi Mikro-biyoloji Laboratuvarında, Ekim 2016-Eylül 2018 tarihleri arasında çeşitli klinik örneklerden izole edilen kolistine dirençli Enterobacterales ailesi üyesi izolatlarda en yaygın görülen plazmit aracılı bazı kolistin ve karbapenemaz direnç genlerinin araştırılması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Bu çalışma, Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi Bilimsel Araştırmalar Etik Kurulu onayı ile gerçekleştirildi (Tarih: 31.12.2018 ve Karar no: 24237859-10).
Bakteri İzolatları
Bu çalışmada, Ekim 2016-Eylül 2018 tarihleri arasında laboratuvarımızda klinik örnek-lerden izole edilen ve uygun şartlarda saklanan Enterobacterales izolatları kullanıldı.
Enterobacterales İzolatlarının Tanımlanması
besiyer-lerine ekilerek 24-48 saat 35-37ºC’de aerobik ortamda inkübe edildi ve üreyen koloniler değerlendirmeye alındı. Mikroskobik incelemede gram-negatif basil görünümünde olan koloniler, klasik yöntemlere ilaveten MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Almanya) ile üre-tici firma önerileri doğrultusunda tür düzeyinde tanımlandı.
Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri ve Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MİK) Tayini
Enterobacterales olarak tanımlanan izolatların antibiyotik duyarlılıkları Phoenix (Bec-ton Dickinson, ABD) otomatize mikrobiyoloji sistemi ile çalışıldı ve “European Commit-tee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)” kriterlerine göre değerlendirildi7.
Uygunsuz direnç profillerindeki testler disk difüzyon, antibiyotik gradiyent ve/veya sıvı mikrodilüsyon testleri ile tekrarlandı.
Çalışma süresince tüm Enterobacterales izolatlarında otomatize sistem ile kolistin di-renci tarandı. Bu yöntemle dirençli bulunan izolatlarda ve duyarlı saptanan ancak kolistin duyarlılık test sonucu hasta raporuna eklenmesi gereken izolatlarda kolistin duyarlılık testleri EUCAST standartlarına uygun olarak sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile tekrarlandı7.
Kalite kontrol için Escherichia coli ATCC 25922 ve E.coli NCTC 13846 suşları kullanıldı7.
GSBL ve AmpC Beta-Laktamaz Saptanması
EUCAST önerileri doğrultusunda GSBL çift disk sinerji; AmpC beta-laktamaz testi ise sefoksitin/sefoksitin-boronik asit diskleri kullanılarak kombine disk yöntemi ile çalışıldı. Bu testlerde kalite kontrol için E.coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 ve
K.pneumoniae ATCC 13883 suşları kullanıldı8,9.
Karbapenemazların Belirlenmesi
Enterobacterales izolatlarında karbapenemaz varlığı karbapenem inaktivasyon yöntemi (CIM) kullanılarak araştırıldı10. Bu incelemeler sırasında KPC pozitif olan K.pneumoniae ATCC
BAA1705 ve KPC negatif olan K.pneumoniae BAA1706 kontrol suşları olarak kullanıldı. Moleküler analizler uygulanıncaya kadar izolatlar %15 gliserol (Merck, Almanya) içe-ren triptik soy buyyon besiyerinde (Fluka, 22092, ABD) -80ºC’de saklandı11.
İzolatların Yeniden Canlandırılması ve DNA İzolasyonu
Çalışmaya dahil edilen seçilmiş izolatlar stoklardan çıkarılarak %5 koyun kanlı agarda pasajlandı. Karbapenem ve kolistin duyarlılık testleri tekrarlandı. DNA izolasyonu için bir öze dolusu izolat, 500 µl steril saf su içinde süspanse edildi. 2500 x g’de bir dakika santrifüj edilerek süpernatan uzaklaştırıldı. Aynı işlem iki kez daha tekrar edildikten sonra çökelti 500 µl steril Tris-EDTA (TE), pH= 8 tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Çözelti kaynayan saf su içinde 10 dakika bekletildikten sonra 10.000 x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Steril saf su ile 10 kat sulandırılan süpernatan alikotlanarak kullanılıncaya kadar dondurucuda stoklandı.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
işlem için toplam 25 μl’lik hacmin içinde; 5 µl tampon (Promega Madison, WI, ABD), 1 U DNA polimeraz (Promega, Madison, WI, ABD), 0.2 mM dNTP karışımı (Ampliqon, Danimarka), 0.2 µM primer (Oligomer, Ankara), 1.5 mM MgCl2 ve 2 µl kalıp DNA olacak şekilde PCR karışımı hazırlandı. Kullanılan primerler Tablo I’de sunulmuştur. Amplifikasyon koşulları; 94°C’de 5 dakika başlangıç denatürasyonu sonrası, her döngü için 94°C’de 30 sn denatürasyon, 58°C’de 90 sn primer birleşmesi, 72°C’de 60 sn polimerizasyon aşamalarını içeren 25 döngü ve sonrasında 72°C’de 10 dakika son uzama süresi olarak düzenlendi. Cihazda (Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700, ABD) gerçekleştirilen
ampli-fikasyon işleminin sonucu, 0.5 μg/ml etidyum bromür içeren %1.5’lik agaroz jele yüklenen ürünlerin 110 Volt’da elektroforezi sonrası UV transilüminatörde gözlendi.
Nükleotit Dizi Analizi
Agaroz jel elektroforezi sonucunda büyüklükleri uyumlu olan bant gözlenen PCR ürün-leri temizlendikten sonra aynı PCR primerürün-leri ile dizileme döngüsü (cycle sequencing) gerçekleştirildi (BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Waltham, MA, ABD).
Dizileme işlemi ABI PRISM® 3100 Genetic analizörde (Applied Biosystems, ABD)
ger-Tablo I. Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminde Kullanılan Primerler
Primer adı Dizisi (5’-3’) Amplikon büyüklüğü (bp) Kaynak
CLR F F- CGG TCA GTC CGT TTG TTC 309 1
CLR R R- CTT GGT CGG TCT GTA GGG
MCR2 IF F- TGT TGC TTG TGC CGA TTG GA 567 5
MCR2 IR R- AGA TGG TAT TGT TGG TTG CTG
mcr3_900bp_fw F- AAA TAA AAA TTG TTC CGC TTA TG 929 12
mcr3_900bp_rev R- AAT GGA GAT CCC CGT TTT T
mcr4_1100bp_fw F- TCA CTT TCA TCA CTG CGT TG 1116 12
mcr4_1100bp_rev R- TTG GTC CAT GAC TAC CAA TG
MCR5_fw F- ATGCGGTTGTCTGCATTTATC 1644 13
MCR5_rev R- TCATTGTGGTTGTCCTTTTCTG
blaKPC F- GATACCACGTTCCGTCTGG 246 14
R- GCAGGTTCCGGTTTTGTCTC
blaOXA-48 F- TTGGTGGCATCGATTATCGG 744 15 R- GAGCACTTCTTTTGTGATGGC
blaNDM TCG ATC CCA ACG GTG ATA TT 287 15
TGG ATC AAG CAG GAG ATC AA
blaVIM AGT GGT GAG TAT CCG ACA G 261 16
ATG AAA GTG CGT GGA GAC
blaIMP CTA CCG CAG CAG AGT CTT TG 587 16
çekleştirildi. Elde edilen dizilerin benzerliği “Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)” kullanılarak araştırıldı.
BULGULAR
Çalışmamızda, farklı klinik birimlerde tedavi gören 7535 hastaya ait 14657 Enterobac-terales izolatı retrospektif olarak irdelenmiş ve en sık E.coli %61.2 (n= 8968), K.pneumoniae %22.7 (n= 3334) ve Enterobacter cloacae %6.9 (n= 1005) olduğu görülmüştür. Karbape-nem direnci toplamda 894 izolatta tespit edilmiş ve Ekim 2016-Eylül 2017 tarihleri ara-sında izole edilen 7135 izolatın %5.8 (n= 412)’i; Ekim 2017-Eylül 2018 tarihleri araara-sında izole edilen 7522 izolatın %6.4 (n= 482)’ü dirençli bulunmuştur. Tüm izolatlar içinde kolistine dirençli bulunan izolatlar Ekim 2016-Eylül 2017 tarihleri arasında 65 (%0.9) iken, Ekim 2017-Eylül 2018 tarihleri arasında 97 (%1.3) olarak tespit edilmiştir. Hastaların tekrarlayan üremelerinde sadece ilk örnekleri çalışmaya dahil edilerek kolistine dirençli 46 izolat seçilmiştir. Stok kültürden üretilemeyen 6 izolat çalışma materyalinden çıkarılmış-tır. Çalışmaya dahil edilen kolistine dirençli 40 Enterobacterales izolatının 13 (%32.5)’ü 2017, 27 (%67.5)’si 2018 yılında izole edilmiştir.
Çalışma süresince tüm Enterobacterales izolatlarında otomatize sistem kolistin direnci taranmıştır. Bu yöntemle dirençli bulunan izolatlar ve duyarlı saptanan ancak kolistin duyarlılık test sonucu hasta raporuna eklenmesi gereken izolatların kolistin duyarlılık testi EUCAST standartlarına uygun olarak sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile tekrarlanmıştır. Her iki çalışma arasında uyumsuzluk tespit edilmiştir. Tüm izolatlar içinde kolistine dirençli bulunan 40 izolat çalışmaya alınmıştır. Çalışmaya dahil edilen kolistine dirençli Entero-bacterales izolatlarının kolistin MİK oranları Tablo II’de sunulmuştur.
Kolistine dirençli izolatların 26 (%65.0)’sının hastane kaynaklı, 14 (%35.0)’ünün top-lum kaynaklı, bu izolatların da en sık (%42.5) yoğun bakım ünitelerinden gelen örnek-lerden olduğu saptanmıştır.
Çalışmaya dahil edilen kolistine dirençli Enterobacterales izolatlarının 22’sinde GSBL, altısında AmpC beta-laktamaz, 15’inde karbapenem direnci varlığı fenotipik yöntemlerle tespit edilmiştir. Bu işlemlerin ardından uygulanan PCR analizinde 2 izolatta mcr-1, 2 izolatta blaOXA-48, 1 izolatta blaVIM, 1 izolatta blaKPC ve blaOXA-48 birlikteliği, 5 izolatta
blaNDM ve blaOXA-48 birlikteliği tespit edilmiştir. PCR analizi yapılan izolatların karbapenem ve kolistin MİK değerleri, fenotipik ve genotipik test sonuçları Tablo III’te gösterilmiştir.
Tablo II. Kolistine Dirençli Enterobacterales İzolatlarının Kolistin MİK Oranları
Bakteri izolatları MİK aralığı (μg/ml) MİK50 MİK90
Klebsiella pneumoniae (n= 19) 8 -> 64 64 > 64
Escherichia coli (n= 14) 4-32 16 32
Klebsiella aerogenes (n= 4) 16-> 64 32 > 64
Tablo III. Kolistine Dirençli Enterobacterales İzolatlarının Karbapenem ve Kolistin MİK Değerleri, Fenotipik
ve Genotipik Test Sonuçları
İzolat
no Bakteri türü (μg/ml)ERT (μg/ml)İMP (μg/ml)MEM (μg/ml)CO GSBL AMP-C CIM genleriDirenç TK-1 K.pneumoniae > 1 4 4 64 Pozitif Negatif Pozitif blaOXA-48 +
blaNDM
TK-2 E.cloacae 1 2 ≤ 0.125 64 Negatif Pozitif Negatif
-TK-3 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Negatif Negatif Negatif -TK-4 K.pneumoniae ≤ 0.25 1 ≤ 0.125 32 Pozitif Negatif Negatif -TK-5 K.aerogenes 0.5 ≤ 0.25 ≤ 0.125 > 64 Negatif Pozitif Negatif -TK-6 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Negatif Negatif Negatif -TK-7 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Pozitif Negatif Negatif -TK-8 K.pneumoniae > 1 8 8 > 64 Pozitif Negatif Pozitif blaOXA-48 +
blaNDM TK-9 E.cloacae ≤ 0.25 1 ≤ 0.125 > 64 Negatif Negatif Pozitif -TK-10 K.pneumoniae > 1 8 > 8 > 64 Pozitif Negatif Pozitif blaOXA-48
TK-11 K.pneumoniae > 1 8 > 8 64 Pozitif Negatif Pozitif blaOXA-48 +
blaNDM
TK-12 K.aerogenes ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 16 Negatif Negatif Pozitif
-TK-13 E.coli ≤ 0.25 0.5 ≤ 0.125 Negatif Negatif Negatif mcr-1
TK-14 K.pneumoniae ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 16 Pozitif Negatif Negatif
-TK-15 K.pneumoniae > 1 > 8 > 8 8 Negatif Negatif Pozitif blaOXA-48
TK-16 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Pozitif Negatif Negatif
-TK-17 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Negatif Negatif Negatif
-TK-18 K.pneumoniae ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-19 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 16 Pozitif Negatif Negatif
-TK-20 K.pneumoniae 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-21 K.pneumoniae > 1 > 8 > 8 32 Pozitif Negatif Pozitif blaOXA-48 + blaKPC
TK-22 E.coli > 1 ≤ 0.25 1 > 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-23 K.pneumoniae > 1 ≤ 0.25 1 > 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-24 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 4 Negatif Negatif Negatif
-TK-25 K.pneumoniae > 1 ≤ 0.25 1 > 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-26 K.pneumoniae ≤ 0.25 0.5 ≤ 0.125 > 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-27 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Negatif Negatif Negatif
-TK-28 K.pneumoniae ≤ 0.25 0.5 ≤ 0.125 > 64 Negatif Negatif Negatif
-TK-29 K.pneumoniae ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 8 Pozitif Negatif Negatif
-TK-30 K.pneumoniae > 1 0.5 1 > 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-31 K.pneumoniae ≤ 0.25 1 ≤ 0.125 16 Negatif Negatif Negatif
-TK-32 K.aerogenes > 1 4 8 32 Negatif Negatif Pozitif blaOXA-48 +
blaNDM
mcr-1 pozitif PCR ürünü dizi analizinde 309 bp uzunluğunda veri elde edilmiştir. Dizi
Blast veri tabanında araştırıldığında mcr-1 dizileri ile %100 benzerlik görülmüştür. Tespit edilen mcr-1 genleri hastanemizde tedavi gören 65 yaş üstü 2 kadın hastanın idrar kültürü örneklerinde üreyen E.coli izolatlarında bulunmuştur. Bu hastalardan 1’inde test edilen antibiyotikler arasında sadece ampisiline karşı direnç gözlenmiş, diğerinde ise sadece ampisilin, amoksisilin-klavulonik asit ve siprofloksasine karşı direnç belirlenmiştir.
TARTIŞMA
Enterobacterales ailesi üyeleri hem sağlık hizmeti ile ilişkili hem de toplum kaynaklı enfeksiyonların en önemli nedenleri arasındadır17. Hastanelerde her klinikte görülse de,
enfeksiyonlarına en sık yoğun bakım ünitelerinde karşılaşılmakta ve sonuçları da daha ağır seyredebilmektedir18. Çalışmamıza dahil ettiğimiz kolistine dirençli Enterobacterales
izolatları da en sık olarak yoğun bakım ünitelerinden (%42.5) saptanmıştır.
Mobil kolistin direnç genlerinin ortaya çıkması, kolistin direncinin oluşması ve yayıl-ması ile ilgili verilerin yeniden gözden geçirilmesine neden olmuştur6. Çin’de mcr-1’in
keşfinden sonra dünyanın çeşitli bölgelerinden mcr genleri ile ilgili bildirimler yayımlan-mıştır5. Bu bildirimlerde Enterobacterales ailesinde sıklıkla mcr-1 ve mcr-3 tespit edilmiştir, mcr-2, mcr-4 ve mcr-5 varlığı oldukça nadirdir6. Ülkemizde mcr-1 geni ilk kez Kürekçi ve
arkadaşları19 tarafından tavuk etlerinden üretilmiş E.coli izolatlarında gösterilmiştir. Sarı
ve arkadaşları20 2017 yılında yayımladıkları çalışmada toplam 22 merkeze ait 329
En-terobacterales izolatında mcr-1 ve mcr-2 gen varlığını PCR yöntemi ile araştırmış ancak çalışmaya alınan izolatların hiçbirinde aranan gen bölgelerine rastlanmamıştır. Arabacı ve arkadaşları21 2018 yılında sundukları bildiride üç K.pneumoniae izolatında PCR yöntemi
ile mcr-1 genini tespit ettiklerini bildirmişler ancak ileri doğrulama testlerini gerçekleştire-memişlerdir. Kandemir ve arkadaşları22 Acinetobacter baumannii izolatında PCR yöntemi
ile elde ettikleri amplifikasyon ürünlerini DNA dizi analizi ile incelediklerinde, hedeflenen
Tablo III. Kolistine Dirençli Enterobacterales İzolatlarının Karbapenem ve Kolistin MİK Değerleri, Fenotipik
ve Genotipik Test Sonuçları (Devamı)
İzolat
no Bakteri türü (μg/ml)ERT (μg/ml)İMP (μg/ml)MEM (μg/ml)CO GSBL AMP-C CIM genleriDirenç
TK-34 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 16 Negatif Negatif Negatif mcr-1
TK-35 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 16 Pozitif Negatif Negatif
-TK-36 K.pneumoniae > 1 0.5 2 > 64 Pozitif Negatif Negatif
-TK-37 E.coli > 1 1 1 16 Pozitif Negatif Pozitif blaOXA-48 +
blaNDM
TK-38 E.coli ≤ 0.25 ≤ 0.25 ≤ 0.125 32 Pozitif Negatif Negatif
-TK-39 K.aerogenes > 1 8 4 8 Negatif Pozitif Negatif
-TK-40 K.pneumoniae ≤ 0.25 0.5 ≤ 0.125 8 Pozitif Negatif Negatif
bölge ile yaklaşık aynı bp uzunluğunda ancak %60-80 oranlarında benzerlik tespit ettik-lerini bildirmişler ve pozitif çıkan örneklerin DNA dizi analizi ile doğrulanmasının uygun olacağını önermişlerdir.
Bu çalışma, literatürde ulaşabildiğimiz kadarıyla ülkemizde klinik örneklerde mcr-1 geni varlığını gösteren ve DNA dizi analizi ile doğrulanmış ilk araştırmadır. Pozitif sonuçlardan birisi enfeksiyon hastalıkları polikliniğinde ayaktan takip edilen, diğeri ise iç hastalıkları nefroloji servisinde yatarak tedavi gören 65 yaş üstü iki kadın hastanın idrar kültürü ör-neklerinde etken olarak üreyen E.coli izolatlarında tespit edilmiştir. Ülkemizde tavuklardan izole edilen kolistine dirençli E.coli izolatlarının antibiyotik profilinde piperasiline, tetrasik-line, levofloksasine, siprofloksasine, sefepime, aztreonama, seftazidime ve trimetoprim-sülfametoksazole karşı direnç varlığı gösterilmiştir19. İzolatlarımızdan birinde test edilen
antibiyotikler arasında kolistine, ampisiline, amoksisilin-klavulonik asite ve siprofloksasine karşı direnç gözlenmiş, diğerinde ise kolistin ve ampisilin dışında direnç belirlenmemiştir. Bu durum çoklu ilaç direnci görülmeyen izolatlarda da kolistin direncinin görülebileceği-ni hatırlatarak, tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında kolistin duyarlılık testi çalışılmasının önemini bir kez daha gözler önüne sermiştir.
Kolistine dirençli E.coli izolatlarında plazmit üzerinden mcr-1 geniyle birlikte GSBL ve kinolon direnç genlerinin de aktarılabildiğini gösteren çalışmalar mevcuttur2,3,19.
Çalış-mamızdaki izolatlar fenotipik testler ile GSBL negatif olarak tespit edilmiştir ancak izo-latlarımızda konjugatif plazmit varlığı araştırılamaması çalışmamızın kısıtlı yanını oluştur-maktadır.
Karbapeneme dirençli bakterilerle gelişen enfeksiyonların tedavisinde tigesiklin, poli-miksin, aminoglikozitler ve fosfomisin gibi antimikrobiyaller kullanılmaktadır; ancak bu moleküllerin farmakokinetik özellikleri, toksisiteleri ve gelişen direnç problemleri nedeniy-le uygulanmasında kısıtlılıklar yaşanmaktadır. Bu nedennedeniy-le Enterobacteranedeniy-les ainedeniy-lesi üyenedeniy-lerin- üyelerin-de gözlenen artan karbapenem direnci tüm dünyada ciddi kaygılar uyandırmaktadır ve gelişen direncin nedenlerini belirlemek giderek önem kazanmaktadır1,23. Bu nedenle
ça-lışmaya aldığımız kolistine dirençli bu özel grupta karbapenem direnci incelemeye değer bulunmuş ve yapılan incelemeler sonucunda izolatlarımızın 15 (%37.5)’inde fenotipik olarak karbapenem direnci belirlenmiştir. Direnç nedenlerini incelediğimizde karbape-nem inaktivasyon testinin pozitif bulunduğu dokuz izolatta direnç genlerinin (blaOXA-48,
blaKPC, blaNDM, blaVIM) varlığı tespit edilmiştir. Bu testin negatif bulunduğu altı izolatta direnç genlerine rastlanmış ancak iki izolatta AmpC, dört izolatta GSBL üretimi görülmüş ve karbapenem direncinin bu enzimlerin aşırı üretimine bağlı olabileceği düşünülmüştür. Ülkemizde yaygın olarak tespit edilen blaOXA-48 geni bizim çalışmamızda da en sık rastlanan gen olmuştur24. Dünyada daha önce Monako, Tunus ve İsviçre’de gösterilmiş
ve ülkemizde ilk kez 2015 yılında Kılıç ve arkadaşları25 tarafından K.pneumoniae
izola-tında bildirilmiş olan OXA-48 ve NDM birlikteliği daha sonra E.coli, Citrobacter freundii,
Providencia rettgeri gibi farklı izolatlarda da gözlenmiştir26. Bizim çalışmamızda da beş
pozitif olan E.coli izolatında sadece ertapenem direncinin gösterilmiş olması, var olan direnç genlerinin aktif olmayabileceğini düşündürmüştür. Ancak konjugasyon çalışmaları ile doğrulanmamış olması çalışmamızın kısıtlı yanıdır.
NDM gibi diğer bir metallo-beta-laktamaz olan VIM ülkemizde 2014 yılında yapılan çok merkezli bir çalışmada %2.8 oranında tespit edilmiştir ve pozitif saptanan dört izolat-tan biri merkezimizden gönderilmiştir27. Çalışmamızda da bla
VIM geninin karbapenemaz
ve AmpC beta-laktamaz üreten bir E.cloacae izolatında saptanmış olması, bölgemiz için var olan tehdidin hala devam ettiğini göstermektedir.
Ülkemizde ilk kez 2014 yılında Romanyalı bir hastanın endotrakeal aspirat kültüründe izole edilen K.pneumoniae izolatında blaKPC enzimi geni varlığı tespit edilmiş, ardından ül-kemizin çeşitli bölgelerinden bildirimler yapılmıştır28. Literatürde ulaşabildiğimiz
kadarıy-la daha önce Tayvan ve İngiltere’de saptanan bkadarıy-laKPC ve blaOXA-48 birlikteliğine ülkemizde çalışmamız dışında rastlanmamıştır29,30.
Sonuç olarak, çalışmamız literatürde ulaşabildiğimiz kadarıyla ülkemizde klinik örnek-lerde mcr-1 geni varlığını gösteren ve DNA dizi analizi ile doğrulanmış ilk çalışmadır. Çok-lu ilaç direnci görülmeyen izolatlarda mcr geninin saptanmış olması tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarında kolistin duyarlılık testi çalışılmasının önemini bir kez daha gözler önü-ne sermektedir. Ayrıca, çalışmamızda farklı direnç genlerini bir arada içeren izolatların saptanmış olması, karbapenem ve kolistin direncinin yayılımının beklenenden daha hızlı olabileceğini bir kez daha hatırlatmıştır. Kolistinin özellikle karbapeneme dirençli gram-negatif bakterilerin enfeksiyonlarının tedavisinde son seçenek olarak kullanılması, direnç yayılım mekanizmasının anlaşılmasının ve dirençli izolatlarla ilgili sürveyans çalışmalarının yürütülmesini oldukça önemli hale getirmiştir.
ÇIKAR ÇATIŞMASI
Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması bildirmemişlerdir.
KAYNAKLAR
1. Liu YY, Wang Y, Walsh TR, Yi LX, Zhang R, Spencer J, et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis 2016; 16(2): 161-8.
2. Rhouma M, Beaudry F, Theriault W, Letellier A. Colistin in pig production: chemistry, mechanism of antibacterial action, microbial resistance emergence, and one health perspectives. Front Microbiol 2016; 7: 1789.
3. Poirel L, Kieffer N, Brink A, Coetze J, Jayol A, Nordmann P. Genetic features of mcr-1-producing colistin resistant Escherichia coli isolates in South Africa. Antimicrob Agents Chemother 2016; 60(7): 4394-7. 4. Kawanishi M, Abo H, Ozawa M, Uchiyama M, Shirakawa T, Suzuki S, et al. Prevalence of colistin resistance
gene mcr-1 and absence of mcr-2 in Escherichia coli isolated from healthy food-producing animals in Japan. Antimicrob Agents Chemother 2017; 61(1): e02057-16.
6. Wang X, Wang Y, Zhou Y, Li J, Yin W, Wang S, et al. Emergence of a novel mobile colistin resistance gene,
mcr-8, in NDM-producing Klebsiella pneumoniae. Emerg Microbes Infect 2018; 7(1): 122.
7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 8.1, 2018.
8. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance, Version 2.0, 2017.
9. Liu XQ, Liu YR. Detection and genotype analysis of AmpC β-lactamase in Klebsiella pneumoniae from tertiary hospitals. Exp Ther Med 2016; 12(1): 480-4.
10. Simona M, Gatermannb S, Pfeiferc Y, Reischla U, Gessnera A, Jantsch J. Evaluation of the automated BD Phoenix CPO Detect panel in combination with the β-CARBA assay for detection and classification of carbapenemase producing Enterobacterales. J Microbiol Methods 2019; 156: 29-33.
11. Robson RL, Essengue S, Reed NA, Horvat RT. Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae induced by frozen storage in glycerol. Diagn Microbiol Infect Dis 2007; 58(2): 185-90.
12. Rebelo AR, Bortolaia V, Kjeldgaard JS, Pedersen SK, Leekitcharoenphon P, Hansen IM, et al. Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated colistin resistance determinants, mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4 and mcr-5 for surveillance purposes. Euro Surveill 2018; 23(6): 17-00672.
13. Borowiak M, Fischer J, Hammerl JA, Hendriksen RS, Szabo I, Malorny B. Identification of a novel transposon-associated phosphoethanolamine transferase gene, mcr-5, conferring colistin resistance in d-tartrate fermenting Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B. J Antimicrob Chemother 2017; 72(12): 3317-24.
14. Hindiyeh M, Smollen G, Grossman Z, Ram D, Davidson Y, Mileguir F, et al. Rapid detection of blaKPC carbapenemase genes by real-time PCR. J Clin Microbiol 2008; 46(9): 2879-83.
15. Hofko M, Mischnik A, Kaase M, Zimmermann S, Dalpke AH. Detection of carbapenemases by real-time PCR and melt curve analysis on the BD Max system. J Clin Microbiol 2014; 52(5): 1701-4.
16. Avlami A, Bekris S, Ganteris G, Kraniotaki E, Malamou-Lada E, Orfanidou M, et al. Detection of metallo-β-lactamase genes in clinical specimens by a commercial multiplex PCR system. J Microbiol Methods 2010; 83(2): 185-7.
17. Paterson DL. Resistance in gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae. Am J Infect Control 2006; 34(6 Suppl 1): S20-8.
18. Lai CC, Chen YS, Lee NY, Tang HJ, Lee SS, Lin CF, et al. Susceptibility rates of clinically important bacteria collected from intensive care units against colistin, carbapenems, and other comparative agents: results from Surveillance of Multicenter Antimicrobial Resistance in Taiwan (SMART). Infection and Drug Resistance 2019; 12: 627-40.
19. Kurekci C, Aydin M, Nalbantoglu OU, Gundogdu A. First report of Escherichia coli carrying the mobile colistin resistance gene mcr-1 in Turkey. J Glob Antimicrob Resist 2018; 15: 169-170.
20. Sarı AN, Süzük S, Karatuna O, Öğünç D, Karakoç AE, Çizmeci Z, et al. Results of a multicenter study investigating plasmid mediated colistin resistance genes (mcr-1 and mcr-2) in clinical Enterobacteriaceae isolates from Turkey. Mikrobiyol Bul 2017; 51(3): 299-303.
21. Arabacı Ç, Dal T, Başyiğit T, Genişel N, Durmaz R. Karbapenem dirençli Klebsiella pneumoniae izolatlarında karbapenem direnç mekanizmalarının değerlendirilmesi ve MCR-1 geninin araştırılması. 38. Uluslararası Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 4-8 Kasım 2018, Antalya. Kongre Kitabı, s: 171-2, SS-084.
22. Kandemir T, Nağıyev T, Köksal F. Kolistin direncinin tespitinde yanlış tanı: yalancı MCR-1 pozitifliği. 38. Uluslararası Türk Mikrobiyoloji Kongresi, 4-8 Kasım 2018, Antalya. Kongre Kitabı, s: 190, SS-114.
23. Campos AC, Albiero J, Ecker AB, Kuroda CM, Meirelles LE, Polato A, et al. Outbreak of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K.pneumoniae: a systematic review. Am J Infect Control 2016; 44(11): 1374-80. 24. Tekintaş Y, Çilli F, Eraç B, Yaşar M, Aydemir SŞ, Hoşgör Limoncu M. Comparison of phenotypic methods and
25. Kilic A, Baysallar M. The first Klebsiella pneumoniae isolate co-producing OXA-48 and NDM-1 in Turkey. Ann Lab Med 2015; 35(3): 382-3.
26. Otlu B, Yakupoğulları Y, Gürsoy NC, Duman Y, Bayındır Y, Tekerekoğlu MS, et al. Providencia rettgeri’de OXA-48 ve NDM-1 karbapenemaz genlerinin birlikte üretimi: ilk bildirim. Mikrobiyol Bul 2018; 52(3): 300-7. 27. Çakar A, Akyön Y, Gür D, Karatuna O, Ögünç D, Özhak Baysan B, et al. Türkiye’de 2014 yılı içinde izole
edilen karbapeneme dirençli Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae izolatlarında karbapenemaz varlığının araştırılması. Mikrobiyol Bul 2016; 50(1): 21-33.
28. Özyazıcı G, Özkaya E, Kaya H, Kocatürk Sel S, Altınbaşak H, Başarı F, et al. Investigation of blaKPC gene by PCR in carbapenem-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae clinical isolates in a tertiary care hospital in Turkey. Mediterr J Infect Microb Antimicrob 2019; 8: 3.
29. Chen CM, Guo MK, Ke SC, Lin YP, Li CR, Vy Nguyen HT, et al. Emergence and nosocomial spread of ST11 carbapenem-resistant co-producing OXA-48 and KPC-2 in a regional hospital in Taiwan. J Med Microbiol 2018; 67(7): 957-64.
