MİKRODİZİN
DENEYLERİNİN TASARIMI:
Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
Hafta VIII
Genombilimde Mikrodizin Uygulamaları ve Biyoinformatik Analiz
Niçin Mikrodizin Deneyi Niçin Mikrodizin Deneyi ? ?
• Genomik ölçekte bakış
– Gen ifade profilinin saptanması
– Gen ifade seviyesinin zaman, uygulama ve örnek tipi seviyelerinde karşılaştırılması – Fenotip-Gen ilişkisinin kurulması
– Delete veya duplike olmuş gen bölgelerinin tespiti
– Başka genleri etkileyen genlerin tanımlanması
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Hangi mikrodizin platformu kullanılmalı?
• Deneyin nihai hedefi nedir?
• Yapılacak en uygun kıyaslar nelerdir?
• Deneyin kontrol aşamaları nelerdir?
• Veri analizinde hangi istatistik yöntem kullanılacaktır?
• Mikrodizindan alınacak sonuçlar hangi yöntemlerle doğrulanacaktır?
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Hangi mikrodizin platformu kullanılmalı?
cDNA, oligo, Agilent, Affymetrix, Illumina….
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Deneyin nihai hedefi nedir?
– Yeni grup, sınıf tanımlamak amacı ile moleküler imza belirlenmesi
– Bir etken maddenin etki mekanizmasının ortaya konması – Bir süreçte etkin olan yeni genlerin tespiti
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Yapılacak en uygun kıyaslar nelerdir?
– Uygun kontrol grubu belirlendi mi?
– Uygulama yapılan-yapılmayan
– Tümör-Normal (Alınan tümörün aynı bireyden alınan aynı dokunun normal hücreleri)
– Kompleks hastalıklarda grupların mümkün olduğunca homojen tutulması
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Deneyin kontrol aşamaları nelerdir?
– Örnek sağlam mı?
– cRNA hazırlayan kit sağlam mı?
– Hibridizasyon reaktif ve koşulları sağlam mı?
– Deneyler teknik olarak doğru yapılıyor mu?
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Veri analizinde hangi istatistik yöntem kullanılacaktır?
– Soru belirlendi mi?
– Bir istatistik uzmanına danışıldı mı?
– Veriyi analiz edebilecek bilgisayar gücü mevcut mu?
Deneysel Tasarımda Dikkate Alınması Gerekenler
• Mikrodizindan alınacak sonuçlar hangi yöntemlerle doğrulanacaktır?
– QRT-RT PCR – Western Blot – IP
– ChIP – siRNA – ……
SORULAR
• Deneyi kaç mikrodizinle yapmak gerekir?
• Örnekleri biraraya getirebilir miyim, getirmeli miyim?
• Hangi mikrodizini kullanmalıyım?
Kaç tekrar yapılmalı?
• Mümkün olduğunca çok…
İstatistiki olarak ne kadar çok örnek varsa testler o kadar doğru konuşacaktır.
Kaç tekrar?
2
2 1
2
4 1
(δδ/σ
) z
n (z α/ β
α “significance” seviyesi (Yanlış pozitifleri saptama olasılığı)
1-β farklılıkları tespit etme gücü (Gerçek pozitifleri saptama olasılığı)
σ log oranlarının standart sapması
δ sınıf ortalama log oranları arasındaki saptanabilir fark
z standart normal dağılım “percentile”i
n gereken tekrar sayısı
Kaç tekrar?
• En az üç tekrar gereklidir.
Biri kendinizi,
Biri patronunuzu ikna etmek için Biri de her ihtimale karşı…
Tekrar sayısını belirlerken
Örneğin kalitesi
Beklenen sonuç
Deneysel tasarım
Analiz yaklaşımı hesaba katılmalıdır.
Bir örneğin kalitesi
• Örnek ne kadar küçükse gürültüye o kadar açıktır.
• Hücre kültürü örnekleri hastadan alınan örneklere göre daha az gürültü içerir.
• Örnekleri biraraya getirip karıştırmak bireysel farklılıklar sorgulanmıyor ise gürültüyü azaltacağı için tercih edilebilir.
Yanlış tekrarlar?
• Teknik tekrar (Aynı örneği tekrar hibridize etmek)
• Karıştırılan örneklerin tekrar tekrar hibridize edilmesi.
• Aynı örnek preparatının iki ayrı seferde işaretlenerek hibridize edilmesi.
Örnekler karışım haline getirilmeli mi?
• Birçok örnek zaten karıştırılmış kabul edilmeli zira RNA birçok farklı hücreden izole edilmiştir.
• mRNA miktarını arttırmak üzere örnekler yalnızca gerektiği miktarda karıştırılmalıdır.
• Birbirinden bağımsız karışımlar hazırlanarak varyasyon dikkate alınmalıdır.
• Örnekleri karışım haline getirme belli sapmalara (bias), kontaminasyona, “outlier”
problemine neden olabilir.
