Staphylococcus aureus İzolatlarında Biyofilm
Üretiminin Genotipik ve Fenotipik Karakterlerinin
Karşılaştırılması*
Comparison of Genotypic and Phenotypic Characteristics in
Biofilm Production of Staphylococcus aureus Isolates
Rasim ŞAHİN1, İlknur KALELİ21 Mersin Şehir Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Mersin.
1 Mersin City Hospital, Microbiology Laboratory, Mersin, Turkey.
2 Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Denizli.
2 Pamukkale University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Denizli, Turkey.
* Bu çalışma, ilk yazarın tıpta uzmanlık tez çalışmasını içermektedir.
ÖZ
Staphylococcus aureus hastalık etkeni olan önemli bir mikroorganizmadır. S.aureus izolatlarının patojenitesi; aderans özellikleri, çeşitli toksinler, enzimler, yapısal ve ekstraselüler faktörler gibi özelliklere bağlıdır. Bakterinin slime ve biyofilm üretimi de patojenite faktörleri arasında yer almaktadır. Hastalarda kronik enfeksiyonların devamlılığı ile ilgili olduğu düşünülen biyofilm üretimi, son yıllarda araştırmacıların ilgisini çeken bir konudur. Biyofilm, serbest yaşayan organizmaların uygun bir yüzeye tutunup kümeleşerek ürettikleri matriks ile oluşturdukları bir tabakadır. Bu tabaka, S.aureus’ta antibiyotik direnci ve konak hücrelerinin fagositozuna engel olması sebebiyle, S.aureus’a bağlı enfeksiyonların tedavisini zorlaştırmaktadır. S.aureus türünde biyofilm tabakası oluşumundan icaADBC lokusu ve bazı proteinler sorumlu tutulmaktadır. Bu çalışmada, S.aureus izolatlarında biyofilm üretiminin gösterilmesinde kullanılan fenotipik yöntemler ile biyofilm üretiminden sorumlu olan icaA, icaD ve bap genleri arasındaki ilişkinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmada, Mikrobiyoloji Laboratuvarına gelen çeşitli klinik örneklerden elde edilen 175 S.aureus izolatı kullanılmıştır. Çalışmada biyofilm üretiminin fenotipik tespitinde Kongo Kırmızısı Agar (KKA) besiyeri ve mikroplak yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada pozitif kontrol olarak Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, negatif kontrol olarak S.epidermidis ATCC 12228 suşları kullanılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile biyofilm üretimi KKA ve mikroplak yönteminin en az
Geliş Tarihi (Received): 17.11.2017 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 09.04.2018
birisinde pozitif olarak saptanan 152 S.aureus izolatı değerlendirilmiştir. İzolatlarda biyofilm oluşumunda görev yaptığı düşünülen icaA, icaD ve bap genleri araştırılmıştır. Çalışmada ayrıca, bu genlerin bir ürünü olan polisakkarid interselüler adezin (PIA) üretimi araştırılmıştır. PIA varlığının tespitinde bileşimindeki poli-N-asetil-beta-1-6-glukozamin (PNAG) yapısını gösterebilmek için kemilüminesans dot-blot yöntemi kullanılmıştır. KKA besiyerinde koloni morfolojisine dayanan fenotipik değerlendirmeler sonrasında 175 örneğin 101 (%57.7)’inde biyofilm üretimi negatif olarak bulunurken, 74 (%42.3)’ünde biyofilm üretimi pozitif olarak bulunmuştur. Mikroplakta kantitatif değerlendirme sonucunda örneklerin 34 (%19.4)’ünde biyofilm üretimi negatif, 112 (%64.0)’sinde orta derece ve 29 (%16.6)’unda güçlü olarak belirlenmiştir. Mikroplak yöntemi ve KKA biyofilm üretimini tespit etmek açısından karşılaştırıldığında birbiriyle uyumsuz bulunmuştur (p< 0.001). Biyofilm oluşumundan sorumlu genlerin varlığının araştırılmasında kullanılan 152 klinik izolatın 136 (%89.5)’sında ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.epidermidis ATCC 35984 suşunda icaA ve icaD saptanmıştır. Çalışma kapsamındaki 152 klinik izolatın 16 (%10.5)’sında ve negatif kontrol olarak kullanılan S.epidermidis ATCC 12228 suşunda icaA ve icaD genleri saptanmamıştır. KKA besiyerinde gözlenen biyofilm üretimi ile icaA ve icaD genleri arasında zayıf-orta derecede ilişki saptanmıştır (r= 0.257, p= 0.001). Mikroplak yönteminde saptanan biyofilm üretimi ile icaA ve icaD genleri arasında iyi derecede ilişki bulunmuştur (r= 0.559, p< 0.001). Çalışılan 152 klinik S.aureus izolatının yalnızca birinde ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.aureus V329 suşunda bap geni saptanmıştır. icaADBC genleri tarafından sentez edilen PIA/PNAG’ın kemilüminesans dot blot yöntemiyle gösterilmesi için 50 adet klinik S.aureus izolatı kullanılmıştır. icaA ve icaD genleri pozitif olarak saptanan 42 izolatın tamamında dot-blot yöntemiyle PNAG üretimi gösterilirken, ica genleri negatif sekiz klinik izolatta PNAG tespit edilememiştir. Sonuç olarak, S.aureus izolatlarında biyofilm oluşumunun fenotipik olarak saptanmasında mikroplak yönteminin daha duyarlı ve güvenilir olduğu, klinik S.aureus izolatlarında biyofilm oluşturma düzeyinin yüksek olduğu (yaklaşık %80), icaA ve icaD genleri ve ürünlerinin (PIA/PNAG) biyofilm oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir.
Anahtar sözcükler: Staphylococcus aureus; biyofilm; polisakkarid interselüler adezin.
ABSTRACT
Microplate and CRA methods were incompatible with each other when compared for their biofilm production determination (p< 0.001). Among the 152 clinical isolates used to determine the presence of icaA and icaD genes responsible for the formation of biofilms, the genes were detected in 136 (89.5%) of the isolates and in the S.epidermidis ATCC 35984 strain used as a positive control. icaA and icaD genes were not detected in sixteen of the 152 (10.5%) clinical isolates and in the S.epidermidis ATCC 12228 strain used as a negative control. A weak-moderate correlation was found between icaA and icaD genes and biofilm production determined in CRA medium. A good correlation was found between icaA and icaD genes and biofilm production detected in microplate method. bap gene was determined in only one of the 152 clinical S.aureus isolates studied and in S.aureus V329 strain used as positive control. For the detection of PIA/PNAG which was synthesized by icaADBC genes, 50 clinical S.aureus isolates were used. PNAG production was determined in 42 isolates with positive icaA and icaD genes by the chemiluminescence dot-blot method, and no PNAG production was determined among eight isolates with negative ica genes. As a result, it was found that the microplate method was more sensitive and reliable for the phenotypic determination of biofilm formation in S.aureus isolates, high level of biofilm formation among clinical S.aureus isolates (about 80%), the role of icaA and icaD genes and products (PIA/PNAG) in biofilm production was determined.
Keywords: Staphylococcus aureus; biofilm; polysaccharide intercellular adhesion.
GİRİŞ
Staphylococcus aureus komensal bir bakteri olmakla birlikte, çeşitli akut veya kronik
en-feksiyonlara neden olmaktadır1. S.aureus izolatlarının patojenitesi; aderans, çeşitli
toksin-ler, enzimtoksin-ler, yapısal ve ekstraselüler faktörler gibi özelliklerle birlikte biyofilm oluşumuna da bağlıdır2,3. Biyofilm, bir yüzey üzerinde mikroorganizma kolonileri ve onların
ürettik-leri ekstraselüler polimerik yapılar (EPS), proteinler, çevresel organik ve inorganik mad-delerden oluşan bir tabakadır4. Biyofilm oluşumu, mikroorganizmaları opsono fagositoz
ve antibiyotiklerden koruyarak, sepsis ve kronik enfeksiyonların oluşumuna neden olabi-lir5,6. Stafilokoklarda biyofilm oluşumundan icaADBC operonu ve ürünü olan
“polisakka-rid interselüler adezin (PIA)” sorumlu tutulmaktadır7. icaADBC operonu stafilokoklarda
biyofilm oluşumunun interselüler adezyon kısmında görev yapan PIA oluşumundaki poli-N-asetil-beta-1-6-glukozamin (PNAG) oligomerlerinin sentezini gerçekleştirmektedir3. S.aureus ve Staphylococcus epidermidis’in biyofilm oluşturmasında icaA ve icaD genlerinin
önemli olduğu bulunmuştur8-10. icaA ve icaD genlerinin görevi UDP-N-asetil glukozamini
substrat olarak kullanarak şeker oligomerleri sentezini sağlamaktır3. İcaA tek başına düşük
seviyede n-asetilglukozamin transferaz aktivitesi gösterirken, icaB ile arasında yer alan
icaD geni varlığında enzim aktivitesinde belirgin artış göstermektedir7,8. Çeşitli bakteri
türlerinin biyofilm oluşumunda icaADBC operonu dışında yapısal bir grup yüzey proteini önemli bulunmuştur3. Bu proteinlerden S.aureus “biofilm associated protein (bap)”
bi-yofilm oluşumu için gerekli yapılardan birisi olarak gösterilmiştir9. Bu çalışmada, S.aureus
izolatlarında biyofilm üretiminin gösterilmesinde kullanılan fenotipik yöntemler Kongo Kırmızısı Agar (KKA) ve mikroplak yöntemi ile biyofilm oluşumundan sorumlu olan icaA,
GEREÇ ve YÖNTEM
Çalışmada, Mikrobiyoloji Laboratuvarına gelen çeşitli klinik örneklerden (yara, kan, trakeal aspirat, balgam, kateter vb.) elde edilmiş olan 175 S.aureus izolatı kullanıldı.
Biyofilm Üretiminin Araştırılması
Biyofilm üretimi, Freeman ve arkadaşlarının11 tanımladığı KKA ile Christensen ve
arka-daşlarının12 tanımladığı mikroplak yöntemiyle araştırıldı. KKA çalışması her izolat için en
az iki kere tekrarlandı ve ayrı araştırmacılar tarafından değerlendirildi. Çalışmada kont-rol olarak, biyofilm oluşturmayan S.epidermidis ATCC 12228, güçlü biyofilm oluşturan
S.epidermidis ATCC 35984, güçlü biyofilm oluşturan ve bap geni bulunan S.aureus V329
kullanıldı (Dieter Vancraeynest, Gent Universitesi, Belçika’dan elde edilmiştir). Mikroplak yönteminde izolatların biyofilm yapma yetenekleri, 540 nm dalga boyunda ELISA okuyu-cusu (ELISA Reader, Pasteur Diagnostic, Fransa)’nda ölçülerek kantitatif olarak belirlendi. Aynı izolat üç farklı kuyucukta çalışılarak ölçüm yapıldı. Sonuçlar, biyofilm oluşturmayan
S.epidermidis ATCC 12228 ve güçlü biyofilm oluşturan S.epidermidis ATCC 35984’ten
elde edilen absorbans değerleriyle karşılaştırılarak yorumlandı10-12. Kontrol suşlar dikkate
alınarak; biyofilm oluşturmayan S.epidermidis 12228’e eşit ve altında absorbans verenler negatif, güçlü biyofilm oluşturduğu bilinen S.epidermidis 35984’e eşit ve üzerinde absor-bans verenler güçlü ve her iki kontrol arasında absorabsor-bans verenler orta derece biyofilm üreten izolatlar olarak değerlendirildi10.
Biyofilm Üretiminden Sorumlu Genlerin Araştırılması
Biyofilm üretimi KKA ve mikroplak yönteminin en az birisinde pozitif olarak değer-lendirilen 152 S.aureus izolatı PCR ile çalışıldı. Bu izolatlarda biyofilm oluşumunda görev yaptığı düşünülen icaA, icaD ve bap genleri Vancraeynest ve arkadaşları3 ile Arciola ve
arkadaşlarının8 kullandığı primerlerle araştırıldı (Tablo I). DNA izolasyonu için 37°C’de 24
saatte kanlı agarda üreyen izolatlar 2 ml distile su içerisinde 0.5 McFarland olacak şekilde süspanse edildi. Bakteri DNA’sının elde edilmesinde DNA saflaştırma kiti (Heliosis, Metis Ltd. Şti, Ankara) kullanıldı. Biyofilm genleri; icaA, icaD ve bap genleri her biri ayrı olarak in house PCR yöntemiyle ısı döngü cihazı (Mycycler, Bio-Rad, ABD) kullanılarak araştırıldı.
Tablo I. Çalışmada Kullanılan Primerler
Hedef gen Primer dizisi Amplikon büyüklüğü
icaA ve icaD genlerinin amplifikasyonunda; 2.5 mM (5 ml) MgCl2, her bir nükleotitten 200
mM içeren dNTP karışımı (10 ml) eklendi, her bir primerden 100 pmol, 1.25 U Taq poli-meraz, 100 ng (5 ml) DNA örneği içeren 50 ml’lik PCR karışımı kullanıldı. Amplifikasyon işlemi; 92°C’de 45 saniye denatürasyon, 49°C’de 45 saniye primer bağlanma (annealing), 72°C’de 1 dakika uzama içeren 30 döngü ve 72°C’de 7 dakika son uzama dönemi olarak uygulandı. Biyofilm genleri; icaA ve icaD in house PCR (Mycycler, Bio-Rad, ABD) ile ayrı ayrı çalışıldı.
bap geninin amplifikasyonunda; 1 mM MgCl2, 2.5 U Taq polimeraz, her bir
nükleotit-ten 200 mM içeren 10 ml dNTP, her bir primerden 100 pmol ve 100 ng (5 ml) DNA örneği içeren 50 ml’lik PCR karışımı kullanıldı. Amplifikasyon işlemi; 94°C’de 30 saniye denatü-rasyon, ardından 30 döngü olacak şekilde; 94°C’de 45 saniye denatürasyon 62°C’de 1 da-kika bağlanma, 72°C’de 1 dada-kika uzama dönemi ve 72°C’de 7 dada-kika son uzama dönemi olarak uygulandı. DNA amplifikasyon ürünleri 150 volt akımda 45 dakika %2’lik agaroz jel elektroforezde yürütüldü. icaA için 1315 bp, icaD için 385 bp ve bap için 971 bp büyük-lüğünde bant varlığı araştırıldı. Kontrol olarak icaA ve icaD genlerini taşıyan S.epidermidis ATCC 35984, taşımayan S.epidermidis ATCC 12228 ve bap geni bulunduran S.aureus V329 suşları kullanıldı. Moleküler belirteç olarak “GenRuler 100 bp DNA” kullanıldı.
Polisakkarit İnterselüler Adezinlerin Araştırılması
S.aureus’ta PIA/PNAG üretimi Cramton ve arkadaşlarının13 tanımladığı yöntemle
belir-lendi. PIA varlığının tespitinde bileşimindeki PNAG yapısı araştırıldı. Çalışmada ica genleri ile PIA lişkisini göstermede yeterli olduğunu düşündüğümüz icaA ve icaD pozitif 42 ve icaA ve icaD negatif 8 klinik izolat ve kontrol olarak S.epidermidis ATCC 35984 ve S.epidermidis ATCC 12228 suşları kullanıldı13,14. S.aureus izolatları %0.25 glukoz içeren triptik soy
İstatiksel Değerlendirme
İstatistiksel analiz için SPSS Versiyon 10.0 kullanıldı. Biyofilm üretiminin saptanma-sında kullanılan yöntemler arasaptanma-sındaki uyum için McNemar testi, biyofilm üretimi ve ica genleri arasındaki ilişki için Spearman’s korelasyon katsayısı testi kulllanıldı. İstatistiksel hata payı %5 kabul edildi.
BULGULAR
KKA besiyerinde; 175 örneğin 101 (%57.7)’inde biyofilm üretimi negatif bulunurken, 74 (%42.3)’ünde biyofilm üretimi pozitif bulunmuştur (Tablo II).
Mikroplak yöntemi ile örneklerin 34 (%19.4)’ünde biyofilm üretimi görülmezken, 112 (%64)’sinde orta derece ve 29 (%16.6)’unda güçlü derecede biyofilm üretimi görülmüş-tür (Tablo III).
Tablo II. Örneğin İzole Edildiği Yere Göre KKA ve Mikroplak Yönteminde Biyofilm Pozitif ve Negatif
Örneklerin Sayıları ve Yüzdeleri
Kongo Kırmızı Agar besiyerinde Mikroplak yöntemi Negatif n (%) Pozitif n (%) Negatif n (%) Pozitif n (%)
Yara (n= 87) 34 (39.1) 53 (60.9) 11 (12.6) 76 (77.4) Kan (n= 25) 17 (68.0) 8 (2.0) 6 (24.0) 19 (76.0) Trakeal aspirat (n= 35) 31 (88.6) 4 (11.4) 10 (28.6) 25 (71.4) Balgam (n= 10) 7 (70.0) 3 (30.0) 3 (30.0) 7 (70.0) Kateter (n= 8) 7 (87.5) 1 (12.5) 1 (12.5) 7 (87.5) Diğer (n= 10) 5 (50.0) 5 (50.0) 3 (30.0) 7 (70.0) Toplam 101 (57.7) 74 (42.3) 34 (19.4) 141 (80.6)
KKA: Kongo Kırmızısı Agar.
Tablo III. Mikroplak Yöntemiyle Örneklerin İzole Edildiği Yere Göre Biyofilm Sayıları ve Yüzdeleri
Biyofilm yapımı Örneğin alındığı yer
(n)
Negatif
n (%) Orta derece pozitif n (%)
Mikroplak yönteminde güçlü ve orta derece biyofilm üretimi gösteren izolatlar biyo-film üretimi pozitif olarak değerlendirildiğinde10 biyofilm oluşumunun tespitinde kullanılan
mikroplak yöntemi ve KKA besiyeri arasında anlamlı fark bulunmuştur (p< 0.001) (Tablo IV). Biyofilm oluşumunda görevli icaA ve icaD genlerinin bant varlıkları Şekil 1’de gösteril-miştir.
KKA’da; biyofilm üretimi pozitif olarak değerlendirilen 66 izolatın 65 (%98.5)’inde icaA ve icaD genleri bulunurken, 1 (%1.5) izolatta icaA ve icaD geni saptanmamıştır. Biyofilm üretimi negatif olarak değerlendirilen 86 izolatın 71 (%82.6)’inde icaA ve icaD genlerinin her ikisi de saptanırken, 15 (%17.4) izolatta her iki gen de tespit edilmemiştir (Tablo V).
Tablo IV. Biyofilm Üretiminde KKA Besiyeri ile Mikroplak Yönteminin Karşılaştırılması
Mikroplak yöntemi
Pozitif Negatif (%) Toplam (%)
KKA Pozitif 69 (39.4) 5 (2.9) 74 (42.3)
Negatif 72 (41.2) 29 (16.5) 101 (57.7)
Toplam 141 (80.6) 34 (19.4) 175 (100)
KKA: Kongo Kırmızısı Agar.
Tablo V. Biyofilm Üretimi ile ica Genlerinin İlişkisi
KKA Mikroplak yöntemi
Negatif n (%) Pozitif n (%) Negatif n (%) Pozitif n (%) ica genleri Negatif 15 (17.4) 1 (1.5) 14 (43.75) 2 (1.7)
Pozitif 71 (82.6) 65 (98.5) 18 (56.25) 118 (98.3)
KKA: Kongo Kırmızısı Agar.
Şekil 1. icaA (1315 bp) ve icaD (381 bp) genlerinin araştırılması: 1. kuyucuk: icaA pozitif kontrol (S.epidermidis ATCC 35984), 10. kuyucuk: icaD pozitif kontrol (S.epi-dermidis ATCC 35984), 3. kuyucuk: icaA ve icaD negatif kontrol (S.epi(S.epi-dermidis ATCC
12228). 2, 4, 5, 6, 8, 9. kuyucuklar: icaA pozitif klinik izolatlar, 7. kuyucuk: icaA
negatif klinik izolat; 11, 12, 13, 14. kuyucuk: icaD pozitif klinik izolatlar, 15. kuyucuk:
moleküler belirteç (GenRuler 100 bp DNA moleküler ağırlık belirteci).
KKA besiyerinde gözlenen biyofilm üretimi ile icaA ve icaD genleri varlığı arasında zayıf-orta derecede ilişki bulunmuştur (r= 0.257, p= 0.001). Mikroplak yönteminde sap-tanan biyofilm üretimi ile icaA ve icaD genleri arasında iyi derecede ilişki bulunmuştur (r= 0.559, p< 0.001). bap geni 152 izolatın 1 (%0.7)’inde ve pozitif kontrol olarak kullanılan
S.aureus V329 suşunda saptanmıştır (Şekil 2).
Polisakkarid interselüler adezin (PIA/PNAG) üretimi; ica genleri pozitif olarak saptanan 42 izolatın tamamında ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.epidermidis ATCC 35984’de gösterilmiştir. Negatif kontrol olarak kullanılan S.epidermidis ATCC 12228 suşu ve ica genleri saptanmayan 8 klinik izolatta PNAG tespit edilmemiştir. Çalışmada kullanılan di-lüsyonlarda PNAG üretimi tespit edilen 42 klinik izolattan 12’sinde pozitif kontrole eşit, 30 izolatta ise daha zayıf ışıma olduğu tespit edilmiştir (Şekil 3).
TARTIŞMA
S.aureus doğal dokularda ve medikal alet, implant gibi cansız yüzeylerde biyofilm
olu-şumuna neden olarak tedavisi güç enfeksiyonlara yol açmaktadır5. Eklem protezleri, kalp
pili, kalp kapakçıkları, vasküler stentler, üriner kateterler, santral venöz kateterler ve oftalmik implantlar üzerinde biyofilm oluşumu görülebilmektedir2. Çalışmamızda biyofilm oluşumu
ile klinik örneklerin alındığı bölgeler arasındaki ilişki değerlendirildiğinde, yara örneklerinin her iki yöntemle de biyofilm üretiminin yüksek olduğu bulunmuştur (Tablo II). KKA ile
Şekil 2. bap (971 bp) geni araştırması (9. kuyucuk: moleküler belirteç: (GenRuler 100 bp DNA’’ belirteci) 8. kuyucuk: pozitif kontrol (S.aureus V329); 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 12, 13, 14, 15. kuyucuklar: bap negatif klinik izolatlar; 10. kuyucuk: bap pozitif
klinik izolat; 11. kuyucuk: bap pozitif klinik izolatının tekrar çalışması.
Şekil 3. PIA/PNAG varlığının kemilümünesans dot-blot yöntemle gösterilmesi. 1: pozi-tif kontrol; 8 negapozi-tif kontrol. 2, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14 pozipozi-tif klinik izolatlar; 3, 5, 11 negatif klinik izolatlar.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7
karşılaştırıldığında mikroplak yönteminde trakeal aspirat ve kateter örneklerinde toplam biyofilm oluşturan izolat sayısında daha fazla artış görülmüştür. KKA’da kateterden elde edilen izolatların yalnızca %12.5’inde biyofilm üretimi pozitif olarak bulunurken, mikrop-lak yönteminde belirgin bir artışla örneklerin %87.5’inde biyofilm üretimi pozitif olarak saptanmıştır (Tablo II).
Biyofilm oluşumu en az üç basamakta gerçekleşmektedir15. Başlangıç aşamasında
mikroorganizmanın normal doku ve yabancı materyal yüzeyine adezyonu, ikinci aşama-da yüzeylerde hücre proliferasyonu ve ekzopolisakkarit madde sentezi, üçüncü ve son aşamada içerisinde beslenme ve artıkların uzaklaştırılmasını da sağlayan kanalların bu-lunduğu üç boyutlu bir yapı oluşmaktadır. Bu yapı hakkında çok fazla bilgi olmamasına rağmen, konfokal mikroskopi ile üç boyutlu yapısı görüntülenebilmektedir16. Mathur ve
arkadaşları17 mikroplak yöntemi ve KKA arasında zayıf bir uyum olduğunu bildirmiştir.
Bi-yofilm varlığının belirlenmesinde daha önce yapılan çalışmalarla uyumlu olarak, çalışma-mızda mikroplak yönteminin, KKA’a göre daha duyarlı bir yöntem olduğu gözlenmiştir. Yapılan çalışma sonuçlarına göre mikroplak yönteminin faz değişimi, bireysel, görsel ko-loni morfolojisi değerlendirmeye bağlı farklı sonuçlara yol açmaması ve kantitatif değer-lendirmeye olanak sağlaması yöntemin üstünlükleri olarak kabul edilmiştir. Buna karşın saptanan biyofilm üretim varlığının kullanılan besiyeri içerisindeki glukoz miktarı ve diğer çevresel koşullarla değişmesi dezavantaj olarak bildirilmiştir18. Mikroplak yönteminin
al-tın standart olarak kabul edildiği 121 izolatla yapılan bir çalışmada tüp yönteminin, KKA yönteminden daha güvenilir olduğu gösterilmiş ve laboratuvarlarda biyofilm oluşturan bakteri tanımlaması için ana tarama testi olarak tavsiye edilmiştir19. Çalışmamızda KKA
ve mikroplak yöntemlerinin biyofilm üretimini saptama açısından birbiri ile uyumsuz ol-duğu gözlenmiştir (p< 0.001).
Yapılan çalışmalarda ica operonunda yer alan icaA geninin, UDP-N-asetilglukozaminden N-asetilglukozamin oligomerlerinin sentezinde yer alan N-asetilglukozamil transferaz üretiminden sorumlu olduğu belirlenmiştir7. N-asetilglukozamin biyofilm tabakasının ana
maddesini oluşturmaktadır14,15. N-asetilglukozamin, hücreler arası agregasyonu sağlayan
polisakkarit yapıda olan interselüler adezin (PIA) oluşumundan sorumludur13,20. icaD geni
ise kapsüler polisakkaritin fenotipik ifadesinde önemli olan N-asetilglukozamiltransferazın maksimum ekspresyonunda rol oynar7. Buna göre, icaA ve icaD genlerinin birlikte
N-asetilglukozamini substrat olarak kullanarak şeker oligomerlerinin sentezine aracılık et-tikleri gösterilmiştir13. Ayrıca, icaA geni tek başına düşük N-asetilglukozamin transferaz
aktivitesi gösterirken, icaD geni varlığında enzim aktivitesinde belirgin artış gözlemlen-miştir8. Stafilokokal biyofilm oluşumunda tek bir gen bölgesinin değil birçok negatif ve
pozitif düzenleyici genlerin sorumlu olduğu bildirilmiştir18.
Arciola ve arkadaşları8 KKA’da 23 S.aureus izolatının 14’ünde biyofilm üretimini pozitif
%45.0’ında icaA ve icaD genlerini saptamıştır. Bu sonucun KKA’da koloni morfolojisinin yorumlanmasının güçlüğüne bağlı olabileceği belirtilmiştir. Güvenilir biyofilm saptama yöntemlerinin kullanılması ile yanlış hastalık tanısı ve tekrarlayan enfeksiyonlar önlene-bilmektedir. Brezilya’da yapılan bir araştırmada 94 S.aureus izolatının, 93’ünün biyofilm üretiminin pozitif olduğu fenotipik yöntemlerle belirlenirken, 90 izolatın icaA ve icaD genlerinin her ikisine de sahip olduğu PCR ile belirlenmiştir21. Bu çalışmalarda ica
gen-lerinin biyofilm oluşumundaki rollerine ve stafilokok enfeksiyonlarında virülans belirteci olarak değerlendirilebileceğine dikkat çekilmiştir. Çalışmamızda, 152 klinik izolatın 136 (%89.5)’sında icaA ve icaD genlerinin her ikisi de görülürken, 16 (%10.5)’sında icaA ve
icaD genleri saptanmamıştır (Şekil 1).
Biyofilm üretiminin saptanmasında kullandığımız iki yöntem arasında uyumsuzluk bul-duğumuz için (p< 0.001) ica genleri ile biyofilm üretimi arasındaki ilişki her iki yönteme göre ayrı ayrı değerlendirilmiştir. KKA yöntemi ile gen varlığı arasında zayıf-orta derecede (r= 0.257, p= 0.001) ilişki bulunmuştur. Mikroplak yöntemiyle saptanan biyofilm üreti-mi ile icaA ve icaD genlerinin varlığı arasında iyi derecede ilişki bulunmuştur (r= 0.559, p< 0.001). Elde ettiğimiz bulgularla biyofilm oluşumunda ica genlerinin önemi gösteril-miştir. Bununla birlikte çalışmalarda, ica genlerinin biyofilm oluşumunda tek başlarına sorumlu olmadığı, diğer genetik faktörlerin ve çevresel şartların biyofilm oluşumunda rol oynadığı bildirilmiştir7,17.
Lasa ve arkadaşları9 sığırdan elde edilen S.aureus izolatları ile yapılan çalışmalarında
bap geni tarafından kodlanan 2276 aminoasitlik büyük bir yüzey proteini olan biyofilm ile ilişkili protein bap’ı elde etmiştir. S.aureus izolatlarında bap geninin biyofilm oluşumu için gerekli yapılardan birisi olduğu başka çalışmalarda da bildirilmiştir20. Yapılan
çalış-malarda, abiyotik yüzeylere yapışma ve interselüler adezyon basamaklarının her ikisin-de ikisin-de bu geninin görev yaptığı gösterilmiştir9. Cucarella ve arkadaşlarının22 yaptıkları
çalışmada, mastitli sığırlardan elde edilen 350 S.aureus izolatının yalnızca %5’inde bap geni tespit edilirken, insanlardan elde edilen 75 S.aureus izolatının hiçbirinde bap genine rastlanmamıştır. Kuvvetli biyofilm oluşumundan sorumlu olan bap genine, hayvanlardan elde edilen izolatlarda çok ender olarak rastlanılırken, insan kaynaklı izolatlarda henüz tespit edilememiştir21,23. bap geninin insan ve hayvan kaynaklı S.aureus izolatları arasında
henüz yeteri kadar yaygın olmadığı için prevalansının düşük olduğu öne sürülmektedir23. bap geninin yok edilmesi durumunda biyofilm matriksinin ana polisakkarit maddesi olan
PIA/PNAG birikiminde azalma olduğu bildirilmiştir22. Çalışmamızda kullanılan 152
izola-tın yalnızca birinde bap geni saptanmıştır (Şekil 2). bap geni pozitif S.aureus izolatı yoğun bakım servisinde yatan hastadan gönderilen trakeal aspirasyon örneğinde saptanmıştır.
PIA/PNAG yapısı bakteri hücrelerinin interselüler adezyonunda temel görev üstlen-mektedir13. Bakteriyel agregasyonun yanı sıra bakterinin biyomateryallere adezyonunda
ve konak bağışık yanıtından kaçabilmesinde önemli görevleri bulunmaktadır14. PIA/PNAG
üretimi için icaA ve icaD genlerinin birlikte eksprese olması gereklidir13,14. Çalışmamızda icaA ve icaD genleri pozitif 42 izolatın tamamında PNAG üretimi gösterilmiştir. ica genleri
Çalışmamızda S.aureus’larda biyofilm oluşturma düzeyinin yüksek olduğu (yaklaşık %80), icaA ve icaD genlerinin ve ürünlerinin (PIA/PNAG) biyofilm oluşumunda rol oyna-dığı, biyofilm oluşumunun fenotipik olarak gösterilmesinde mikroplak yönteminin daha duyarlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir.
KAYNAKLAR
1. Schierholz JM, Beuth J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. J Hosp Infect 2001; 49(2): 87-93. 2. Lowy FD. Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med 1998; 339(8): 520-32.
3. Vancraeynest D, Hermans K, Haesebrouck F. Genotypic and phenotypic screening of high and low virulence
Staphylococcus aureus isolates from rabbits for biyofilm formation and MSCRAMMs. Vet Microbiol 2004;
103(3-4): 241-7.
4. Watnick P, Kolter R. Biyofilm city of microbes. J Bacteriol 2000; 182(10): 2675-9.
5. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999; 284(5418): 1318-22.
6. Amorena B, Gracia E, Monzon M, et al. Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro. J Antimicrob Chemother 1999; 44(1): 43-55.
7. Ammendolia MG, Di Rosa R, Montanaro L, Arciola CR, Baldassarri L. Slime production and expression of the slime-associated antigen by staphylococcal clinical isolates. J Clin Microbiol 1999; 37(10): 3235-8.
8. Arciola CR, Baldassarri L, Montanaro L. Presence of icaA and icaD genes and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheter-associated infections. J Clin Microbiol 2001; 39(6): 2151-6.
9. Lasa I, Penades JR. Bap: A family of surface proteins involved in biofilm formation. Res Microbiol 2006; 157(2): 99-107.
10. Nabajit D. Comparison of tissue culture plate method, tube method and congo red agar method for the detection of biofilm formation by coagulase negative Staphylococcus isolated from non-clinical isolates. Int J Curr Microbiol App Sci 2014; 3(10): 810-5.
11. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989; 42(8): 872-4.
12. Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, et al. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medica l devices. J Clin Microbiol 1985; 22(6): 996-1006.
13. Cramton SE, Gerke C, Schnell NF, Nichols WW, Götz F. The intercellular adhesion (ica ) locus is present in
Staphylococcus aureus and is required for biyofilm formation. Infect Immun 1999; 67(10): 5427-33.
14. Chokr A, Watier D, Eleaume H, et al. Correlation between biofilm formation and production of polysaccharide intercellular adhesion in clinical isolates of coagulase- negative staphylococci. Int J Med Microbiol 2006; 296(6): 381-8.
15. Götz F. Staphylococcus aueus and biofilms. Mol Microbiol 2002; 43(6): 1367-78.
16. Rohde H, Mack D, Christner M, Burdelski C, Franke G, Knobloch JKM. Pathogenesis of staphylococcal device-related infections: from basic science to new diagnostic, therapeutic and prophylactic approaches. Rev Med Microbiol 2006; 17(17): 45-54.
17. Mathur T, Singhal S, Khan S, et al. Detection of biofilm formation among the clinical isolates of Staphylococci: An evaluation of three different screening methods. Indian J Med Microbiol 2006; 24(1): 25-9.
18. Toledo-Arana A, Merino N, Vergara-Irigaray M, et al. Staphylococcus aureus develops an alternative, ica-independent biofilm in the absence of the arlRS two-component system. J Bacteriol 2005; 187(15): 5318-29. 19. Kırmusaoğlu S. Staphylococcus epidermidis ve Staphylococcus aureus antibiyotik direncine sebep olan biyofilm
20. Arciola CR, Collamati S, Donati E, Montanaro L. A rapid PCR method for the detection of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus in periprosthesis infections. Diagn Mol Pathol 2001; 10(2): 130-7.
21. Cucarella C, Tormo MA, Ubeda C, et al. Role of biofilm-associated protein bap in the pathogenesis of bovine
Staphylococcus aureus. Infect Immun 2004; 72(4): 2177-85.
22. Cucarella C, Solano C, Valle J, et al. Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation. J Bacteriol 2001; 183(9): 2888-96.
