Klinik embriyo değerlendirilmesinde bir araç olarak time lapse (zaman aralıklı çekim) embriyo monitorizasyonu
Özet: Elektif tek embriyo transferinin giderek kabul görmesiyle implantasyon oranlarında iyileşme gereksinimi önem kazanmıştır. Son zamanlarda, embriyonik potansiyelin belirlenmesi için bir araç olarak dinamik embriyo gelişiminin değerlendirilmesine daha fazla dikkat çekilmiştir. İnsan embriyosu üzerinde kullanımı onaylanmış time-lapse ekipmanın getirilmesi, embriyoların sürekli izlenmesi, bilinen morfolojik parametrelerin esnek değerlendirilebilmesi ve viabiliteyle ilgili yeni potansiyel dinamik belirteçlerin saptanması konusunda klinik fırsatlar sunmaktadır. Büyük randomize çalışmaların olmaması nedeniyle dinamik parametreleri kullanarak embriyo seçiminin klinik sonuçları iyileştirdiği ve hangi parametrelerin önemli olduğu konusu aydınlatılmalıdır. Bu mini değerlendirmede viabilite ile ilgili dinamik belirteçlerle ilgili güncel bilgiler özetlenmiş ve embriyo seçiminde time-lapse analizin klinik rolü tartışılmıştır.
Giriş:
Güncel uygulamaların optimize edilmesine yönelik çabalara karşın IVF sonucu embriyoların implantasyon oranları halen düşüktür ve klinik gebelik oranları transfer başına %30 civarındadır.
Elektif tek embriyo transferi çoğul gebelik oranlarını düşürmek için etkin bir metottur. eSET’in klinik uygulamalarda giderek kabul görmesiyle en yüksek gelişim kapasitesine sahip embriyo seçimi kritik önem kazanmıştır. Güncel seçim kriterlerine ek olarak anöploidi taraması, O2 kullanımı, metabolik profil ve gen ekspresyon analizleri gibi viabiliteyle ilgili ek belirteçlerin bulunmasına yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Belirli zaman aralıklarında embriyonun morfolojik görünümü ile gelişim aşaması ve gelişimsel yeterliliği arasındaki yakın ilişki tanımlanmıştır. Dinamik sürecin farklı zamanlardaki birkaç bakışla değerlendirilmesindeki sınırlamaya yakın zamanda embriyo değerlendirme skorlarının birkaç saat içinde belirgin değişebildiği gözlemi ile dikkat çelişmiştir. Embriyonun inkübatör dışındaki sık gözlemi; ısı, nem ve gaz kompozisyonlarındaki değişimlere maruz kalmasına neden olur. İnkübasyon ortamına eklenen kamera ile time-lapse izlem, gözlem süresince kültür kondisyonlarının sabit kalması ve dinamik parametrelerin eklenmesiyle daha geniş ve yeni morfolojik değerlendirme ile ümit verici bir klinik metot sağlamaktadır. Embriyo seçiminde bu metodun rolü yakın zamandaki birkaç çalışmada araştırılmıştır. Fakat tümü tanımlayıcı çalışmalar olup birkaçında embriyo transferi de eklenmiştir. Bu mini derlemede time lapse izlemin klinik kullanımı ile ilgili güncel literatür ve embriyo değerlendirilmesinde dinamik parametre adayları gözden geçirilmiştir.
İnsan embriyosunun fertilizasyon ve erken gelişiminin kinetikleri:
Time lapse izlem, çeşitli hayvan türlerinde embriyo gelişimi kinetiklerini araştırmak için kullanılmıştır ve ilk kez tavşan embriyolarının 1929’da sinematografik filmle değerlendirilmesine uzanmaktadır.
Diğer temel çalışmalarda non-human embriyoların değişik kondisyonlardaki durumları araştırılmıştır İnsan embiyo kinetiği üzerine ilk time-lapse çalışmalardan birinde time-lapse sinematografi ile fertilizasyon ve erken embriyonik gelişim zamanları tanımlanmıştır (Payne et al., 1997), ardından daha geniş gözlem periyodu olan bir çalışma izlemiştir (Mio and Maeda, 2008). Time-lapse kesitler insan embriyosunun gelişim aşamalarındaki karakteristik olayları göstermiştir.
Viabilite ile ilgili kinetik belirteçler:
Bu bölümde, insan ve insan dışı embriyoların gelişimleri ve viabilite değerlendirilmesine dayalı time- lapse çalışmaları içeren literatür gözden geçirilmiştir. Her ne kadar blastokist transferi yüksek implantasyon oranları sağlasa da uzamış kültürün potansiyel sakıncaları (artmış maliyet, siklus iptal
riski ve in vitro kültürün IVF sonucu çocuklar üzerine şüpheli etkileri) da göz önüne alındığında blastokiste gidebilecek erken gelişim safhasındaki embriyonun seçimi ile transfer için optimum gün sağlanabilecektir. Tablo I ve II’ de insan dışı ve insan embriyolarındaki time-lapse çalışmalar gözden geçirilmiş, Tablo III ve IV’ de viabilite belirteçlerine bakış yapılmıştır.
İnsan dışı embriyolarda bölünme aşamalarının zamanı ve senkronisi
Arav ev ark. çalışmalarında ilk klivajın geç olduğu fare embriyolarında, blastosist geliştirme oranlarının daha düşük olduğu bulundu. Paralel olarak Pribenszky ve ark.ca farelerde ilk klivajın süresinin blastokiste gidiş olasılığını anlamlı oranda etkilediği, hızlı bölünen embriyoların daha olasılıkla geliştiği tanımlandı. İkincil klivajın zamanlaması da (2 den 3 hücre aşaması) gelişim potansiyeliyle belirgin korele idi. Bovin embriyolarınında benzer özellikte davrandığı ve morula-blastokiste ulaşan embriyoların ilk hücre bölünmelerinin arrest olanlara göre daha hızlı olduğu tanımlanmıştır. Canlılığını kaybeden embriyolarda hemen öncesinde hücre siklusunun yavaşlaması dikkat çekiciydi. Erken klivajla ilişkili birçok diğer çalışmayla uyumlu olarak bu bulgu, ilk bölünme siklusunda gecikmenin, 4 hücre aşamasına ulaşmada daha düşük şans ve dolayısıyla daha düşük oranda blastokist formasyonu ile ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. Farelerdeki bulguların aksine, hamster embriyolarında önceden yapılan bir çalışmada, ilk, ikinci ve üçüncü bölünmenin zaman araları gözlenmiş (1-2, 2-4 hücre ve 4-8 hücre) ve ilk bölünme aşamalarının blastokist gelişimini öngöremediği bulunmuş. Bunun yerine, 4 hücreden 8 hücreye geçiş zaman aralığının(üçüncü bölünme dönemi) blastokist oluşumunu öngördüğü saptanmış. Hayvan embriyolarında bölünmenin senkronisi ile gelişimsel potansiyel arasında belirgin korelasyon gösterilemezken, insan embriyolarında pozitif ilişki saptanmıştır.
İnsan embriyolarında bölünme aşamalarının zamanı ve senkronisi
Time-lapse analizi kullanılarak insan embriyo kinetiği ile gelişimsel ve gebelik potansiyeli arasındaki bağlantıyı araştıran 4 çalışma yayınlanmıştır. Payne ve ark., 1997’de ICSI sonrası embriyolarda ilk bölünme öncesi oluşan morfokinetik olayları nispeten küçük bir grupta(n=38)detaylı şekilde çalışmışlardır. T=1 dk. zaman aralıklı görüntü alımı ile sitoplazmik dalgalanma, iki polar cisimciğin atılması ve PN görülmesinin tanımlanması ve zamanlamalarının belirlenmesi ile fertilizasyon sonrası olayların sıralamasının net tanımlanması sağlanmıştır. Bunlardan ikinci polar cisimciğin atılması, PN görünümünde senkroni 3. gündeki embriyo kalitesi ile pozitif korele bulunmuştur. Wong ve ark.
2010’da fertilizasyon sonrası 12-16.saatlerde zigot aşamasında dondurulup çözülen n=242 embriyoyu incelemişler ancak burada ilk sitokinezis öncesi olaylar değerlendirilmemiştir. Lemmen ve ark.
2008’de IVF ve ICSI ile fertilize olan n=102 embriyoda PN görünümünün kayıp zamanını araştırmışlardır bunda da PN oluşumu öncesi olaylar araştırılmamıştır. PN görünümünün erken kaybının, 2.gün embriyosunun kalitesi ile ilişkili olduğunu gösterdiler (Tablo 4). Meseguer ve ark.
2011’ de time-lapse inkübatörde 3. gün transfer olan n=247 ICSI embriyosunu araştırdı ancak ilk klivaj öncesi olayları değerlendirmedi. İlk bölünmenin izinin başlamasından tam olarak kardeş hücrelere bölünme süresinin (ilk sitokinezis) blastokist oluşumunu öngördüğü bulunmuştur. Blastokiste ulaşan embriyolar, ilk sitokinezis sürelerini ortalama 14.3 ±6.0 dk. da tamamlamışlardır. Birçok sistemde her 10-20 dk aralıkla görüntü alınması nedeniyle bu parametrenin prognostik bir parametre olarak kullanımı tartışmalıdır. Her ne kadar nadiren bazı anomalilerin belirtisi olduğu ve düşük gelişim potansiyeliyle ilişkili olduğunu gösteren bulgular olsa da birçok grup tarafından erken ilk klivaj, gelişimsel yeterlilik için bir noninvaziv yöntem olarak değerlendirilmiştir.
Wong ve ark.’ca, iki hücre aşamasının süresi, blastokist oluşumunu predike edici bulundu ancak Meseguer ve ark.ca gebeliği predikte edici bulunmadı.
Beş hücreli aşamaya dek olan bölünmeler Meseguer ve ark.ca detaylı olarak incelendi. İmplante olan embriyoların bölünme için daha benzer bir patern izlediği gözlendi.
Gelişimde eşzamanlık, embriyo yeterliliği için pozitif bir öngörücü faktör olarak öne sürüldü. Lemmen ve ark. gebelikle sonuçlanan embriyolarda ilk bölünme sonrası birinci ve ikinci blastomerdeki nukleus görünümü eşzamanlılığının implante olmayan embriyolara göre anlamlı olarak yüksek oranda olduğunu bildirdiler. İlk hücre siklusundaki senkroninin blastokist gelişimi ve gebelik potansiyeliyle pozitif ilişkisi geniş çaplı çalışmalarla da desteklendi.
Bu dört çalışmaya dayanarak, canlılık potansiyeli olan embriyolar daha hızlı ve senkron bölünme paterni izliyor görünmektedirler. Time-lapse izlem ile statik değerlendirmede viable olarak değerlendirilen ancak anormal bölünme paterni izleyen embriyoların ayrılabilmesi sağlanır görünmektedir.
Fertilizasyon metodu ve kültür ortamlarının önemi
Seçilen kültür mediumunun insan embriyolarında bölünme oranlarını etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca fertilizasyon metodunun ilk bölünme zamanını etkilediği, 4 hücreli aşamanın benzer zamanda olmasına rağmen ICSI embriyolarının IVF embriyolarına göre daha hızlı bölündüğüne bazı çalışmalarda dikkat çekilmiştir.
Fragmantasyon ve blastomer eşitsizliği
İnsan embriyosunda time lapse ile iki farklı fragmantasyon paterni dökümante edildi: Definitif fragmantasyon ve geçici fragmantasyon. Fragmanların embriyo tarafından rezorbe edilebildiği gözlemi diğer time-lapse çalışmaları ile konfirme edildi. Fragment rezorpsiyonunun çoğunlukla ilk ve normal sitokinez sırasında ve orta düzeyde fragmentasyonda olduğu, bunun aksine anormal sitokinezi olan embriyolarda nadiren rezorbsiyon olduğu bildirilmiş. Özet olarak time lapse çalışmalarında fragment rezorbsiyonunun olduğu ancak anlam ve sıklığının açıklığa kavuşturulmayı beklediği bildirilmiş.
İn vitro blastokist kinetiği
Bazı çalışmalar invitro ve invivo hatching arasında farklılık olduğuna işaret etmektedir. Pulsatil hareketler çeşitli canlı türlerinde tanımlanmıştır. Devam eden genişleme ve zona incelmesi in vitro hatching için en olası neden olarak düşünülür. Bazıları pulsatil hareketleri hatching olayını etkilemeyen normal bir bulgu olarak kabul ederken bazıları hatching prosesini aksattığını rapor etti. Bir hatching metodu olarak öne sürülen trofoektodemin sitoplazmik uzantıları time-lapse izlem kullanılarak insanları da içeren çeşitli memeli türlerinde gözlendi. Fare embriyolarının time lapse analizinde, blastomer biyosisi sonrası blastokist formasyonuyla hatching arası sürede kontraksiyon ve genişlemelerin sayısının biyopsi yapılmayan kontrollere göre belirgin olarak arttığı ortaya çıktı. Fakat bu bulgu klivaj aşamasında biyosi yapılan geniş bir insan embriyo serisinde konfirme edilmedi.
Blastokist kinetiği ile embriyonun implantasyon potansiyeli arasındaki ilişki araştırılmalıdır.
Klinik embriyo değerlendirmede kullanılan parametreler ve terminaloji
Time lapse kayıt, embriyo değerlendirme için çeşitli dinamik morfolojik parametreler sunar. Fakat veri analizleri ve çalışmalar arası karşılaştırma terminaloji ve olayların tanımı ve zamanlamalarındaki farklılık nedeniyle karmaşıklaşmıştır.
Yazarlar Tablo 5’te time-lapse değerlendirmede kullanılabilecek parametreler için önerilerini ayrıntılı olarak sunmuşlardır.
Time lapse analizin güvenirliği
Time lapse analizini klinik uygulamaya geçirmeden önce güvenirliğinin değerlendirilmesi önemli bir durumdur. Time lapse görüntüleme ışığa periyodik olarak maruz kalmayı gerektirir. Işığa yoğun maruziyetin embriyo gelişiminde olumsuz etkisi olabileceği, özellikle kısa dalga boylu ışık maruziyetinin minimalize edilmesi gerektiği gösterilmiştir. Bazı time lapse sistemlerde bulunan sürekli elektromanyetik alanın varlığı embriyo gelişimini etkileyebilir. Kültür kondisyonlarının stabilitesi göz önünde olması gereken başka önemli bir faktördür ki değişik dizayn enstrümanlarda farklı olabilir. Fare ve insan embriyolarında konvansiyonel inkübatörlerle ve time lapse enstrümanla kültür edilen embriyolar arası karşılaştırmalarda; gelişim ve implantasyon oranlarında herhangi olumsuz etki gösterilmemiştir. Fakat bu raporlar tanımlayıcı çalışmalardaki ek gözlemlerden oluşmuştur. Cruz ve ark. donasyon yapılan oositlerden gelişen 478 embriyoyu incelemişler ve time lapse ekipmanla inkübasyonun standart inkübatörle karşılaştırıldığında, embriyo kalitesi, blastokist ve devam eden gebelik oranları açısından eşdeğer olduğu bildirdiler. Yazarlar bu çalışmanın randomize olmadığı ve donasyon oositlerinin infertil populasyonu yansıtmayabileceğini ekliyorlar. İki merkezli, randomize kontrollü 676 oositi içeren kendi yeni çalışmalarında benzer bulgular saptanmış. Yine de konunun önemi nedeniyle güvenliğin sürekli olarak değerlendirilmesi gerektiği bildiriliyor.
Sonuç
Time lapse analiz, günümüzdeki morfolojik değerlendirmelerin duyarlılığını artıran yeni bir non invaziv metod olarak ve yeni dinamik parametrelerin eklenmesiyle embriyo gelişiminin sürekli olarak monitorize edilebilmesini sağlar. İnsan ve hayvanlardaki retrospektif çalışmalara dayalı birçok olası viabilite belirteci öne sürülmüştür ancak hangi parametrelerin belirleyici olduğuna dair kesin bilgi bulunmamaktadır. İnsanlarda time lapse sistem kullanılarak kısa zaman aralıklı görüntülerle gebeliği veya gelişimi öngören parametreler saptanmıştır ve bunların uzun zaman aralıklı kayıtlı klinik sistemlerde kullanımı tartışmalıdır. Erken gelişimsel olayların zamanlaması ile blastokiste gelişim olasılığı yüksek embriyonun seçimi, uzamış in vitro kültürden kaçınılmasını sağlayabilecektir. Ayrıca time lapse izlem, statik değerlendirmede viable görünen ancak normal dışı bölünme paterni gösteren embriyoların ayrılmasında kullanılabilecek görünmektedir. En yüksek gebelik potansiyelindeki embriyoların belirlenebilmesi için statik parametrelerle dinamik parametrelerin kombine edildiği hiyerarşik prediktif bir model yakın zamanda Meseguer ve ark. tarafından sunulmuştur. Time lapse izlemle embriyo değerlendirmede artmış duyarlılığın gebelik oranlarında artışı sağlayabileceği açıklığa kavuşturulmalıdır. Bu sorunun cevabı için daha ileri randomize klinik çalışmalara ihtiyaç vardır.
