İMMÜNOHİSTOKİMYA BOYAMA YÖNTEMLERİ-I

(1)

PATOLOJİ LABORATUVAR TEKNİKLERİ PROGRAMI SAĞLIK HİZMETLERİ MESLEK

YÜKSEKOKULU

PLT209-Özel Histokimya Teknikleri

Öğretim Görevlisi Dr. Nurhan ÇON

İMMÜNOHİSTOKİMYA BOYAMA YÖNTEMLERİ-I

Hafta-8

PLT209-Özel Histokimya Teknikleri

(2)

İmmunohistokimyasal İşaretleme Yöntemleri

• İmmunohistokimyada esas prensip

dokudaki antijenlerin orataya çıkarılması veya görülebilir hale getirilmesi amacıyla işaretlenmiş antikorların kullanılmasıdır.

• Bu yöntem antijen-antikor reaksiyonunu kullanarak antijenlerin dokuda bulundukları yerde gösterilmesini sağlar.

• İyi bir immunohistokimyasal boyamada doku yapısı iyi korunmuş, doku

antijenlerinin çözünmez hale getirilmesi ve antikorun kendisini tanıması için uygun durumda korunması gereklidir.

• Bu sebeple araştırılması planlanan

antijenlerin özellikleri göz önüne alınarak

uygun takip prosedürleri ile muamele

edilmesi gerekliliği çıkmaktadır.

(3)

İmmunohistokimyasal teknik;

• Yayma preparatlarına,

• fikse edilmiş veya edilmemiş kriyostat kesitlere,

• formaldehit solusyonu ile fikse edilmiş parafin veya

• epoksi rezine

gömülmüş ince ya da yarı ince kesitlere uygulanabilmektedir.

İmmunohistokimayada iki tip işaretleme yöntemi kullanılmaktadır;

 Direk (Tek aşamalı) yöntem

 İndirek (İki aşamalı) yöntem

(4)

İşaretli primer antikorla spesifik antijen antikor reaksiyonu

•Kullanılan bu yöntemle antijene özgü antikor; florasan boya, enzim, altın tanecikleri v.b. ile işaretlenir.

•İşaretlenen antikorun dokudaki antijenle reaksiyona girmesi sağlanır.

•Yöntem tek aşamalı olduğu için çabuk tamamlanır.

•Yöntemin hassasiyeti düşük olduğundan nadiren

kullanılmaktadır.

DİREKT YÖNTEM

(6) İndirekt Yöntem

•Bu yöntemde primer antikor işaretlenmez.

• İki aşamadan oluşur.

1. İşaretsiz primer antikor antijene bağlanır.

2. İşaretli sekonder antikor primer antikorun Fc bölgesi ile reaksiyona girer, antijen iki aşamada indirekt olarak işaretlenmiş olur.

İndirekt yöntem, direkt yönteme göre çok daha hassastır. Primer antikorile birden fazla sekonder antikorbağlanabilir ve daha güçlü bir işaretleme elde edilebilir.

İNDİREKT YÖNTEM

(5)

İmmunohistokimya için gerekli koşullar

• İmmunohistokimyada temel koşullar şunlardır:

1. Antijenin korunması 2. Özgün boyanma

3. Özgün olmayan sonuçların düzeltilmesi 4. Kolay görülebilen bir işaretleyici

Antijenin Korunması

• Başarılı bir immunohistokimya, doku

antijenlerinin tersiyer yapılarında önemli bir değişiklik oluşturmadan çözünmez hale

getirilmesi ve antikorların kendilerini tanıması için korunması gerekir.

• Bunun yanında doku yapısı da iyi korunmuş (fikse edilmiş) olmalı immünreaktif hücre veya organel kolayca tanınabilmeli.

• Burada en önemli nokta; dokunun taze iken

hazırlanmasıdır.

(6)

Özgün Boyanma

• İmmunohistokimyada pozitif görünen bir sonuç gerçekten pozitif boyanma olabilir ancak özgün olmayan reaksiyon riski de mevcuttur.

• Bu risk, sonuçlar doğru olarak kabul edilmeden önce mutlaka yok edilmelidir.

• Uygulanacak metodun ve antiserumun özgün olup olmadığının kontrol edilmesi gerekir.

Özgün Olmayan Sonuçların Düzeltilmesi

• A.İmmunoabsorbsiyon: Antiserumun spesifik antijenler immunoabsorbsiyonu ve antikorun daha sonra ayrılarak

saflaştırılması.

• B.Seyreltme oranı (Dilüsyon): Yüksek dilüsyon, antiserumdaki istenmeyen antikorların miktarının serumdaki

spesifik antikorlara kıyasla azalmasına

neden olur.

(7)

• C.Serum veya albümin ile absorbsiyon:

İmmunoglobulinlerin doku elemanlarına hidrofobik veya elektrostatik güçlerle spesifik olmayan şekilde bağlanması.

• D.Antikorun özgün antijenle absorbsiyonu

• E.Çapraz reaksiyondan kaynaklanan özgün olmayan boyanma

Kolay Görülebilen Bir İşaretleyici

• Yöntemin amacı; antijenlerin dokuda

bulundukları yerde gösterilmesi ve

antikorların elde edilmesinden sonra

antijenlerin işaretlenmesi.

(8)

• Gerek ışık, gerekse elektron mikroskopta antikorları işaretlemek amacıyla;

flüoresan boyalar,

enzimler,

altın tanecikleri ve

biyotin aracılar olarak kullanılmaktadır.

• Antikorlar flüoresan boya ile

işaretlenirse yönteme immünfluoresan yöntemi;

• Enzimlerle işaretlenirse immün enzim;

• Altınla işaretlenirse immün altın yöntemi;

• Biyotinle işaretlenirse sonraki aşamaya

göre avidin biyotin veya streptavidin

biyotin yöntemi adları verilmektedir.

(9)

Immunohistokimya adımları

Antijen retrieval Doku kesitleri

Endojen enzimlerin bloklanması Primary antibody

Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting

Mikroskopik inceleme

Immunohistokimya adımları

1. Dokunun fikse edilmesi (Formalin)

2. Deparafinize ve rehidrasyon

3. Doku kesitlerinin hazırlanması

(10)

Immunohistokimya adımları

Antijen retrieval reagent ile muamele edilen örneklerde antijenlerin görünürlüğü artırılır. Antijen retrieval reagent, formalin fiksasyonu sırasında oluşan protein çapraz bağlarını kırarak antijenik site ları görünür duruma getirir.

Bu amaçla iki yöntem kullanılır.:

1. Isıtma "Heat Induced Epitope Retrieval (HIER)".

2. Enzimatik parçalama "Proteolytic Induced Epitope Retrieval (PIER)".

Immunohistokimya adımları

Antijen dönüşü Doku kesitleri

Endojen peroksidaz deaktivasyonu Eğer immunoperoksidaz işaretleme (peroxidase anti-peroxidase veya avidin/biotin peroxidase) kullanılırsa dokudaki endojen peroksidaz aktivitesinin inhibe edilmesi gerekmektedir. Bunun için en sık kullanılan bloklama ajanı Hydrogen peroxide (H₂O₂) dir. ,

(11)

Immunohistokimya adımları

Immunohistokimyasal boyamada en önemli basamaklardan biri antibodylerin hedef proteinleri tanımasıdır.

Antibodyler oldukça spesifik bağlanma gösterdiklerinden yalnızda dokudaki hedef proteinleri tanırlar.

Immunohistokimya adımları

Secondary antibody Chromogen substrat Counterstain Mounting Mikroskopik

Secondary antibodyler duyarlılığın artmasını sağlarlar.

(12)

Immunohistokimya adımları

Antibodiler mikroskop altında görünür değildirler bu yüzden işaretlenmeleri gerekir. Ancak işaretleme yaparken antibodynin bağlanma spesifikliğini etkilememek oldukça önemlidir.

Antibody- antijen bağlanmasını görünür duruma getirmek için çeşitli belirleme yöntemleri kullanılır.

Kromojenik belirleme : Antibodye bağlı olan enzim substratı ile reaksiyona girerek proteinin bulunduğu yerde renkli bir ışıma verir.

Florosan belirleme : Antibodye bağlı olan florofor, florasan mikroskobu yardımıyla görünür.

Kullanılan işaretler:

•fluorochromes ( fluorescein, rhodamine),

•enzimler ( peroxidase, alkaline phosphatase)

•Elektron saçan bileşenler (Elektron mikroskobu ile görüntüleme için) ( ferritin, colloidal gold)

Immunohistokimya adımları

Hedef antijenin immunohistokimyasal boyanmasının ardından boyamanın daha belirgin olması için ikinci bir boyama işlemi yapılır. Bu boyaların çoğu belirli hücresel komponentlere ve antijenlere spesifiklik gösterirken bir kısmı bütün hücreyi boyayabilir.

Type Dye Target Color

Chromogenic Hematoxylin Nuclei Blue to violet

Chromogenic Nuclear fast red

(Kernechtrot) Nucleic acids Red Chromogenic Methyl green Nucleic acids Green

Fluorescent >Hoechst stain Nucleic acids Blue

Fluorescent

target="_blank">

4', 6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI)

Nucleic acids Blue

Fluorescent Propidium iodide Nucleic acids Red

Fluorescent >Fluorophore- tagged phalloidin

Filamentous actin

Fluorophore- specific

(13)

Immunohistokimya adımları

Tüm immunohistokimyasal boyama işlemleri bittikten sonra örneklerin uzun süreli kullanımı ve saklanması için korunması gerekmektedir. Bu amaçla boyanmış doku kesitini lam üzerine sabitlemek/mühürlemek için çeşitli stabilizatörler kullanılır.