30(1). 89-97.2004 30(1), 89-97, 2004
H P L C İLE V İ T A M İ N A V E E ' N İ N F L O R E S A N S D E D E K T Ö R V E T E R S F A Z K O L O N A R A C I L I Ğ I N D A M İ K T A R T A Y İ N İ V E K O L O N P E R F O R M A N S I N I N
Ö L Ç Ü M Ü *
Quantitative determination of vitamin A and E through florecence dedector and reversed phase column and measurement of column performance by H P L C
Summary: The aim of this study is the using and performance controling of Hypersil ODS Column and Florescence dedeklor with HPLC. With the same phase and with different program (vitamin A: Ex;
340nm-Em: 460. Vitamin E: Ex: 298-Em: 350). Vitamin A and E were dedected and to this target Hypersil ODS reversed phase column was found useful in this work. With its filling material (5 um, RCM 100 RP18.
reversed Phasel column is very sensitive and has a speciall highseparator peculiarity. Vitamins, especially latsoluble vitamins: has more difficulties to extract and to determine. HPLC is used since seventies in the animal, food .medical and chemical industry and has more difficulties with its filling material and capacity of colons. Technical datum of column is very variable with flow liquid, and dedected material. In this work we found timing of vitamins and their area and performans of column with flow rate of HPLC. With this result consantrations can be determined.
Key words: Hypersil ODS. vitamin A and E. reversed phase, florescence dedector.
Özet: Bu çalışmada Hypersil ODS kolonun ve lloresans dedektöriin Vitamin A ve E'nin tayini için kullanılması ve performanslarını ölçümü amaçlanmıştır. Vitamin A ve E'nin floresans dedektörle aynı ortamda farklı programla (vitamin A: Ex:340nm-Em:460. Vitamin E: Ex:298-Fm:350) okunabildiği ve bu amaç için Hypersil ODS ters faz kolonunun kullanılabileceği açıklanmıştır. Kolon; içerdiği dolgu (5 um.
RCM 100 RP18. reversed Phase) maddesi açısından hassas ve yüksek ayırıcı özelliğe sahiptir. Vitaminler:
Özellikle yağda çözünenler, ekstraksiyon ve miktar tayini açısından zorluklar arz etmektedirler. Hayvancılık, gıda. ilaç ve kimya sektöründe 70'li yıllardan günümüze kadar kullanılan HPLC. kolon kapasitesi ve kolon dolgu maddesinden kaynaklanan özelliklerinden dolayı zorluklar gösteren bir sistemdir. Kolonların teknik verileri; uygulama esnasındaki kullanılan taşıyıcı sıvının ve tespit edilen maddenin özelliğine bağlı olarak değişim göstermektedir.!iu çalışmada akış hızı ile yapılan performans tayininde ve program çalışmasında Vitaminlerin kromatogramları vemeydana getirdikleri alanlar tespit edilmiştir. Bu sonuçlarla konsantrasyon tayini yapılmıştır.
Anahtar kelimler: Hypersil ODS. Vitamin A ve E. revers faz. floresans dedektör.
İstanbul Üniversitesi Araştırma Fonu sekerterliğince desteklenmiştir Proje. No: 1447/0505200.
İstanbul üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı. 34320 Nezir Yaşar TOKER**
90 Nezir Yaşar TOKER
G i r i ş
G ü n ü m ü z ; hayvancılık, gıda, ilaç ve kimya s e k t ö r ü n d e üretilen tüketim maddeleri içerisinde, kullanılan katkı maddeleri ve İçerikleri b a k ı m ı n d a n belirtilen miktarlar açısından ayrıcalık ve değer k a z a n d ı r m a k t a d ı r .
Bazı vitaminler, antioksidan olmaları nedeniyle, g ü n ü m ü z gelişen t o p l u m l a r ı n d a gıdalara ilave edilmek suretiyle en çok tüketilen maddelerdendir (2, 4, 6, 8).
Vitaminlerin çok geniş kullanım alanı bulmasına r a ğ m e n çok az miktarlarda (u.g/1) kullanılmaları, ve bazı Vitaminlerin y a ğ d a erimeleri. ekstraksİyonda meydana getirdikleri zorluklar nedeniyle tespitlerini de önemli kılmaktadır.
Y a ğ d a çözünen vitaminlerden A ve E; gıdalarda, özellikle yağlı yiyeceklerde bulunmaktadır. Yağlı yiyeceklerin bozulmaları içerdikleri vitamin A ve E miktarıyla ters orantılı olarak değişmektedir (2, 7, 9,10).
Yetmişli yıllardan sonra HPLC bu tür analizlerde kullanılan en önemli metot olmuştur. Kullanılan kolonlar performansları ile metodun önemini arttırmaktadır {4, 5, 8). Kolonların kalitesi içerdikleri dolgu maddesinden k a y n a k l a n m a k t a d ı r . Ç o ğ u n l u k l a kolonlar USA"nın A I S I normlarına uygun olarak çelikten imal edilmektedir. Bu normda kullanılan madde K r o m - N i k e l - M o l i b d e n - Ç e l i k ' d i r . ve bileşenlerinin en önemli özelliği basınca ve korozyona dayanıklı olmasıdır .
ODS-Hypersil kolon. 5 um b ü y ü k l ü ğ ü n d e . R C M 100 RPI8'le d o l d u r u l m u ş : yuvarlak çelikten mamul maksimum akış hızı 1.5 m l d a k i k a olabilen ters faz sınıfına dahil bir kolondur.
Bu çalışmada Hypersil ODS ters faz kolon kullanılarak vitamin A ve E"nin tespitini floresans dedektör aracılığı ile kolaylaştırma hedeflenmiştir. I liroshi ve ark. (7) floresans dedektör kullanarak vitamin E'nİn bitkisel y a ğ l a r d a tespitini yapmışlardır.
M a t e r y a l v e M e t o t
Testlerde kullanılan sıvılar (Merck G m b H Germany) H P L C Grade olarak temin edilmiştir.
Vitamin A (retinol) ve E'nin (a-tokoferol) tayini H P L C florasan d e d e k t ö r (Jasco 820-FP). L u t e g r a t ö r (HP-3394 A ) , latek-400 P model pompa, 100 ul hacmindeki enjeksiyon ünitesi, ile Hypersil ODS (5u.m-i50x 4.6 m m . R C M 100 RP18 ü e d o l d u r u l m u ş (Supelco. Inc. Supelco Park. Bellol'anta. PA16823-0O48) ters faz kolon aracılığı ile yapıldı.
V i t a m i n A (2 ng/100p!-150 ng/lOOul) ve E (1 ng/lOOp.1-100 ng/100u.l) (Fluka HPLC grade)'lerden miktar tayini yapmak için etanol içersinde farklı oranlarda standartlar hazırlandı. Hazırlanan standartlar HPLC'de çalışmak için gerekli miktarlarda porsiyonlanarak derin dondurucuda (-40 °C ) muhafaza edildi ( 6 , 7 , 9 ) .
HPLC'de taşıyıcı sıvı olarak metanol kullanılarak Vitamin A ve E'nin miktar tayini yapılmıştır (7,1, 13).
Vitamin A ve E metanol içersinde hazırlanarak ortak çalışma programı u y g u l a n ı p , ekstinksiyon ve emisyon için farklı dalga boyları uygulanarak o k u n m u ş l a r d ı r ( 1 , 5 , 6 , 8).
T a b l o 1. Kromatografi k o ş u l l a n (condition o f chromatography).
Dedektör Vitamin A Vitamin E
Okuma
Attenuation (duyarlılık) Gam (kazanımı Response(cevapj Dedektör programı
Ex: 340 nm-Em: 460 16
X10 Slow (yavaş)
0.-7 dakika
Ex: 298 nm-Em: 350 16
X10 Slow (yavaş) 7.-20 dakika
B u l g u l a r
Yapılan çalışmalar sonucunda kolonun kapasitesini ö l ç m e k için farklı hızlarda aynı standart çözeltiden (ng/100 u.i) uygulanarak elde edilen alanların hesabı yapılmış ve sonuçta hızın en ideal 0.6 mî/dakika o l d u ğ u bulunmuştur.
T a b l o 2. İdeal akış hızı tespit tablosu (confirm table o f ideal flow rate).
Akış Hızı Elde edilen alan
1.5 ml/min 155 520
1.5 ml/min 154 500
1 ml/min 231 380
1 ml/min 221 487
0.8 ml/min 2S3 530
0.8 ml/min 260 450
0.6 ml/min 350 940
0.6 ml/min 363 754
B u metotdaki a m a ç literatür b i l g i veya teknik bilgi olarak verilen kolon akış hızının tespit edilen alana etkisi ve dolayısı ile konsantrasyona bağlı elde edilen alanlara etkisi tespit edilerek kolon akış hız kondisyonunun önemi vurgulanmıştır. Ticari olarak elde edilen kolonun teknik olarak verilen bilgilerdeki maksimum h ı z kapasitesi 1.5 mi/dakika o l m a s ı n a r a ğ m e n 1.5 ml/dakikadan başlayarak yapılan ç a l ı ş m a d a h ı z
92 Nezir Yaşar TOKER
azaldıkça elde edilen alan miktarının arttığı dolayısı ile konsantrasyonun daha i y i tespit edildiği ve 0.6 ml/dakikada en yüksek alan kapasitesine ulaşıldığı, 0.6 m!/dakikanın altındaki hızlarda elde edilen piklerin performansının b o z u k l u ğ u ve değerlerinin tekrar d ü ş t ü ğ ü tespit edilmiştir.
Y u k a r ı d a k i tablodan anlaşıldığı gibi kolon için en idea! akış hızı 0.6 ml''dakika olarak bulunmuştur.
Standart L i n e a r Grafik
Bulunan vitamin değerlerinin h e s a p l a n m a s ı için elde edilen alanın karşılaştırılmasında kullanmak için yapılan standart çözeltilerin şekilleri (1-5) ve elde edilen alanların değerleri a ş a ğ ı d a Tablo 3'dedir.
Şekil 1, 2, 3, 4 ve 5'de standartlara karşı elde edilen kromatografık alanlar ve bunlara karşılık gelen konsantrasyon değerleri verilmiştir.
V i t E
V i t A
V i t E
ÎEiK
a. M 3.*3
« R E f t TYPE
z a e s ı ' rv
0303 3 3 i 9 2 BP
AR.-HT 8 . 4 Î ?
«. 2 ? 4 e . 382
s ı . ı e
3 3 . 3 ?
RT
ı.aı
3 . « i 3 . i l 3 . * ? S . 2 1
ft-£fl T Y P E A K - H T
« 3 8 9 i P P 8 . 3 7 3 1 2 8 1 8 BV 0 . 2 * 9 9 * j e e . v v • . 3 2 2 1 3 4 3 ] GP 0 . 3 ( 1 1 9 * 3 7 PV e . » 3 ? I 2 « 3 i » GV 8 . 4 2 1
4 . 4 9 7 2 * .
1 2 . İ S * 3 . « 9 *
2 Î 3
T B İ P İ L S R E B -
Şekil I . 1 nolu standart (standart number 1). Şekil 2. 2 nolu standart (standart number 2).
V i t E
Vit A
RUN I 2 *
RT TYPE ftfi/HT
1.31 1Î41 SV 9.117 i, ses
• . S 3 2*87 vv e . m e. 735
ı . t s P¥ a. ı ı ı 8.38Î
1, M ı S 5 M VP 8.321 « . İ M
3.6« ??m B9 8,399 2 2 . 9 1 8
9.3? IV 8.398 71.814
1Î.7S I BP e . B Î : 8.319
TOTAL mü' 33S21B
Şekil 3. 3 nolu standart (standart number 3).
V i t E
Vit A
RUN • 15
»W:
e ı t c * im « ' « T
YH ( . 1 ( 4 3 t . 3 t » fV 6 . 4 4 1 4 . 3 7 « S B Î 1 İ VV » . 3 « « . 5 6 7 İtil V8 e. I M 1 . 1 9 1 11*1*1 ( V « . 3 9 9 1 Î . H 7
! 3 < 3 ! ( f i e , M I 4 7 . 1 7 7
î i l i PV t. « 3
TOTAL M î * ' 1 8 Î I 7 M
Şekil 4. 4 nolu standart (standart number 4).
Nezir Yaşar TOKER
Vit A V i t E
m » ı . 7~ &
9 . 1 2 - - ' - • * . - -
•* . *
0 -
1 O -f¬
-» & = e
» S •* 3 3 3 O 1 l e*5
i 3 a -t
T 7 P E
B V 8 . 3 3 9
S a e
I . ; » •
a . «s a t-
O I Ol. A f» F ,
5. 5 nolu standart (standart number 5).
Tablo 3. Standart linear grafik tablosu (table of standart linear graphic)
S t a n d a r t V i t a m i n A l a n V i t a m i n E A l a n
Standart 1 0.2453 n g / 100 ul 8 505 0,928 ng / 100 ul 35 692
Standart 2 0 . 9 8 1 2 ng / 100 ul 35 433 3 . 7 1 2 n g / 100 ul ı 2 S 5 6 0
Standart 3 1.9624 ng / 100 ul 77 453 7.424 ng / 100 ul 239 500
Standart 4 3 . 9 2 4 8 ng / 100 ul 126 130 14.848 ng / 100 ul 5 3 4 320
Standart 5 39.248 n g / 100 ul 1 301 100 148.480 ng / 100 ul 5 355 0 0 0
Vnamin A için: 0 . 2 - 5 0 Lig / 100 uL arası linear olup r: 0 . 9 9 9 9 elde edilmiştir.
Vitamin E için: 0 . 9 - 1 5 0 Lig / 100 JJL arası linear olup r: 0 . 9 9 6 6 elde edilmiştir
T a r t ı ş m a
Literatür bilgiler d o ğ r u l t u s u n d a metodik olarak yapılan bu ç a l ı ş m a d a floresans d e d e k t ö r aracılığı ile vitamin A ve E'nin HPLC ile tayini ve değerlerin istatİstiki anlamları ortaya k o n m u ş t u r . Yazarların çoğu vitamin E için U V d e d e k t ö r ü tercih e t m i ş l e r d i r (3, 4, 8 , 1 1 ) .
Elde edilen minimum değerler yazarların kullandığı standart d e ğ e r l e r uygun (5, 8, 10) olup Vitamin A ve E'de minimum d e ğ e r l e r olarak Tablo 3'de verilen d e ğ e r l e r b u l u n m u ş ve linear grafikdeki r değeri vitamin A için: 0.9999, vitamin E için; 0.9966 gibi istatistiki anlamı büyük olan d e ğ e r l e r tespit edilmiştir. Yapılan ç a l ı ş m a d a ortak program uygulayıp her iki standart aynı ortamda vitamin A ve E n g / 1 0 0 u.1 hacminde enjekte edilerek kromatografi koşulları test edilmiş ve her i k i vitaminin aynı ortamda b u l u n m a s ı n ı n performans açısından herhangi bir zorluk onaya getirmediği tespit edilmiştir.
Vitamin A için Ex: 340 nm- Em: 460 nm. vitamin E için Ex; 298 nm- Em:350 nm (1, 3, 5, 7, 9, 12). Ortak çalışma proğramı her i k i vitaminin aynı ortamda tespit edilmesine olanak sağladığı için vitaminleri ayrı ayrı tespit ederken kaybedilecek zaman ve sarf malzemelerinden tasarruf imkanı sağlamıştır. Bu çalışma ile her i k i vitaminin floresans özellikler gösterdiği ve floresans d e d e k t ö r l e r aracılığı ile kolayca tespit edildiği bir kez daha vurgulanmıştır.
Kullanılan kolon özellikleri b a k ı m ı n d a n kolay temin edilebilen ve HPLC'de vitamin tayininde kapasitesi ve ayrıştırması b a k ı m ı n d a n m ü k e m m e l e yakın özelliklere sahiptir. Gimeno ve ark. (6) da gıdalardaki vitamin E nin hızlı tespitende floresans d e d e k t ö r kullanarak miktar tayini y a p m ı ş l a r vc değerlerimizin istatistiki önemi ve en düşük tespit edilen miktar biribiriyle uyuşmaktadır. Şekil 1. 2. 3. 4 ve 5'de elde edilen d e ğ e r l e r ve linearitenin ö n e m i Barbas ve ark. (1) ve Crissey ve ark. (3) elde ettikleri
96 Nezir Yaşar TOK ER
d e ğ e r l e r kıyaslandığında çalışma koşullarımızın m ü k e m m e l e yakınlığını ortaya ç ı k a r m a k t a d ı r . En düşük değer olarak tespit ettiğimiz vitamin A ve E değerleri Melchert ve ark.nın (8) miktar tayini ile de k a r ş ı l a ş t ı r a b i l i r ve istatistiksel olarak anlamlı b u l u n m u ş t u r .
K a y n a k l a r
1. Barbas, C , Mario, C , Bartolome, II., Marta, V., Emilio. II.: Simultaneous determination of vitamins A and E in rat tissues by high-perlbrmance liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 1997: 778: 415-420.
2. Brown, K . , Reid, A., White, T . , Henderson, T . , Hukin. S., Johnstone, C Glen. A.:
Vitamin E . lipids, and lipid peroxidation products in tardive dysinesa. Society of Biological Psychiatry. 1998:43:863-867.
3. Crissey, S. D., Patricia McGill., Ann-Marie, S.: Influence of dietary vitamins A and E serum a- and y-tocopherols, retinol rctinyl palmitate and carotcnoid concentrations in Humboldt penguins (Spheniscus humboldti). Compcrative Biochemistry and Physiology.
Part A. 1998; 121: 333-339.
4. Crissey, S. I)., Randall, W.: Serum a- and y-tocophcrols and retinol. rctinyl palmitai. and carotcnoid concentrations in captive and free-ranging boltlcnose dolphins (Tursiops truncatus). Comperativc Biochemistry and Physiology. Part B. 1999; 124: 391-396.
5. Fuxusawa, N . : Rapid high-performance liquid chromatograhic identification/quantitlcation of total vitamin C in fruit drinks. Food Control. 2001: 12: 27-29.
6. Gimeno, E . , Catellote, A. I., Lamuela-Raventos, R. M., de la Torre, M . C , Lopez- Sabater, M. C : Rapid determination of vitamin E in vegetables oils by reverscd-phase high- performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2000: 881: 251 -254.
7. Iliroshi, I . : Determination of tocopherol acetate in emulsified nutritional supplements by solid-phase extraction and hihg-pcrformancc liquid chromatography with fluorcccnce detection. Journal of Chromatography A. 2000; 881: 243-249.
8. Melchert, H. U . , Pabel, E . : Quantitative determination of a-.^-.y- and 8-tocopherols in human scrum by high-performance liquid chromatography and gas chromatography- mass spectrometry as trimeihylsilyl derivatives with a two-step sample preparation. Journal of Chromatography A, 2000; 896: 209-215.
9. Moreno, P., Salvado, V.: Determination of eight water -and fat-soluble vitamins in multi
vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 2000; 870: 207-215.
10. Rizzo, C , Dionisi-Vici, C , DTppoliti, M . , Fina. F . , Sabetta, G . , Federic, G . : A simple and rapid HPLC method for simultaneous determination of plasma 7-dehydrocholesteroI and vitamin E: its application in Smith-Lemli-Opitz patients. Clinica Chimiea Acta. 2000: 291:
97-102.
11. Sirimanne, S. R., Patterson, D. G . , Ma, L - , Justice. J . B-: Application of cloud-point extraction-reverscd-phase high performance liquid chromatography: A preliminary study of extraction and quantification of vitamins and E in human serum and whole blood. Journal of Chromatography B, 1998: 716: 129-137.
12. Tavridou. A., Unwin, N. C , Laker, M . F . , White, George, K., Alberti, M . M.: Serum concentrations of vitamins A and E in impaired glucose tolerance. Clinica Chimica Acta.
1997: 266: 129-140.
13. Vaananen, P. S., Ollilainen, V., Mattila, P., Klehikoinen, R., Salmela-Molsa, E . , Piirnnen, V.: Simultaneous HPLC analysis of fat-soluble vitamins in selected animal products after small-scale extraction. Food Chemistry. 2000: 7: 535-543.
