T.C.
SAKARYA ÜN VERS TES
FEN B L MLER ENST TÜSÜ
ALL UM SCODOPRASUM SUBSP. ROTUNDUM, ALL UM STAT C FORME VE ALL UM SUBH RSUTUM TÜRLER N N ANT M KROB YAL VE ANT OKS DAN
AKT V TELER N N ARA TIRILMASI
YÜKSEK L SANS TEZ
Alican Bahadır SEMERC
Enstitü Anabilim Dalı : B YOLOJ
Tez Danı manı : Dr. Ö r. Üyesi Kenan TUNÇ
Aralık 2018
T.C.
SAKARYA ÜN VERS TES
FEN B L MLER ENST TÜSÜ
ALL UM SCODOPRASUM SUBSP. ROTUNDUM, ALL UM STAT C FORME VE ALL UM SUBH RSUTUM TÜRLER N N ANT M KROB YAL VE ANT OKS DAN
AKT V TELER N N ARA TIRILMASI
YÜKSEK L SANS TEZ
Alican Bahadır SEMERC
Enstitü Anabilim Dalı : B YOLOJ
TE EKKÜR
Yüksek lisans e itimim boyunca de erli bilgi ve deneyimlerinden yararlandı ım, her konuda bilgi ve deste ini almaktan çekinmedi im, ara tırmanın planlanmasından yazılmasına kadar tüm a amalarında yardımlarını esirgemeyen de erli danı man hocam Dr. Ögr. Üyesi Kenan TUNÇ´a;
Tez çalı mam esnasında hem manevi olarak hem de deneyimleriyle yol gösteren Doç. Dr. Mehmet SA IRO LU’na, Ar . Gör. Dr. Hatice TUNCA’ya, Ar . Gör.
Hatice SIÇRAMAZ’a ve deneysel çalı malarımda yardımcı olan Mikrobiyoloji Ara tırma ekibine çok te ekkür ederim. Lisans dönemimden beri manevi olarak destekleyen ve yanımda olan arkada larım Uzm. Biyolog Merve YILDIRIM’a Biyolog Duygu ARSLAN’a, Biyolog Adnan AKYÜZ’e, Biyolog Selin ARMA AN’a ve Uzm. Türkolog Serap SEV M’e
Hayatım boyunca beni maddi, manevi olarak destekleyen aileme, özellikle dedem merhum Ahmet YAVUZ’a ve Sakarya’da yüksek lisans e itimine ba lamama neden olan, lise döneminden beri yanımda oldu unu bildi im de erli dostum Mert Aziz TEPE ve ailesine, te ekkürlerimi sunarım.
Ayrıca bu çalı manın maddi açıdan desteklenmesine olanak sa layan Sakarya Üniversitesi Bilimsel Ara tırma Projeleri (BAP) Komisyon Ba kanlı ına (Proje No:
BAPK 2017-02-20-006) te ekkür ederim.
Ç NDEK LER
TE EKKÜR……….. i
S MGELER VE KISALTMALAR L STES ……….. v
EK LLER L STES ………...……… vi
TABLOLAR L STES …………...………. viii
ÖZET……….. ix
SUMMARY………. x
BÖLÜM 1. G R ... 1
BÖLÜM 2. KAYNAK ARA TIRMASI ... 4
2.1. Yeryüzünde Ya amın Tarihi ... 4
2.1.1. Prokaryot canlılar ... 5
2.1.2. Ökaryotlar canlılar ... 6
2.2. Çalı mada Kullanılan Test Mikroorganizmaları. ... 6
2.2.1. Staphylococcus aureus’un özellikleri ... 7
2.2.2. Escherichia coli’ nin özellikleri ... 7
2.2.3. Pseudomonas aeruginosa’nın özellikleri ... 8
2.2.4. Bacillus subtilis’ın özellikleri ... 8
2.2.5. Salmonella typhimurium’un özellikleri ... 9
2.2.6.Staphylococcus epidermidis’in özellikleri ... 9
2.2.7. Enterococcus faecalis’in özellikleri ... 10
2.2.8. Candida albicans’ ın özellikleri ... 10
2.3.Çalı mada Kullanılan Bitkiler ... 11
2.3.1. Allium cinsi ... 11
2.3.1.1. Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum…………... 12
2.3.1.2. Allium staticiforme L……… 13
2.3.1.3. Allium subhirsutum L……….. 14
2.3.2. Allium türlerinin kimyasal ve farmasötik özelliklerine yönelik yapılan çalı malar ... 15
BÖLÜM 3 MATERYAL VE YÖNTEM ... 18
3.1. Materyal ... 18
3.1.1. Bitki materyalinin eldesi ... 18
3.1.2. Deneylerde kullanılan mikroorganizmalar ... 19
3.1.3. Kullanılan araç ve gereçler... 19
3.1.4. Kullanılan sarf malzemeler ... 20
3.2.Yöntem ... 21
3.2.1. Bitki ekstraktlarının hazırlanması ... 21
3.2.2. Çözücülerin uzakla tırılması ... 22
3.2.3. Besiyerlerinin hazırlanması ... 22
3.2.4. Kullanılan kimyasalların hazırlanması ... 23
3.2.5. Test mikroorganizmalarının hazırlanması... 23
3.2.6. Antibakteriyel aktivitenin belirlenmesi ... 24
3.2.6.1. Disk difüzyon yöntem………... 24
3.2.6.2. Deneyin yapılı ı……… 26
3.2.7. Toplam fenolik maddenin belirlenmesi... .. 26
3.2.8. Antioksidan aktivite ... 26
BÖLÜM 4. ARA TIRMA BULGULARI ... 27
4.1.Antimikrobiyal aktivite sonuçları ... 27
4.1.1. Allium subhirsutum bitkisinin antimikrobiyal aktivitesi ... 28
4.1.2 Allium staticiforme bitkisinin antimikrobiyal aktivitesi ... 34
4.1.3. Allium scorodoprasum rotundum antimikrobiyal aktivitesi ... 39
4.2. Toplam Fenolik Madde sonuçları ... 42
4.3. Antioksidan Aktivite Sonuçları ... 43
BÖLÜM 5.
TARTI MA VE SONUÇ ... 45
KAYNAKLAR ... 50 ÖZGEÇM ……….. 55
S MGELER VE KISALTMALAR L STES
% : Yüzde
µg : Mikrogram
µL : Mikrolitre
µm : Mikrometre
A. staticiforme : Allium staticiforme A. subhirstum : Allium subhirsutum
ATCC : Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu B. subtilis : Bacillus subtilis
C. albicans : Candida albicans
cm : Santimetre
Dk : Dakika
DPPH : 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin E. coli : Escherichia coli
E. faecalis : Enterococcus faecalis
g : Gram
m : Metre
mg : Miligram
mL : Mililitre
mm : Milimetre
N. Kontrol : Negatif Kontrol Na2CO3 : Sodyum Karbonat
ºC : Derece santigrat
P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa
pH : Bir çözeltinin asitlik ve bazlık derecesi S. aureus : Staphylococcus aureus
S. epidermidis : Staphylococcus epidermidis S. typhimurium : Salmonella typhimurium
EK LLER L STES
ekil 2.1. Ökaryot ve prokaryot hücre tipleri (url-1)………...… 5
ekil 2.2. Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum bitkisinin a) çiçek b) yaprak resimleri……… 12
ekil 2.3. Allium staticiforme çiçek………... 13
ekil 2.4. Allium subhirsutum a) geç çiçek b) erken çiçek resmi………..…… 14
ekil.2.5. Allicinin kimyasal yapısı (Oommen ve ark., 2004)……….. 16
ekil 3.1. Allium örnekleri temizlenmesi... 18
ekil 3.2. Bitki ekstraktının hazırlanı akı ı a) liyofilizatörde kurutma, b) ö ütme, c) ekstraksiyon, d) uçurma i lemleri……….….……… 21
ekil 3.3. Disk difüzyon metodunda, a) mikroorganizma yo unlu unun belirlenmesi, b) hazırlanan mikroorganizma süspansiyonun petriye ekimi, c) ekstrakt emdirilmi disklerin yerle tirilmesi, d)inhibisyon zon çaplarının ölçümü asamaları... 25
ekil 4.1. Allium subhirstum ekstraktlarının a) C. albicans, b) P. aeruginosa, c) S. epidermidis, d) B. subtilis, e) S. aureus, f) C. albicans su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi……….……….. 29
ekil 4.2. Allium subhirsutum bulb ekstraktlarının a) P. aeruginosa, b) E.coli, c) S. typhimurium d) E. faecalis, e) C. albicans, f) S. aureus üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi………. 31
ekil 4.3. Allium subhirsutum ekstraktlarının a) P. aeruginosa, b) S. aureus c) E. faecalis, d) C. albicans, e) E. coli, f) S. epidermidis su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi……….. 33
ekil 4.4. Allium staticiforme ekstraktlarının a) S. typhimurium, b) B. subtilis, c) C. albicans, d) P. aeruginosa, e) E. coli, f) S. typhimurium su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi……… 35
ekil 4.5. Allium staticiforme ekstraktlarının a) P. aeruginosa, b) E. faecalis, c) E.
coli d) S. aureus, e) E. faecalis, f) C. albicans su ları üzerindeki
antimikrobiyal aktivitesi……….….. 37
ekil 4.6. Antibiyotiklerin a) P. aeruginosa, b) E. faecalis, c) E. coli d) S. aureus, e) S. epidermidis, f) C. albicans, g) S. typhimurium h) B. subtilis üzerine etkileri………. 39 ekil 4.7. Allium scorodoprasum subsp. rotundum ekstraktlarının, a) C.albicans,
b) S. aureus, c) S. epidermidis, d) E. coli, e) E. faecalis, f)S.typhimurium su ları üzerindeki antimikrobiyal etkisi…………..……… 41 ekil 4.8. Metanolik eskraktların toplam fenolik içeri i... 43 ekil 4.9. Antioksidan aktive sonuçları……… 44
TABLOLAR L STES
Tablo 2.1. Prokaryot ve ökaryotlar arasındaki farklılıklar (Barker ve ark.,
2013)……….….... 6
Tablo 2.2. Allium L. cinsinin sitematikteki yeri………. 11
Tablo 3.1. Çalı mada kullanılan araç ve gereçler……….. … 20
Tablo 3.2. Kullanılan sarf malzemeler………... 21
Tablo 4.1. Allium subhirsutum çiçek ekstraktlarının mikroorganizmalar üzerine antimikrobiyal etkisi………. 29
Tablo 4.2. Allium subhirsutum bulb ekstraktlarının mikroorganizmalar üzerine antimikrobiyal etkisi………. 31
Tablo 4.3. Allium subhirsutum yaprak ekstraktlarının mikroorganizmalar üzerine antimikrobiyal etkisi………. 33
Tablo 4.4. Allium staticiforme çiçek ekstraktlarının mikroorganizmalar üzerine antimikrobiyal etkisi………. 35
Tablo 4.5. Allium staticiforme so an ekstraktlarının mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi………. 37
Tablo 4.6. Allium staticiforme yaprak ekstraktlarının mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi………. 39
Tablo 4.7. Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum bitkisinin antimikrobiyal etkisi……….. 41
Tablo 4.8. Antioksidan aktivite sonuçları……… 45
ÖZET
Anahtar kelimeler: Allium, antimikrobiyal aktivite, antioksidan aktivite, toplam fenolik madde
Bu çalı mada aseton ve metanol ile hazırlanan Allium scorodoprasum L. subsp.
rotundum, Allium staticiforme ve Allium subhirsutum ekstraktlarının B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, S. epidermidis ATCC 12228, P. aeruginosa ATCC 27853 ve C. albicans ATCC 1029 su larına kar ı disk difüzyon yöntemi kullanılarak antimikrobiyal etkileri ara tırılmı tır. Ayrıca Allium staticiforme ve Allium subhirsutum metanolik ekstraktlarının DPPH yöntemi kullanılarak antioksidan aktiviteleri ve Folin-Ciocalteu reaktifi ile toplam fenolikleri belirlenmi tir.
Allium staticiforme ve Allium subhirsutum ekstraktlarının C. albicans üzerinde yüksek antifungal aktivite gösterdi i belirlenirken, kullanılan bakteriler üzerinde geni spektrumlu antbakteriyel aktiviteye sahip oldu u tespit edilmi tir. Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum ekstraktlarının antimikrobiyal aktivite göstermedi i belirlenmi tir. Allium staticiforme ve Allium subhirsutum ekstraktlarının IC50 de erleri 800-1300 µg/mL arasında oldu u gözlenmi tir.
Türkiye florasındaki Allium staticiforme, Allium subhirsutum bitkilerinin yeni bir antifungal kaynak olarak kullanılabilece i önerilebilir.
INVESTIGATION OF ANTIMICROBIAL EFFECTS OF ALL UM SCODOPRASUM, ALL UM STAT C FORME and ALL UM
SUBH RSUTUM
SUMMARY
Keywords: Allium, antimicrobial activity, antioxdant activity, total phenolic effects
In this study, the antibacterial activity of Allium scorodoprasum L. subsp. Allium staticiforme and Allium subhirsutum extracts (acetone, methanol) againts microbial strains B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S.
typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, S. epidermidis ATCC 12228 P.
aeruginosa ATCC 27853 and C. albicans ATCC 1029 antimicrobial effects were examined by using disc diffusion method. Addition, Allium staticiforme, Allium subhirsutum methanolic extracts were determined the antioxidant activities by using DPPH method and their total phenolics were determined by FCR method.
Extracts of Allium staticiforme and Allium subhirsutum were showed high antifungal activity on C. albicans. It has been determined that it has a broad-spectrum antibacteril activity on the bacteria used. It was determined that extracts of Allium scodoroprsum rotundum did not show antimicrobial activity. The IC50 values of Allium staticforme and Allium subhirsutum were between 800-1300 µg / mL.
Allium subhirsutum and Allium staticiforme in the flora of Turkey can be used as a new antifungals source.
BÖLÜM 1. G R
Bitkiler, insanların temel besin kaynakları ve ilk ilaçlarıdır. lk ça lardan beri insanlar deneme yanılma yoluyla hangi bitkilerin yenilebilece ini, hangilerinin zehirli veya ifa verici oldu unu ö renmi lerdir. Tıbbi bitkilerden basit yöntemler kullanarak bitkinin esas etkili maddesini elde etmeyi ba armı lardır (Baydar 2005).
Dünya Sa lık Örgütü'ne (WHO) göre, özellikle geli mekte olan ülkelerdeki insanların büyük ço unlu u tıbbi ve aromatik bitkilere dayalı geleneksel tıbbı kullanmaktadır. Dünyada geleneksel ve modern tıp sistemlerinde kullanılan 50.000 ila 70.000 bitki türü vardır (Leaman, 2006).
Do al maddelerden, do rudan ya da dolaylı olarak çe itli endüstri grupları faydalanmaktadır ve bunların birço unda do al bitki ürünleri (fitokimyasallar) belirgin bir ekilde görülmektedir. Örne in, fitokimyasallar farmasötik, kozmetik, gıda, zirai ilaç ve kimya endüstrileri tarafından büyük ölçüde kullanılmaktadır (Balandrın ve Klocke, 1988).
Bitkiler sınırsız sayıda aromatik bile ikler üretme yetene ine sahiptirler. Bitkinin büyüme ve geli mesinde temel bir görevi olmayan; ancak adaptasyonda, üreme olayına yardımcı olmada, patojenlere kar ı savunmada ve çevre ile ili kilerde önemli görevleri olan aromatik bile ikler sekonder metabolitler olarak adlandırılmaktadır.
Sekonder metabolitler farklı kimyasal yapılara sahiptirler ve genel olarak üç grupta sınıflandırılırlar: fenolikler, terpen - steroidler ve alkoloidler. Sekonder metabolitlerden imdiye kadar 12.000 tanesi izole edilmi tir ve bu sayı aromatik bile iklerin sadece %10’nu olu turmaktadır (Cowan, 1999; Alverez, 2014; Çölgecen ve Topçu, 2015).
Anti-enfektif ajanların yaygın kullanımı ilaca dirençli bakterilerin, mantarların ve virüslerin ortaya çıkmasına neden olmu tur. Patojenik mikroorganizmaların artan direncini ortadan kaldırmak için çe itli tıbbi bitkiler antimikrobiyal özellikleri açısından dünya çapında ara tırılmı tır. Aromatik ifalı bitkilerden elde edilen uçucu ya ların bakterilere, mayalara, filamentöz mantarlara ve virüslere kar ı son derece iyi antimikrobiyal etkiler sergiledikleri birçok çalı mada bildirilmi tir (Reichling ve ark., 2009; Çolak ve ark., 2018; Nurcahyanti ve ark., 2018).
Ayrıca önemli tıbbi bitki türlerinin köklerinden, kabuklarından, yapraklarından, meyvelerinden ve tohumlarından alınan ekstraktların güçlü antioksidan aktivite gösterdi i belirlenmi tir. Antioksidanlar, hücrelerdeki oksidatif stresi azaltır ve kanser, kardiyovasküler, enflamatuar hastalıklar dahil olmak üzere birçok hastalı ının tedavisinde kullanılır (Gerber ve ark., 2002; Ryszawa ve ark., 2006;
Krishnaiah ve ark., 2011).
Pakistan’da yapılan bir çalı mada taze Euphorbia royleana'nın metanol, hekzan ve sulu ekstrelerinin antioksidan, antimikrobiyal ve antitümör aktiviteleri incelenmi ; incelenen ekstrelerin farmasötik endüstrisi için antioksidan ve antimikrobiyal bile iklerin izolasyon potansiyeline sahip oldu u belirtilmi tir (Ashraf ve ark., 2015).
Akhtar ve ark. (2015) yaptıkları çalı mada 61 tıbbi bitkinin metanol, kloroform ve sulu ekstrelerinin antimikrobiyal, antioksidan ve fitokimyasal içeri ini ara tırmı ; kullanılan bitkilerin ço unlu unun E. aerogens, E. coli, S. aureus, B. bronchiseptica bakterileri üzerinde antibakteriyel etki gösterdi ini saptamı lardır. Punica granatum, Phyllanthus emblica, Mentha piperita, Cicer arietinum bitkilerinin yüksek antioksidan aktivite gösterdi i bildirilmi tir.
Allium türlerinin bakterilere, mantarlara, virüslere ve parazitlere kar ı antimikrobiyal etkiye sahip oldu u birçok çalı mada belirlenmi tir. Ara tırmaların ço unlu u so an (Allium cepa) ve sarımsak (Allium sativum) üzerine yo unla mı tır (Kyung, 2012;
Ye ve ark., 2013).
Çalı mamızda, literatürde daha önce antimikrobiyal ve antioksidan aktivitesi çalı ılmamı olan Allium staticiforme türü ve Allium subhirsutum, Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum türleri kullanılmı tır.
Bu çalı mada aseton ve metanol ile hazırlanan Allium scorodoprasum L. subsp.
rotundum, Allium staticiforme ve Allium subhirsutum ekstraktlarının test mikroorganizmalara kar ı disk difüzyon yöntemi kullanılarak antimikrobiyal etkilerinin ara tırılması ve DPPH yöntemi kullanılarak antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmı tır.
BÖLÜM 2. KAYNAK ARA TIRMASI
2.1. Yeryüzünde Ya amın Tarihi
Ya amın ba langıcı yakla ık 3,5 milyar yıl önce prokaryot canlılarla birlikte ba lamı tır. Prokaryotlar, geçmi teki 3,5-2 milyar yıllık evrimsel süreçte yeryüzünde baskın durumda olan canlılardı (Campbell ve Reece, 2008).
Eski kayaçlarda mikrobiyal ya ama dair kanıt, fosille mi hücre kalıntılarına ve bu kayaçlardaki izotopik hafif karbon çoklu una dayanmaktadır. lkel kayalar basit yapılı çubuk ve kok eklinde bakterilere benzeyen mikrofosiller içerir. 3,5 milyar yıllık ve daha genç kayalarda stromatit olarak adlandırılan olu umlara sık olarak rastlanmaktadır. Stromatitler fosille mi mikrobiyal kalıntılardır (Madigan ve Martinko, 2012).
Fotosentez yaparak oksijen üreten tek prokaryotlar siyanobakterilerdir. Atmosferdeki oksijenin ço u biyolojik kökenli olup fotosentez sırasında suyun parçalanmasıyla olu ur. Siyanobakterilerle birlikte oksijen de günümüzden yakla ık 2,7 milyar yıl önce atmosferde birikmeye ba lamı tır. Prokaryotlara göre daha karma ık ve büyük olan ökaryotların varolu u da 2,1 milyar yıl önceye dayanmaktadır. Daha karma ık hücrelerin olu umu ökaryotik ya amın çe itlenmesine temel olu turmu tur (Campbell ve Reece, 2008).
2.1.1. Prokaryot canlılar
Prokaryot canlılar zarla çevrili gerçek bir çekirde e sahip olmayan, 1-5 µm çapa sahip, genellikle tek hücreli canılardır. Birçok prokaryot canlıda hücrenin metabolik i levlerini yerine getiren özelle mi zarlar bulunmaktadır. Bunlar plazma zarının içeriye do ru kıvrımlar yapması sonucunda olu mu yapılardır. Ökaryotlara oranla daha küçük ve basit genomları vardır. DNA’ları çift zincirli ve halkasal yapıya sahiptir. Prokaryotlarda ana kromozom dı ında birkaç genden olu an, plazmit adı verilen DNA halkaları bulunabilir. Prokaryotik ya am Bacteria ve Archaea olmak üzere iki ayrı domain tarafından temsil edilmektedir. Bilinen prokaryotların ço unlu unu bakteriler olu turmaktadır. Prokaryotların genelinde hücreye ekil veren, fiziksel olarak koruyucu hücre duvarı bulunur. Bakteri hücre duvarında peptidoglikan denilen organik molekül bulunurken Arkelerin hücre duvarında bu molekül bulunmaz. Prokaryotlar ekosistemde kimyasal maddelerin üretimini ve birçok maddenin geri dönü ümünü sa lamaktadır. Bu özellikleri ile biyoteknolojinin merkezinde yer alırlar (Campell ve Reecee, 2008).
ekil 2.1 Ökaryot ve prokaryot hücre tipleri (url-1)
2.1.2. Ökaryot canlılar
Prokaryotlardan farklı olarak membranla çevrili bir nükleusa ve hücrenin tipine ba lı olarak farklılık gösteren zarlı organellere sahip hücrelerdir. Ökaryotlarda nükleusun içinde bulunan DNA histonlar tarafından sarılarak nükleozomları, bunlar da kromozomları olu turur. DNA’ları çift zincirli lineer yapıya sahiptir (Madigan ve Martinko, 2012). Prokaryotlar ile kar ıla tırılması Tablo 2.1.’de verilmi tir.
Tablo 2.1. Prokaryot ve ökaryotlar arasındaki farklılıklar (Barker ve ark., 2013).
PROKARYOTLAR ÖKARYOTLAR
Sitoplazmada DNA serbest halde DNA zarla çevrili Kromozom genellikle haploid, tek ve
halkasal
Kromozom genelikle diploid, birden fazla ve do rusal
DNA histon benzeri proteinlerle kompleks DNA histon proteini ile kompleks
Genetik bilginin aktarılması, konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyonla olur.
Genetik bilginin aktarılması yalnızca e eyli üreme ile olur.
Enerji üretimi hücre zarından sa lanır. Enerji üretimi mitokondri ve kloroplastlardan sa lanır.
Ribozomları küçük 70S Ribozomları 80S
2.2. Çalı mada Kullanılan Test Mikroorganizmaları
2.2.1. Staphylococcus aureus’un özellikleri
Staphylococcus aureus, tüm dünyada toplum ve hastane kaynaklı enfeksiyonlara neden olan önemli patojenlerden biridir. S. aureus’a ba lı enfeksiyonlara kar ı savunmada ilk basamak makrofajlar tarafından gerçekle ir ( Ak ve ark., 2016).
Staphylococcus aureus; bakteriyemi, pnömoni ve cerrahi yara enfeksiyonlarını içeren nozokomiyal enfeksiyonların önde gelen etkenleri arasındadır. Aynı zamanda sa lıklı ki ilerde de kolonizasyona ba lı, endojen olarak enfeksiyonlara neden olabilmektedir. Tedavisinde kullanılan penisilinlere kar ı yüksek düzeyde direnç geli tirmesi sonucu, beta-laktamaz enzimine dayanıklı semisentetik bir penisilin olan metisilin kullanımına ba lanmı , ancak iki yıl sonrasında metisiline dirençli S. aureus (MRSA) izolatı tanımlanmı tır (Bucak ve ark., 2014). Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) su larının tedavisi zordur, mortalite ve morbiditesi yüksek enfeksiyonlara neden olmaktadır (Öztürk ve ark., 2013).
2.2.2. Escherichia coli’ nin özellikleri
Escherichia coli; gram negatif, fakültatif anaerob, hareketli, spor olu turmayan çomak eklinde bir bakteridir. Patojenik E. coli’ler olu turdu u hastalı ın türüne ve sahip oldu u virulens özelliklerine göre sınıflandırılmaktadır. E. coli su ları ba ırsak dı ı enfeksiyonlara (ekstraintestinal) ve ba ırsak enfeksiyonlarına (intestinal) neden olanlar olarak ikiye ayrılmaktadır (Omerovic ve ark., 2017).
E. coli ba ırsak kanalı dı ına çıkıp çe itli vücut dokularına yerle erek idrar yolları, safra kesesi, safra yolları, akci er, periton ula ır ve önemli hastalıklara yol açar. E.
coli hem toplum hem de hastane kökenli bakteremi nedenleri arasında ilk sıralarda yer alır (Bilgehan, 1995; Horasan ve ark., 2010).
2.2.3. Pseudomonas aeruginosa’nın özellikleri
Pseudomonas aeruginosa, ço unlukla toprak ve suda görülen, olumsuz artlarda bile üreyebilen, nemli ortamlarda uzun süre canlı kalabilen, normal florada bulunan bir bakteridir. Gram negatif, hareketli, kapsüllü, oksidaz ve katalaz pozitif, non- fermentatif bir çomaktır. Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında izole edilen Gram negatif çomakların yakla ık be te birini olu turmaktadır (Köse ve ark., 2014).
Hastane kaynaklı enfeksiyonların % 10-15’inden sorumludur. Pseudomonas aeruginosa bakteremi, deri ve yara enfeksiyonları, özellikle kistik fibrozlu hastalar, pulmoner hastalıklar, nozokomiyal üriner sistem enfeksiyonları, endokardit ve menenjit gibi ciddi ve hayatı tehdit eden enfeksiyonların en iyi bilinen etkenlerindendir (Akta ve ark., 2012).
2.2.4. Bacillus subtilis’ın özellikleri
Havada, tozda, bitkilerde ve tuzlu sularda yaygın olarak bulunan ve klinik örneklerde kontaminasyona yol açan bakterilerdir. Gram pozitif endospor olu turma yetene ine sahiptirler.
Bakteriler aslında saprofit olmakla beraber bu bakterilerin do rudan do ruya dokuya ve özellikle göz içerisine girmesi sonucunda panoftalmi, iridosiklit gibi göz yanmalarını meydana getirebilir. Bazı besin zehirlenmelerinden sorumlu oldukları dü ünülmektedir. Ekme in yumu ayarak bozulmasına neden olurlar. Kültür süzüntülerinde subtilin adı verilen bir kısım bakterilere kar ı inhibitör etki gösteren bir madde de elde edilmi tir (Bilgehan, 1995).
2.2.5. Salmonella typhimurium’un özellikleri
Do ada evcil ve yabani hayvanların, sürüngen ku ve böceklerin gastrointestinal sisteminde yaygın olarak bulunur. nsan ve hayvanlarda birçok enfeksiyonlara neden olmaktadırlar. Agar ve buyyon gibi basit içerikli besiyerlerinde 24-48 saatte M veya S tipi koloni olu tururlar. Üreme ısı dereceleri geni tir (10-42 C) optimum üreme ısısı 37 C dir (An ve ark., 2005).
Karasinek ve hamam böcekleri mekanik olarak bakterileri gıda maddelerine ta ır.
Özellikle yazın oda sıcaklı ında bile salmonella bakterileri için iyi bir besiyeri olan süt, et, yumurta, kremalı yiyecek ve içeceklerde bakteriler ço alaca ından bu gıdaları tüketen ki iler için önemli tehlike olu tururlar. S. typhimurium aynı zamanda farelerde ya ayan bir bakteri olması nedeniyle fare dı kısıyla kontamine olmu ürünlerden kolaylıkla insanlara bula abilmektedir. Ayrıca bu bakteri kemoteropotiklere kar ı direnç kazanmakta ve hastanelerde özellikle yeni do an kliniklerinde salgınlara yol açmaktadır (Bilgehan, 1995).
2.2.6. Staphylococcus epidermidis’in özellikleri
Staphylococcus epidermidis, Gram pozitif çekirdeklerin salkım halinde bulundu u stafilokok cinsinden bir bakteri türüdür. Katalaz pozitif ve koagülaz negatif özelliktedir. Zaman zaman insan ve hayvan cildinin mukoz membranlarında görülür.
Fakültetif anaerobturlar ancak oksijenli ortamlarda daha iyi ürerler. Üreme dereceleri 15-45 C arası olup en iyisi 30-37ºC dir. %7,5 NaCl ortamında iyi üremekle birlikte
% 10 NaCl ortamında daha güçlü üreme gösterirler (A açfidan ve ark., 2005).
Kontaminasyona ba lı olarak, S. epidermidis laboratuvar testlerinde en fazla görülen türdür. S. epidermidis genellikle patojen olmasa da immün sistemi yetersiz çalı an ve sürekli kateter takılı olan hastalar için büyük bir risktir. Birço u ince bir salgı olu turur ve bu sayede tıbbi protezlerin yüzeyine de yerle ir (Bilgehan, 1995).
2.2.7. Enterococcus faecalis’in özellikleri
Çevrede, toprak, su ve besinlerde, insan ve hayvanların özellikle vertebraların gastrointestinal sistemlerinde yo un olarak bulunurlar. Kanlı agarda alfa hemoliz yapan fakültatif anaerob bakterilerdir. Yakla ık 1 µm boyutunda oval ekilli koklardır ve sıvı besiyerinde ikili veya kısa zincirler eklinde bulunurlar.
Enterokoklar dı ko ullara oldukça dirençlidirler ve güç ko ullarda bile üreyebilmektedirler (A açfidan ve ark., 2005).
nsan ba ırsa ı, a ız, vajina, üretra ve safra yollarında normal flora elemanı olarak bulunan enterokoklar; dü ük virülansa sahip olmalarına ra men hastane enfeksiyonlarında ve toplum kökenli enfeksiyonlarda giderek artan sıklıkta etken olarak saptanmaya ba lanmı lardır (Aral ve ark., 2011).
2.2.8. Candida albicans’ ın özellikleri
4-6 mikrometre çapında yuvarlaktan ovale kadar de i en ekillerde üreyen bir maya mantarıdır. Hücre duvarında mannan, glukanlar ve kitin olmak üzere üç tip polisakkarit bulunur. Gram pozitif boyanma özelli i gösterip genellikle tomurcuklanarak ço alırlar.
Yüzeysel, mukokütananöz veya sistematik bir hastalık eklinde ortaya çıkabilen Candidiasis oldukça sık görülen bir insan enfeksiyonudur. Genellikle metabolik veya immünolojik bir bozukluk sırasında ortaya çıkar. Hastalık etkeni olarak en sık Candida albicans türü görülür (Kingsbury ve Wagner, 1990).
2.3.Çalı mada Kullanılan Bitkiler
2.3.1. Allium cinsi
Dünyada 800’den fazla tür içeren ve ço unlu u Kuzey Yarım Küre’de yayılı gösteren bir cinsdir (Frıesen, 2008). Allium cinsi, Türkiye Florası içerisinde Liliaceae familyasında yer almaktadır (Davis, 1984). Son yıllarda yapılan çalı malarda, Allium cinsi Alliaceae ya da çiçek durumunun umbella ve tabanında spatası olması nedeniyle sınırları geni letilmi olan Amaryllidaceae familyası altında kabul edilmi tir (Tablo 2.2.). Türkiye’de Allium’un 180 türü olup bunlardan 72 tanesi endemiktir (Choi ve Oh, 2011; Ek i, 2012; Kaya, 2014).
Tablo 2.2. Allium L. cinsinin sitematikteki yeri
Alem Plantae
Alt alem Tracheobionta
ube: Magnoliophyta
Sınıf: Liliopsida
Alt sınıf: Liliidae
Ordo: Asparagales
Familya: Amaryllidaceae
Cins: Allium L.
Allium cinsi; çok yıllık, so anlı, bazen rizomlu, skapus ta ıyan otsu bitkilerdir.
Bulblar kabuklu veya rizoma ba lı bir kluster içindedir. Çiçekler tepede bir umbella durumunda, açmadan önce bir brakte (spata) içindedir. Periant, 6 parçalı meyveler zarımsı bir kapsuladır. Tohumlar siyah, basık, üç kö eli, nadiren yuvarlaktır.
çerdikleri kükürtlü, uçucu bile iklerden ileri gelen so an ve sarımsak kokuları en karakteristik özellikleridir (Davis, 1984; Seçmen ve ark., 1998).
2.3.1.1. Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum
Anadolu’da körmen, it so anı olarak bilinmekte olup otlu peynir yapımında kullanılmakta ve gıda olarak tüketilmektedir (Ko ar ve ark., 2006). Bulbları küresel ve oval biçiminde 1-2 cm çapındadır. Dı tunikler kahverengi, gövde 25-90 cm uzunlu undadır. Periantlar koyu mor rengindedir. Türkiye’de geni yayılı göstermektedir.
ekil 2.2. Allium scorodoprasum subsp. rotundum bitkisinin a) çiçek, b) yaprak resimleri
2.3.1.2. Allium staticiforme L.
Bulbları 0,8-1,5 cm çapındadır. Dı tunikler siyah, gövde 16-30 cm uzunlu unda, ço unlukla alt kısımda kavislidir. 2-4 yıllık ya am dönemine sahiptir. Sahilde kumlu yerlerde, terk edilmi tarlalarda yeti ir. Türkiye ve Avrupa’da yayılım gösterir.
Balıkesir-Biga, Manisa-Bergama, Aydın-Didim bölgelerinde kaydı yapılmı tır (Davis 1984; Güner ve ark., 2012). Allium staticiforme L. üzerine literatürde yapılmı biyoaktivite çalı masına rastlanılmamı tır.
ekil 2.3. Allium staticiforme
2.3.1.3. Allium subhirsutum L.
Bulbu 1,5 cm çapa kadar ula abilir. 2-3 yıl ya am süresine sahiptir. Gövde 7-30 cm uzunlu undadır. zmir-Çe me, Samsun-Güzelçamlı, Aydın-Ku adası, Antalya-Ka ve Finike’de kayda geçmi tir (Davis,1984). Anadolu’da körmen olarak bilinmekte ve gıda olarak kullanılmaktadır (Ko ar ve ark., 2006).
ekil 2.4. Allium subhirsutum a) geç çiçek, b) erken çiçek resmi
2.3.2. Allium türlerinin kimyasal ve farmasötik özelliklerine yönelik yapılan çalı malar
Romanya’da Allium türlerinin kimyasal bile enleri üzerine yapılan bir ara tırmada incelenen türlerin fisetin, quercetin, ısoquercetin, luteolin, apigenin, kafeik asit, sinapikasit ve ferulik asit gibi birçok birle ik içerdi i belirlenmi tir (Vlase ve ark., 2013).
Tsiaganis ve ark. (2006) yapmı oldukları çalı mada Allium cepa, Allium sativum ve Allium porrum türlerinin GC-MS yöntemiyle ya içeriklerini ara tırmı lardır. Her üç bitki türünde toplam ya asidi oranının %50’sinin Linoleik asit, %20’sinin Palmitik asit, %3-7’sinin -oleik asit ve oleik asit oldu unu bildirmi lerdir. Allium sativum bitkisinin uçucu ya larının GC-MS yöntemiyle incelendi i ba ka bir çalı mada, bitkinin allil sülfit, cis-propenil metil disülfit, metil allil disülfit, trans-propenil metil disülfit, metil trisülfit, dialil sülfit, allil disülfit, metil allil trisülfit ve izobütil izotiosiyanat içerdi i belirlenmi tir (Kozan, 2012).
Allium sativum, Allium cepa, Allium porrum, Allium tuberosum türlerinin HPLC yöntemi ile uçucu ya larının içeri inin ara tırıldı ı bir çalı mada Allium sativum ve Allium tuberosum uçucu ya larının temel bile enin dialil disülfid oldu u, Allium cepa ve Allium porrum türlerinde ise temel bile enlerin dipropil disülfid ve dipropil trisülfid oldu u belirlenmi tir (Mnayer ve ark. 2014).
Allium sativum (sarımsak) kükürtlü bile ik içeri i en çok ara tırılmı Allium türüdür.
çeri inde bulunan allicin (dialil tüyosülfinat) tiyosülfinat bir bile ik olup do ada bitki dokusunun hasar görmesi sonucunda üretilir. Allinaz enzimi ile membran bütünlü ü bozulan bulbtaki allicin alliin amino asidinden sentezlenmektedir (Borlinghaus ve ark., 2014).
ekil.2.5. Allicinin kimyasal yapısı (Oommen ve ark 2004).
Allium cinsi hem besin maddesi hem de ilaç hammaddesi olarak kullanılan en önemli bitki gruplarındandır. çerdikleri çok sayıda fitokimyasal bile ik sayesinde birçok biyoaktivite çalı malarında kullanılmı lardır (Yünlü ve Kır, 2016).
Allium türleri allisin dialil sülfür, dialilsülfat, s- alilsistein, dipropil disülfür gibi birçok kükürtlü bile ik içermektedir. çerdikleri bu kükürtlü bile ikler sayesinde yüksek oranda antioksidan, antikansorojen, antiinflamatuar, antiklazınojenik etki göstermektedirler (Guyonnet ve ark., 1998; Hirschve ark., 2000; Sun ve Wang, 2003;
Lanzotti ve ark., 2014). Ayrıca Allium türlerinden elde edilen saponinlerde, antispazmodik, antifungal, hemolitik, antiinflamatuar, kolesterol dü ürücü ve sitotoksik aktivite gibi birçok biyolojik özelli e sahiptir (Lanzotti ve ark., 2014).
Barilla ve ark. (2007) yapmı oldukları çalı mada Allium minutiflorum’dan izole edilen saponinlerinin antifungal aktivite gösterdi ini bildirmi lerdir. Allium ursinum, Allium ampeloprasum, Allium cepa, Allium leuconthum, Allium ampeloprasum subsp. persicum gibi türlerinin antifungal aktive gösterdi i belirlenmi tir (Sobolewska ve ark., 2003; Sadeghi ve ark., 2013).
Sarımsa ın antimikrobiyal etkisinin, içerdi i kükürtlü grupların mikroorganizma hücre proteinlerinde bulunan –Sh gruplarıyla olu turdukları spesifik ba lardan kaynakladı ı bildirilmi tir (Kyung, 2011).
Yapılan bir çalı mada Allium sativum ekstraktlarının çe itli antimikrobiyallerle sinerjik hareket ederek V. cholera’da çoklu ilaç pompası olan EmrD-3’ün enziminin çalı masını inhibe etti i belirlenmi tir (Bruns ve ark., 2017).
Et ürünleri ambalajında kullanılmak üzere polipropilen filmlere kekik esansiyel ya ı ve Allium ekstresi eklenen bir çalı mada Allium ekstresi eklenen polipropilen filmin yüksek oranda antimikrobiyal aktivite gösterdi i ve gıda kalitesini artırdı ı belirlenmi tir (Cabella ve ark., 2018).
BÖLÜM 3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Bitki materyalinin eldesi
Çalı mamızda Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum, Allium staticiforme ve Allium subhirsutum bitkilerinin bulb, yaprak ve çiçek kısımları Yalova´daki Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Ara tırma Enstitüsü´nden alınmı tır. Sakarya Üniversitesi Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji Ara tırma Laboratuvarı’na getirilen örnekler temizlenerek kurutulmu tur.
ekil 3.1 Allium örnekleri temizlenmesi
3.1.2. Deneylerde kullanılan mikroorganizmalar
Sakarya Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji Ara tırma Laboratuvarı koleksiyonunda bulunan B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, S. epidermidis ATCC 12228, P. aeruginosa ATCC 27853 ve C.
albicans ATCC 1029 su ları kullanılmı tır.
3.1.3. Kullanılan araç ve gereçler
Deneyler sırasında kullanılan araç ve gereçler Sakarya Üniversitesi Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji Ara tırma Laboratuvarı ve Sakarya Üniversitesi Gıda Mühendisli i Ara tırma Laboratuvarı’ndan temin edilmi tir. Bu araç ve gereçler Tablo 3.1.’de verilmi tir.
Tablo 3.1. Çalı mada kullanılan araç ve gereçler
nkübatör (Friocell MMM) Dijital Kumpas (Stainless Hardened) Mikropipet 5-50 l (ISOLAB) Mikropipet Ucu
Otoklav (Alp Cl-32l) Baget
Elektronik Hassas Tartı Manyetik Karı tırıcı (IKA RCT Classic) Petri Kabı Ve Ta ıyıcısı Öze
Liyofilizatör Pipet
Uv Spektrometre Cam Balon
Densitometre (Biosan Den-1) Cam Tüp
Rotary Evaporatör Beher
Pens Ö ütücü (Premier PRG 259)
Folyo Mikropipet 100-1000 l
Erlenmayer Filtre Ka ıdı
3.1.4. Kullanılan sarf malzemeler
Deney süresince kullanılan sarf malzemeler Sakarya Üniversitesi Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji Ara tırma Laboratuvarı’ndan temin edilmi tir. Bu sarf malzeler Tablo 3.2.’de verilmi tir.
Tablo 3.2. Kullanılan sarf malzemeler
Metanol(MERCK) Patates Dekstraz Agar
Etanol(MERCK) Mueller Hinton Agar (MERCK)
Aseton(MERCK) Koyun Kanlı Agar
DPPH(MERCK) Distile su
Steril plastik petri Gentamisin Antibiyotik Diskler (MERCK) Basitrasin Triptik Soy Broth (MERCK) Eküvyon Çubuk
Parafilm Flukonozol
Numune kabı Streç film
Tartım kabı Otoklav po eti
3.1. Yöntem
3.2.1. Bitki ekstraktlarının hazırlanması
Toplanan bitki örnekleri 48 saat boyunca liyofilizatörde kurutulmu tur. Kurutulan örnekler vakumlanarak çalı ılaca ı zamana kadar -10ºC’de derin dondurucuda saklanmı tır. Bitki örnekleri toz haline getirildikten sonra 10 g tartılarak kartujlara konulmu tur. Kartu lar soxhlet cihazına yerle tirilerek 12 saat boyunca metanol ve aseton çözücülerinde ekstrakte edilmi tir.
ekil 3.2. Bitki ekstraktının hazırlanması, a) liyofilizatörde kurutma, b) ö ütme, c) ekstraksiyon, d) uçurma, i lemleri.
3.2.2. Çözücülerin uzakla tırılması
Whatman ka ıdı yardımıyla cam balonlara süzülen bitki ekstraktlarının 40- 45º C’de rotary evaporatörde çözücüleri uzakla tırılmı tır. lem öncesinde ve sonrasında kullanılan balonların tartımları yapılmı tır. Ekstrakt miktarları belirlenenen numunelerden 6400 µg/mL konsantrasyonda antimikrobiyal aktivite deneyleri için ve 5000 µg/mL konsantrasyonda antioksidan aktivite deneyleri için stoklar hazırlanmı tır.
3.2.3. Besiyerlerinin hazırlanması
Besiyeri olarak Triptik Soy Broth, Mueller Hinton Agar, Koyun Kanlı Agar ve Patates Dekstroz Agar kullanılmı tır. Laboratuvar ortamında aseptik artlar altında dehidre Triptik Soy Broth, Mueller Hinton Agar ve Patates Dekstroz Agar hazırlanmı tır. Kanlı Agar besiyeri ise hazır olarak kullanılmı tır. Triptik Soy Broth besiyerini hazırlamak için 30 g toz besiyeri üzerine distile su ilave edilerek 1000 mL’ye tamamlanmı tır. Vida kapaklı kısa deney tüplerinin her birine 5 mL aktarılarak 121ºC’de, 1 atm. basınç altında 15 dakika boyunca steril edilmi tir.
Mueller Hinton Agar besiyeri hazırlamak için 34 g toz besiyeri üzerine distile su ilave edilerek 1000 mL’ye tamamlanmı tır. Erlen mayerde besiyeri çözeltisi iyice karı tırıldıktan sonra alüminyum folyo ile kapatılmı tır. Besiyerleri 121ºC’de, 1 atm.
basınç altında 15 dakika steril edilmi tir. Otoklavdan çıkarılan besiyerleri 50 ºC’ye kadar so utulduktan sonra biyogüvenlik kabinde steril petri kaplarına 4 mm kalınlı ında dökülerek katıla ması beklendi.
Patates Dekstroz Agar besiyerini hazırlamak için 39 g toz besiyeri üzerine distile su ilave edilerek 1000 mL’ye tamamlanmı tır. Erlen mayerde besiyeri çözeltisi iyice karı tırıldıktan sonra alüminyum folyo ile a ızları sıkıca kapatılmı tır. Besiyeri 121ºC’de, 1 atm. basınç altında 15 dakika steril edilmi tir. Otoklavdan çıkarılan besiyerleri 50 ºC’ye kadar so utuldukyan sonra biyogüvenlik kabininde steril petri
kaplarına 4 mm kalınlı ında dökülerek katıla ması beklendi. Hazırlanan tüm besiyerleri kullanılana kadar +4ºC´de buzdolabında saklanmı tır.
3.2.4. Kullanılan kimyasalların hazırlanması
%0,004’lük DPPH çözeltisi: 20 mg 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl reaktifi 500 mL metanol ile çözülerek elde edilmi tir.
1 mg/mL Askorbik asit: 20 mL metanol içerisinde 20 mg Askorbik asit eklenerek hazırlanmı tır.
%50’lik Folin-Ciocalteu reaktifi: 1000 mL distile su ile 1000 mL Folin-Ciocalteu reaktifi karı tırılarak hazırlanmı tır.
3.2.5. Test Mikroorganizmalarının hazırlanması
Çalı mada kullanılacak olan bakteri su ları Triptik Soy Broth besiyerine, mantar su u ise Patates Dekstroz Broth besiyerine aktarılmı ve 37ºC´de 24 saat inkübe edilerek aktifle tirilmi tir. Aktifle tirilen bakteriler Koyun Kanlı Agara mantarlar ise Patates Dekstroz Agara azaltma yöntemi ile ekilerek 37ºC´de 24 saat boyunca inkübe edilmi tir. Elde edilen taze kültürlerden alınan mikroorganizmalar 9 mL´lik Triptik Soy Broth besiyeri içeren tüplere inokule edilerek 0,5 McFarland (108 CFU/mL) mikroorganizma yo unlu u ayarlanmı tır.
3.2.6. Antimikrobiyal aktivitenin belirlenmesi
3.2.6.1. Disk difüzyon yöntemi
Antimikrobik aktivitenin ölçümü için en yaygın kullanılan yöntem disk difüzyon testidir. Kirby – Bauer disk difüzyon yöntemi antibiyotiklere duyarlı ın saptanması amacıyla uygulanan klasik bir kalitatif yöntemdir. Bu yöntemde farklı antimikrobiyal maddelerin bilinen miktarını içeren diskler, 0,5 McFarland yo unlu undaki mikroorganizma süspansiyonu inoküle edilmi Müeller Hinton Agar yüzeyine yerle tirilir. Mikroorganizmanın üremesi (maddeye direnç) veya ürememesi (maddeye duyarlı) gözlenir. nkübasyon sonrasında disk etrafındaki inhibisyon zon çapı ölçülerek maddenin bakteriye etkisi belirlenir (Strohl ve ark., 2006).
3.2.6.2. Deneyin yapılı ı
Çalı mada hazırlanan bitki ekstraktlarına belirli oranlarda metanol ve aseton çözücüleri eklenerek istenilen konsantrasyonlar (6400 µg/mL, 3200 µg/mL, 1600 µg/mL, 800 µg/mL) hazırlanmı tır. Hazırlanan ekstraktlardan her bir diske 10 µL emdirilerek 24 saat oda sıcaklı ında steril biyogüvenlik kabinde kurumaya bırakılmı tır. 0,5 McFarland yo unlu unda hazırlanan mikroorganizma süspansiyonundan Mueller Hinton Agar katı besiyerlerine steril eküvyon yardımıyla aseptik artlarda ekim yapılmı tır. Hazırlanan diskler mikroorganizma ekilmi Mueller Hilton Agar besiyerlerine yerle tirilerek 37ºC´de 24 saat inkübe edilmi tir.
Negatif kontrol olarak her ekstraktın hazırlandı ı çözücü disklere emdirilmi tir.
Pozitif kontrol olarak Gentamisin ve Amfoterisin B yüklü diskler kullanılmı tır. Her su ve ekstrakt için bu çalı ma üç paralel olarak tekrarlanmı tır.
3.2.6.3. Zon çaplarının ölçülmesi
37ºC´de 24 saat inkübasyon sonunda bitki ekstraktlarının mikroorganizmalara kar ı antibakteriyel aktivitesinin olup olmadı ının belirlenmesi için disk etrafındaki inhibisyon zon çapları (mm) dijital kumpas ile ölçülmü tür. nhibisyon zon çaplarına bakılarak bitki ekstraktlarının çalı mada kullanılan mikroorganizmalar üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi belirlenmi tir.
ekil 3.3. Disk difüzyon metodunda, a) mikroorganizma yo unlu unun belirlenmesi, b) hazırlanan mikroorganizma süspansiyonun petriye ekimi, c) ekstrakt emdirilmi disklerin yerle tirilmesi, d) inhibisyon zon çaplarının ölçümü asamaları
3.2.7. Toplam fenolik maddenin belirlenmesi
Toplam fenolik madde tayini Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılarak belirlenmi tir.
Singleton ve Rossi (1965) Folin-Ciocalteu yöntemi modifiye edilerek çalı ılmı tır.
Hazırlanan ekstrakttan 100 µL alınarak, 200 µL %50’lik Folin-Ciocalteu reaktifi ilave edilmi ve 2 dakika bekletilmi tir. Üzerine 1 mL %2’lik Na2CO3 çözeltisi eklenerek 1 saat karanlıkta bekletilmi ve 760 nm’de absorbansları okunmu tur.
Örne in toplam fenolik madde içeri i gallik asit standartı kullanılarak mg/ 100g cinsinden hesaplanmı tır.
3.2.8.Antioksidan aktivite
1,1-difenil-2-pikrilhidrazin (DPPH) radikal süpürme testi ilk olarak 1958'de Blois tarafından tarif edilmi ve daha sonra çok sayıda ara tırmacı tarafından modifiye edilerek uygulanmı tır. Bitki örnekleri için en yaygın kullanılan antioksidan analizlerinden biridir (Krishnaiah ve ark., 2011). Farklı konsantrasyonda hazırlanan ekstraktlardan (250-1750 µg/mL) ve standart çözeltilerden 1 mL alınarak, üzerine 1 mL %0,04’lük DPPH çözeltisi ilave edilmi itir. Vortekslendikten sonra oda ko ullarında karanlıkta 30 dk bekletilmi ve 517 nm’de absorbansları okunmu tur.
Kontrol, 1 mL metanol çözücüsüne 1 mL DPHH eklenerek hazırlanmı tır. Standart olarak Askorbik asit konsantrasyonları kullanılmı tır. Örne in antioksidan aktivitesi a a ıdaki e itlik kullanılarak (Denklem 3.1) hesaplanmı tır. %50 inhibisyonu sa layan konsantrasyon de eri (IC50) ekstre konsantrasyonuna kar ılık gelen inhibisyon de eri grafi inden hesaplanarak bulunmu tur.
% DPPH giderme aktivitesi = x 100 (3.1)
.
BÖLÜM 4. ARA TIRMA BULGULARI
4.1. Antimikrobiyal aktivite sonuçları
Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum, Allium staticiforme ve Allium subhirsutum kısımlarından (bulb, yaprak ve çiçek) elde edilen ekstraktların B.
subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S.
typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, S. epidermidis ATCC 12228, P.
aeruginosa ATCC 27853 ve C. albicans ATCC 1029 mikroorganizma su larına kar ı disk difüzyon yöntemi kullanılarak antimikrobiyal aktivitesi belirlenmi tir.
Hazırlanan ekstraktlar içerisinde en yüksek antimikrobiyal aktivitenin Allium staticiforme bulb aseton ekstraktında oldu u gözlemlenmi tir. Allium staticiforme ve Allium subhirsutum ekstraktlarının Candida albicans üzerinde güçlü antifungal aktivite gösteridi i saptanmı tır. Allium scorodoprasum L. subsp. rotundum ile hazırlanan ekstraktlarının kullanılan test mikroorganizmaları üzerinde herhangi bir antimikrobiyal aktivite göstermedi i gözlenmi tir.
Bitki kısımları arasındaki antimikrobiyal etkiye bakıldı ında en yüksek aktivitenin bulblardan elde edilen ekstraktlarda oldu u görülmü tür. Çiçeklerden elde edilen ekstraktların daha çok Candida albicans üzerinde etkili oldu u belirlenmi tir.
Allium subhirsutum ile hazırlanan ekstraktların B. subtilis bakterisi dı ında geni spektrumlu antimirobiyal aktivite gösterdi i tespit edilmi tir. Alllium staticiforme bulblarının aseton ile hazırlanan ekstraktın tüm test mikroorganizmaları üzerinde antimikrobiyal aktivite gösterdi i belirlenmi tir
4.1.1. Allium subhirsutum bitkisinin antimikrobiyal aktivitesi
Allium subhirsutum bulb, yaprak ve çiçek kısımlarından hazırlanan aseton, metanol ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi incelenmi tir.
Tablo 4.1. Allium subhirsutum çiçek ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi
N.K: Negatif kontrol, GC: Gentamisin, AMB: Amfoterisin B, ‘-‘: çalı ılmadı.
Tablo 4.1.’de elde edilen ekstraktların C. albicans üzerinde güçlü antifungal aktivite gösterdi i belirlenmi tir. Ekstraktların kullanılan bakteriler üzerinde antibakteriyel etkisinin olmadı ı saptanmı tır. Metanol ile hazırlanan ekstraktın daha yüksek antifungal aktivite gösterdi i gözlenmi tir.
Test Su ları Metanol Ekstrakt(µg/mL) Aseton Ekstrakt(µg/mL)
6400 3200 1600 800 6400 3200 1600 800 N.K
B. subtilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17
C. albicans 20,5 18,5 20 0 12,8 0 0 0 0 -
E. coli 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19
E. faecalis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20
P.aeruginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22
S. aureus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20
S. epidermdis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21
S.typhimurium
0 0 0 0 0 0 0 0 0 21
ekil 4.1. Allium subhirstum ekstraktlarının a) C. albicans, b) P. aeruginosa, c) S. epidermidis, d) B. subtilis, e) S.
aureus, f) C. albicans su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi
Tablo 4.2 Allium subhirsutum bulb ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi
N.K: Negatif kontrol, GC: Gentamisin, AMB: Amfoterisin B, ‘-‘: çalı ılmadı
Tablo 4.2.’de en yüksek antimikrobiyal aktivite metanol ile hazırlanan ekstrakta, C.
albicans su u üzerinde görülmü tür. Metanol ile hazırlanan ekstraktların test mikroorganizmaları üzerinde daha yüksek oranda antimikrobiyal etki gösterdi i belirlenmi tir. Tüm konsantrasyonların B. subtilis bakteri üzerinde antimikrobiyal etki göstermedi i saptanmı tır.
nhibisyon Zon Çapı
Test Su ları Metanol Ekstrakt(µg/mL) Aseton Ekstrakt(µg/mL) Antibiyotik
6400 3200 1600 800 6400 3200 1600 800 N.K GC AMB
B. subtilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 -
C. albicans 13,8 10,7 7,2 0 8,6 6 0 0 0 - 16
E. coli 8,2 6 0 0 7 0 0 0 0 19 -
E. faecalis 8,2 6,2 0 0 8,7 6 0 0 0 20 -
P.aeruginosa 9,7 7,8 0 0 6,8 0 0 0 0 22 -
S. aureus 8,3 0 0 0 9,3 6,6 0 0 0 20 -
S. epidermdis 13,1 10,2 6,7 0 8,5 6 0 0 0 21 -
S. typhimurium 9,9 7,6 0 0 7,8 0 0 0 0 21 -
ekil 4.2. Allium subhirsutum bulb ekstraktlarının a) P. aeruginosa, b) E. coli, c) S. typhimurium, d) E. faecalis, e) C. albicans, f) S. aureus üzerinde antimikrobiyal aktivitesi
Tablo 4.3. Allium subhirsutum yaprak ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi
nhibisyon Zon Çapı
Test Su ları Metanol Ekstrakt(µg/mL) Aseton Ekstrakt(µg/mL) Antibiyotik
6400 3200 1600 800 6400 3200 1600 800 N.K GC AMB
B. subtilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 -
C. albicans 8,6 6,6 0 0 0 0 0 0 0 - 16
E. coli 6,5 0 0 0 0 0 0 0 0 19 -
E. faecalis 8,7 7 0 0 0 0 0 0 0 20 -
P.aeruginosa 8,3 0 0 0 0 0 0 0 0 22 -
S. aureus 6,5 0 0 0 0 0 0 0 0 20 -
S. epidermdis 9,2 7,8 0 0 0 0 0 0 0 21 -
S. typhimurium 9,3 7,5 0 0 0 0 0 0 0 21 -
N.K: Negatif kontrol, GC: Gentamisin, AMB: Amfoterisin B, ‘-‘: çalı ılmadı
Tablo 4.3.’de metanol ile hazırlanan 6400 µg/mL konsantrasyondaki ekstraktın dü ük düzeyde antimikrobiyal etki gösterdi i saptanmı tır. Aseton ile hazırlanan ekstraktın kullanılan test mikroorganizmaları üzerinde antimikrobiyal aktivite göstermedi i belirlenmi tir.
ekil 4.3. Allium subhirsutum ekstraktlarının a) P. aeruginosa, b) S. aureus, c) E. faecalis, d) C. albicans, e) E.
coli, f) S. epidermidis su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi.
4.1.2 Allium staticiforme bitkisinin antimikrobiyal aktivitesi
Allium staticiforme so an, yaprak ve çiçek kısımlarından hazırlanan aseton, metanol ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi incelenmi tir.
Tablo 4.4. Allium staticiforme çiçek ekstraktların test mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi
N.K: Negatif kontrol, GC: Gentamisin, AMB: Amfoterisin B, ‘-‘: çalı ılmadı
Tablo 4.4.’de hazırlanan ekstraktların C. albicans üzerinde yüksek oranda antifungal aktivite gösterdi i belirlenmi tir. Aseton 6400 µg/mL konsantrasyonda hazırlanan ekstraktın B. subtilis üzerine 12,1 mm, E. coli üzerine 12 mm, S. typhimurium üzerine 10,8 mm, S. epidermidis üzerine 10,2 mm ve C. albicans üzerine 27 mm inhibisyon zon çapı olu turdu u saptanmı tır. Ekstraktların S. aureus bakterisi üzerinde antimikrobiyal etki göstermedi i gözlenmi tir.
nhibisyon Zon Çapı
Test Su ları Metanol Ekstrakt(µg/mL) Aseton Ekstrakt(µg/mL) Antibiyotik
6400 3200 1600 800 6400 3200 1600 800 N.K GC AMB
B. subtilis 9,3 0 0 0 12,1 0 0 0 0 17 -
C. albicans 24,1 13,4 10,3 0 27 19 13,2 0 0 - 16
E. coli 12,4 0 0 0 12 9,6 7,2 0 0 19 -
E. faecalis 10,1 0 0 0 10 0 0 0 0 20 -
P.aeruginosa 7,4 0 0 0 8 0 0 0 0 22 -
S. aureus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 -
S. epidermdis 11,5 9 0 0 10,2 0 0 0 0 21 -
S. typhimurium 7,5 0 0 0 10,8 9 0 0 0 21 -
ekil 4.4. Allium staticiforme ekstraktlarının a) S. typhimurium, b) B. subtilis, c) C. albicans, d) P. aeruginosa, e) E. coli, f) S. typhimurium su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi
Tablo 4.5. Allium staticiforme bulb ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi
nhibisyon Zon Çapı
Test Su ları Metanol Ekstrakt(µg/mL) Aseton Ekstrakt(µg/mL) Antibiyotik
6400 3200 1600 800 6400 3200 1600 800 N.K GC AMB
B. subtilis 8,2 0 0 0 - 10,2 6 0 0 17 -
C. albicans 28,2 21 7 0 - 36 30 16 0 - 16
E. coli 0 0 0 0 - 21 15,8 8 0 19 -
E. faecalis 8,5 0 0 0 - 10 8,2 6 0 20 -
P.aeruginosa 8,8 7 0 0 - 11 8,2 6 0 22 -
S. aureus 0 0 0 0 - 8 6 0 0 20 -
S. epidermdis 8,2 0 0 0 - 8,8 6 0 0 21 -
S. typhimurium 9,7 6,5 0 0 - 12,5 8 0 0 21 -
N.K: Negatif kontrol, GC: Gentamisin, AMB: Amfoterisin B, ‘-‘: çalı ılmadı
Tablo 4.5.’de hazırlanan ekstraktların test mikroorganizmaları üzerinde geni spektrumda antimikrobiyal aktivite gösterdi i belirlenmi tir. Aseton 3200 µg/mL konsantrasyonda hazırlanan ekstraktın C. albicans üzerinde 36 mm, E. coli üzerinde 21 mm inhibisyon zon çapı olu turdu u tespit edilmi tir. Metanol ekstraktının E. coli ve S. aureus bakterileri üzerinde etkisi yokken aseton ekstraktının antibakteriyel etkisi oldu u gözlenmi tir.
ekil 4.5 Allium staticiforme ekstraktlarının a) P. aeruginosa, b) E. faecalis, c) E. coli, d) S. aureus, e) E. faecalis, f) C. albicans su ları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi
Tablo 4.6. Allium staticiforme yaprak ekstraktlarının test mikroorganizmaları üzerine antimikrobiyal etkisi
nhibisyon Zon Çapı
Test Su ları Metanol Ekstrakt(µg/mL) Aseton Ekstrakt(µg/mL) Antibiyotik
6400 3200 1600 800 6400 3200 1600 800 N.K GC AMB
B. subtilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 -
C. albicans 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - 16
E. coli 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 -
E. faecalis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 -
P.aeruginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22 -
S. aureus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 -
S. epidermdis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21 -
S. typhimurium 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21 -
N.K: Negatif kontrol, GC: Gentamisin, AMB: Amfoterisin B, ‘-‘: çalı ılmadı
Tablo 4.6.’da kullanılan ekstraktların test mikroorganizmaları üzerinde antimikrobiyal etkisinin olmadı ı belirlenmi tir.
ekil 4.6. Antibiyotiklerin a) B. subtilis, b) C. albicans, c) E. coli, d) S. aureus, e) P. aeruginosa, f) S. typhimurium, g) E. faecalis, h) S. epidermidis üzerindeki etkisi
