開發增強醣類免疫抗原性之載體
Notch 是個演化上具高度保留,穿過細胞膜一次的受體蛋白,在哺乳類的 Notch 受體蛋白有 Notch1 4∼ 四種,被認 為可調控基因的轉錄、細胞的增生、分化及早期細胞命運的決定,而 Notch 訊息傳遞的異常或突變會造成某些疾病 的發生。當相鄰細胞表現的 ligand 與 Notch 受體蛋白的細胞外區域結合時, Notch 訊號傳遞系統就被活化,整個細 胞內區域在靠近內膜處被蛋白分解脢切斷,而形成活化型 Notch (Notch IC, 細胞內區域 ) 。此活化型 Notch 會轉移至 細胞核中,並且和一些可與 DNA 結合的轉錄因子,如: RBP-Jκ/CBF1 ,以及其他細胞因子結合,進一步調控標的 基因的表現。所以這些參與的因子,對於 Notch 訊息傳遞路徑影響甚巨。因此,為了進一步探討 Notch 訊息傳遞路 徑,本論文首要目標著重於探索參與 Notch1 下游訊息傳遞路徑仍未知的結合因子,及初步分析這種結合所產生的 生物功能。
本實驗參考葉添順老師與本實驗室先前利用 GST-N1IC-ANK repeats 之融合蛋白,與 K562 細胞萃取液混合,進行 G ST pull down Assay 來分析該細胞中有何蛋白質可與 GST-N1IC-ANK 融合蛋白做結合,並收集與融合蛋白結合的複 合體,用 2-D 電泳及質譜儀分析此複合體的成員為何。在分析蛋白質體的數據中發現有數個候選蛋白質包括鋅手指 蛋白的存在。分析比對之結果發現 ZNF74 的吻合度最高。 ZNF74 屬於 C2H2 type 的鋅手指蛋白。在其 N 端部份包 含了一段稱為 Krueppel-associated box (KRAB) 的區域,在 C 端部份包含 12 個 zinc finger motifs 。具有 KRAB 區域 的蛋白主要功能到目前為止所知均具有抑制基因表現之功能,而 zinc finger 區域則是與特定的 DNA 序列做結合。因 此本實驗有興趣繼續探討 ZNF74 與 Notch 1 之訊號傳遞是否有關。在實驗第一部份我們利用專一性引子以反轉錄聚 合酶連鎖反應 (RT-PCR) 證實在 K562 細胞之中 ZNF74 基因是以 isoform I 存在。實驗第二部份,我們利用將 HA-ZN F74 基因植入表現 N1IC 的人類細胞 HEK293 ,獲得細胞萃取液後再利用 anti-HA 或 anti-N1IC 抗體來進行共同免疫 沉澱法 (co-immunoprecipitation) 反應,結果顯示 ZNF74 確實可以跟 N1IC 結合。為了更進一步找出 ZNF74 蛋白上是 利用那個區域與 N1IC 做結合,我們利用可表現 MBP 融合的不同短縮型 ZNF74 之蛋白與表現 N1IC 或 Ankyrin(Ank) 的細胞萃取液混合。結果顯示, ZNF74 的 zinc finger 區域與 Ank 的結合是必需的。實驗最後部份,我們利用 SELE X(systematic evolution of ligands by exponential enrichment ) 來找出 ZNF74 結合的特定核苷酸序列為何。經過軟體序 列比對結果相當複雜並無一致性。因此,根據上述的結果顯示,本實驗仍需要進一步的研究才能夠釐清在 K562 細 胞中 ZNF74 蛋白參與 Notch 訊息傳遞下所扮演的生物角色為何。
Development of the carrier
for the preparation of potent carbohydrate immuno gen