開發增強醣類免疫抗原性之載體

開發增強醣類免疫抗原性之載體

 Notch 是個演化上具高度保留，穿過細胞膜一次的受體蛋白，在哺乳類的 Notch 受體蛋白有 Notch1 4∼ 四種，被認 為可調控基因的轉錄、細胞的增生、分化及早期細胞命運的決定，而 Notch 訊息傳遞的異常或突變會造成某些疾病 的發生。當相鄰細胞表現的 ligand 與 Notch 受體蛋白的細胞外區域結合時， Notch 訊號傳遞系統就被活化，整個細 胞內區域在靠近內膜處被蛋白分解脢切斷，而形成活化型 Notch (Notch IC, 細胞內區域 ) 。此活化型 Notch 會轉移至 細胞核中，並且和一些可與 DNA 結合的轉錄因子，如： RBP-Jκ/CBF1 ，以及其他細胞因子結合，進一步調控標的 基因的表現。所以這些參與的因子，對於 Notch 訊息傳遞路徑影響甚巨。因此，為了進一步探討 Notch 訊息傳遞路 徑，本論文首要目標著重於探索參與 Notch1 下游訊息傳遞路徑仍未知的結合因子，及初步分析這種結合所產生的 生物功能。

本實驗參考葉添順老師與本實驗室先前利用 GST-N1IC-ANK repeats 之融合蛋白，與 K562 細胞萃取液混合，進行 G ST pull down Assay 來分析該細胞中有何蛋白質可與 GST-N1IC-ANK 融合蛋白做結合，並收集與融合蛋白結合的複 合體，用 2-D 電泳及質譜儀分析此複合體的成員為何。在分析蛋白質體的數據中發現有數個候選蛋白質包括鋅手指 蛋白的存在。分析比對之結果發現 ZNF74 的吻合度最高。 ZNF74 屬於 C2H2 type 的鋅手指蛋白。在其 N 端部份包 含了一段稱為 Krueppel-associated box (KRAB) 的區域，在 C 端部份包含 12 個 zinc finger motifs 。具有 KRAB 區域 的蛋白主要功能到目前為止所知均具有抑制基因表現之功能，而 zinc finger 區域則是與特定的 DNA 序列做結合。因 此本實驗有興趣繼續探討 ZNF74 與 Notch 1 之訊號傳遞是否有關。在實驗第一部份我們利用專一性引子以反轉錄聚 合酶連鎖反應 (RT-PCR) 證實在 K562 細胞之中 ZNF74 基因是以 isoform I 存在。實驗第二部份，我們利用將 HA-ZN F74 基因植入表現 N1IC 的人類細胞 HEK293 ，獲得細胞萃取液後再利用 anti-HA 或 anti-N1IC 抗體來進行共同免疫 沉澱法 (co-immunoprecipitation) 反應，結果顯示 ZNF74 確實可以跟 N1IC 結合。為了更進一步找出 ZNF74 蛋白上是 利用那個區域與 N1IC 做結合，我們利用可表現 MBP 融合的不同短縮型 ZNF74 之蛋白與表現 N1IC 或 Ankyrin(Ank) 的細胞萃取液混合。結果顯示， ZNF74 的 zinc finger 區域與 Ank 的結合是必需的。實驗最後部份，我們利用 SELE X(systematic evolution of ligands by exponential enrichment ) 來找出 ZNF74 結合的特定核苷酸序列為何。經過軟體序 列比對結果相當複雜並無一致性。因此，根據上述的結果顯示，本實驗仍需要進一步的研究才能夠釐清在 K562 細 胞中 ZNF74 蛋白參與 Notch 訊息傳遞下所扮演的生物角色為何。

Development of the carrier

for the preparation of potent carbohydrate immuno gen



Changes in glycosylation are often a hallmark of disease states. Recently, carbohydrates have been proved to the most clinical relevant antigens of the many well-defined antigens for vacci nes against infectious diseases. In fact, cancer cells also display glycans at different levels than normal cells. This also leads tumor-associated carbohydrate antigens as one of the targets for i mmunotherapy and diagnosis of human cancer. Because the immunogenicity of carbohydrate i s very weak, it is essential for elevating immune response by conjugating carbohydrate to a pr otein carrier. Unfortunately, the protein carriers used so far have low conjugating efficiency. It leads the development of carbohydrate-based cancer vaccine becomes a very difficult job. In t his study, we design and construct an antigen carrier for carbohydrate conjugating efficiently a nd delivering into antigen presenting cells. For this propose, we used the idea of Linear-Array- Epitope (LAE) to construct DNA fragments encoding cysteine rich peptide for carbohydrate c onjugation, followed by subcloning it into a protein expression vector. The final carrier protei n is a fusion protein containing the receptor binding domain of pseudomonas aeruginosa exoto xin A and cysteine rich peptide. Our preliminary study showed that the ratio of carbohydrate c onjugated to the protein carrier is great increased when compared to commercial available car bohydrate carrier. We then apply it in animal study. After immunizing the BALB/c mice with t his carbohydrate immunogen, the induced antibodies against carbohydrate were examined by western blotting and dot blotting. In this study, we demonstrate that our new designed carrier c an offer high conjugating efficiency for various carbohydrates to solve the low immunogenicit y of carbohydrate in the generation of anti-carbohydrate

antibody.