ÖZET
Bu yaz›da birçok hastanedeki hastane infeksiyonlar›ndan s›kl›kla izole edilen Acinetobacter baumannii, Escherichia co- li ve Klebsiella türlerinin alttiplendirmesinde kullan›lmak üzere optimize edilmifl, h›zl› ve ortak bir “pulsed-field” jel eletrofo- rez (PFGE) protokolü sunulmufltur. Optimize edilen yöntem basit, tekrarlanabilir ve farkl› bakteriler için kullan›ma uygun bulunmufltur. Ayr›ca süreyi k›saltmas›, kullan›lan çözelti ve enzimlerin düflük hacimleriyle çal›fl›labilmesi nedeniyle, ekono- mik olarak de¤erlendirilmifltir. Çal›fl›lan bakterilere ba¤l› salg›nlar› de¤erlendirme ve hastane infeksiyonlar›n›n yayg›nl›k de- recesi hakk›nda yararl› bilgiler sunma potansiyeli vard›r. Optimize edilen bu protokol, farkl› merkezlere ait PFGE sonuçlar›- n›n birbirleriyle karfl›laflt›rmas›na olanak sa¤layabilir.
Anahtar sözcükler: Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella türleri, moleküler tiplendirme, pulsed-field jel elek- troforez
SUMMARY
A Rapid Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) Protocol Developed for Subtyping Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, and Klebsiella spp.
This paper provided information about a rapid pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) protocol optimized for subtyping of Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, and Klebsiealla spp. which are commonly isolated from nosocomial infections in many hospitals. The procedure was simple, reproducible and versatile. Furhermore it is likely cost-effective because of reducing time, reagent volumes and enzymes. It has potential to identify outbreaks and follow spreading degree of nosocomial infections caused by the tested bacterial strains. This optimized protocol can allow PFGE fingerprinting profiles of the isolates from different settings to be compared.
Keywords: Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella spp., molecular typing, pulsed-field gel electrophoresis
G‹R‹fi
Acinetobacter baumannii, hastane ortam›n- daki lavabolar, ventilasyon cihazlar›, nemlendi- riciler, hastalar ve sa¤l›k personellerinin elleri
üzerinde uzun süre varl›¤›n› devam ettirebilen f›rsatç› bir patojendir(3). Birçok antibiyoti¤e h›z- la direnç kazanan bu bakteri, baflta yo¤un ba- k›m üniteleri olmak üzere çeflitli birimlerde cid- di salg›nlara sebep olabilmektedir(3,5,12,15).
ACINETOBACTER BAUMANNII, ESCHERICHIA COLI VE KLEBSIELLA TÜRLER‹N‹N MOLEKÜLER T‹PLEND‹RMES‹NDE KULLANILAB‹LECEK KISA SÜREL‹ “PULSED-FIELD GEL” ELEKTROFOREZ (PFGE) PROTOKOLÜ*
R›za DURMAZ, Bar›fl OTLU, Ahmet ÇALIfiKAN, Nafia GÜRSOY
‹nönü Üniversitesi T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, MALATYA
Yaz›flma adresi: R›za Durmaz. ‹nönü Üniversitesi T›p Fakültesi, T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, MALATYA Tel.: (0422) 341 01 26, GSM: (0539) 229 56 91
e-posta: rdurmaz@inonu.edu.tr
Al›nd›¤› tarih: 31.05.2007, revizyon kabulü: 01.06.2007
* Bu yaz›; TÜB‹TAK Sa¤l›k Bilimleri Araflt›rma Grubu’nca desteklenen 106S211 (SBAG-3459) numaral› “Hastane ‹nfeksiyonu Etkeni Olan Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Escherichia coli, Staphylococcus spp. ve Acinetobacter baumannii
‹zolatlar›n›n Moleküler Tiplemesinde Kullan›lacak “Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)” Yöntemlerinin Standardizasyonu ve Kit Format› Haline Getirilmesi -PulseNet- TÜRK‹YE ‹çin Haz›rl›k” bafll›kl› proje kapsam›nda yap›lan optimizasyon
çal›flmalar›n›n sonuçlar›n› içermektedir.
Escherichia coli ve Klebsiella türlerinin antibiyo- tiklere dirençli sufllar›, baflta yo¤un bak›m üni- teleri olmak üzere, hastanelerin birçok servisle- rinde giderek artan oranlarda infeksiyonlardan izole edilmektedir(1,7,9). Bu bakterilerin klonal yay›l›m›na ba¤l› olarak geliflmifl birçok salg›n gösterilmifltir(4,7).
Moleküler tiplendirme yöntemleri köken- ler aras›ndaki klonal iliflkiyi ortaya koyarak, sal- g›nlar›n kaynak, bulafl yollar› ve bulafl›n derece- si hakk›nda oldukça yararl› bilgiler sunmakta- d›r. Bakteriler aras›ndaki klonal iliflkiyi araflt›r- mada farkl› moleküler tiplendirme yöntemleri denenmektedir(11). Bunlar aras›nda ayr›m gücü en yüksek olan “pulsed-field jel elektroforez (PFGE)” yöntemidir(10,11). Alt›n standart olarak kabul edilen bu yöntemin, en önemli dezavan- taj›, farkl› laboratuvarlarda de¤iflik protokolle- rin uygulanmas› nedeniyle sonuçlar›n birbirle- riyle k›yaslanma olana¤›n›n olmamas›d›r. ‹kinci önemli sorun ise klasik PFGE protokollerinin 3-4 gün gibi uzun sürede sonuçlanmas›d›r(6). Arafl- t›r›c›lar bu iki majör sorunu gidermek üzere yo-
¤un çaba harcamaktad›rlar. Birçok bakteri türü- nün moleküler tiplendirmesinde kullan›labile- cek, k›sa sürede sonuçlanan ve laboratuvarlar aras› tekrarlanabilen sonuçlar al›nabilecek PFGE protokolleri üzerinde çal›fl›lmakta- d›r(2,8,10,14).
Laboratuvar›m›zda, TÜB‹TAK taraf›ndan desteklenen 106S211 (SBAG-3459) nolu proje kapsam›nda A.baumannii, E.coli ve Klebsiella tür- lerinin klonal iliflkisinin belirlenmesinde kulla- n›labilecek k›sa süreli, ortak bir PFGE protokolü gelifltirilmifltir. Bu yaz›da protokolün ayr›nt›lar›
sunulmufltur.
YÖNTEM
PFGE yöntemi; agaroz içine gömülü hal- deki bakteriden, yap›sal bütünlü¤ü bozulma- dan izole edilen kromozomun, restriksiyon en- zimi (RE) ile kesim profilinin belirlenmesi esas›- na dayan›r. Yöntemde bafll›ca flu aflamalar bu- lunmaktad›r: Çal›fl›lacak bakterilerin haz›rlan- mas›, bakterilerin agarozla kar›flt›r›lmas›, aga- roz içindeki bakterilerin parçalanmas› (in situ- lysis), agaroz içindeki kromozomun saflaflt›r›l-
mas›, agaroz içindeki kromozomal DNA’n›n restriksiyon enzimi ile kesilmesi (in situ-digesti- on), elektroforezle DNA parçalar›n›n ayr›flt›r›l- mas›, DNA bantlar›n görünür hale getirilmesi ve sonuçlar›n yorumlanmas›(6).
A. ‹zolatlar›n haz›rlanmas›(2,14):
1. Biyokimyasal ve/veya moleküler yöntem- lerle tür düzeyinde tan›mlamas› yap›lm›fl bakterilerden kanl› triptikaz soy agar besiye- rine tek koloni ekimi yap›l›r.
2. Bir gecelik inkübasyondan sonra kültürün safl›¤› kontrol edilir.
3. Buradaki tek koloniden tekrar triptikaz soy agar besiyerine, tek koloni ekimine uygun olacak flekilde, pasaj yap›larak bir gece inkü- basyona b›rak›l›r.
4. Saf kültür halinde üreyen koloniler plastik öze ile toplanarak, 1 ml hücre süspansiyon tamponu (HST) (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 8.0) içinde süspanse edilir.
5. Hücre süspansiyonu, 2500 x g’de, 4°C’de, 15 dakika (alternatif olarak 13.000 x g’de, 4°C’de, 2 dakika) santrifüj edilir. Santrifüj sonras›nda üstteki HST at›l›r.
6. Peletin üzerine tekrar 1 ml so¤uk HST ekle- nerek, k›sa süreli vorteks yap›l›r.
7. Bakteri yo¤unlu¤u, spektrofotometre (UV/Vis. Spectrophotometer, Boeco, Ger- many) yard›m›yla 590 nm’de 1 absorbans (yaklafl›k McFarland 4 bulan›kl›¤›) olacak fle- kilde ayarlan›r. Bakteri süspansiyonu k›sa süre içinde (5 dakika) agaroza gömülecek ise oda ›s›s›nda, gecikecek ise k›r›k buz içinde bekletilir.
B. ‹zolatlar›n agaroza gömülmesi(2,14): 1. HST içerisinde % 2’lik düflük erime ›s›l› aga-
roz (Gibco BRL, Paisley, UK) haz›rlan›r.
• 0.50 g agaroz, 100 ml’lik balona konur.
• Üzerine 23.5 ml HST eklenir, yavaflça ka- r›flt›r›larak agar›n da¤›lmas› sa¤lan›r.
• Balonun a¤z›na alüminyum folyo kapat›- larak mikrodalga f›r›nda 10 saniye tutulur, ç›kar›larak hafifçe kar›flt›r›l›r. Tekrar 2-3 saniye mikrodalga f›r›n›nda tutulur. Aga- roz iyice çözülünceye kadar k›sa süreli mikrodalgada tutma ifllemi tekrarlan›r.
• Agaroz iyice çözüldükten sonra, balon 45-50°C’lik su banyosuna konur.
• % 20’lik sodyum dodezil sülfattan (50°C’de
›s›t›lm›fl) 1.25 ml eklenerek iyice kar›flt›r›l›r.
• Agaroz-SDS kar›fl›m›ndan 200 µl Epen- dorf tüplere da¤›t›l›r ve 45-50°C'deki su banyosunda (veya kuru ›s› blo¤unda) bekletilir.
2. Her sufl için bir agoroz kal›b› iflaretlenip buz kab›na oturtulur.
3. HST içinde haz›rlanm›fl bakteri süspansiyo- nundan 200 µl al›narak, 50°C'de tutulan ve içerisinde 200 µl düflük erime ›s›l› agaroz- SDS bulunan tüpe eklenir. Birkaç defa pipe- taj yap›larak hücrelerin agaroz içinde homo- jen da¤›lmas› sa¤lan›r.
4. Bekletilmeden, hücre-agaroz-SDS kar›fl›m›n- dan -hava kabarc›¤› olmayacak flekilde- aga- roz kal›b›na (10 mm x 5 mm x 1.5 mm, Bio Rad Laboratories) 100 µl da¤›t›l›r.
5. Kal›plar, agaroz kat›lafl›ncaya kadar +4°C’de, 10 dakika bekletilir. Bu aflamada agaroz kal›plar›n so¤ukta tutulmas› kaliteli DNA haz›rlanmas› için önemlidir. Böylece erken hücre parçalanmas› ve endonükleaz aktivitesi azal›rken, agarozun homojen kat›- laflmas› sa¤lanmaktad›r.
C. Agaroz içindeki hücrelerin parçalan- mas›(14):
1. 5 ml’lik steril kapakl› tüplere, 0.5 ml hücre li- ziz solüsyon I (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA, 2.5 mg/ml lizozim, 1.5 mg/ml proteinaz K) konur.
2. ‹çerisinde bakteri bulunan agaroz, kal›ptan ç›kar›larak lizis solüsyonuna yerlefltirilir.
3. 37°C’de 1 saat çalkalamal› su banyosunda bekletilir (Not: Tüp su banyosuna hafif yat›k pozisyonda yerlefltirilir).
4. Liziz solusyon I dökülerek, yerine 0.5 ml hücre liziz solüsyon II (0.5 M EDTA, % 1 sarkozil, 400 µg/ml proteinaz K) konur.
5. 55°C’de 2 saat çalkalamal› su banyosunda bekletilir.
D-Hücre lizizinden sonra agaroz kal›pla- r›n y›kanmas›(2,14):
1. Lizis aflamas›ndan sonra agaroz kal›b›n›n ka- t›laflmas› için tüpler buz içerisinde en az 15
dakika bekletilir.
2. Dikkatlice lizis solüsyonu II aspire edilir.
3. ‹çinde agaroz kal›p bulunan tüpe, 50°C’ye
›s›t›lm›fl olan steril ultra saf sudan (Reagent Grade Type 1) 4 ml eklenerek, 50°C çalkala- mal› su banyosunda 15 dakika bekletilir (su ile y›kama ifllemi).
4. Su tamamen aspire edilir. Üçüncü maddede belirtilen su ile y›kama ifllemi iki defa daha tekrarlan›r. Su tamamen aspire edilir.
5. Daha sonra agaroz kal›plar› üç defa (her biri 50°C’de 15 dakika olmak üzere), 4 ml TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6) tam- ponuyla y›kan›r (Not: Y›kama sonras› agaroz kal›plar fleffaflafl›r).
6. Böylece içinde saflaflt›r›lm›fl DNA bulunan agaroz, restriksion enzimi (RE) ile kesime haz›r hale getirilmifl olur.
E. Agaroz kal›plar› içindeki DNA’n›n RE ile kesilmesi:
A.baumannii için etkinli¤i daha önce araflt›- r›lm›fl olan ApaI(3,10,15), E.coli ve Klebsiella spp için XbaI(1,4,6)enzimi kullan›lm›flt›r.
A.baumannii DNA’s›n› içeren kal›plar›n ApaI RE ile kesimi:
1. DNA içeren agaroz kal›b› bir lam üzerine al›- narak bir bistürü yard›m›yla 1/4 oran›nda kesilir. Parçalardan biri, 100 µl 1x ApaI tam- ponu içine konarak çalkalamal› su banyo- sunda 37°C’de 10 dakika bekletilir (Di¤er parçalar sonraki çal›flmalarda kullan›lmak üzere TE tamponu içinde saklan›r). Sonra s›- v› aspire edilir.
2. Her agaroz kal›b› için afla¤›daki kar›fl›m ha- z›rlan›r:
10 µl 10x ApaI tamponu 3 µl ApaI enzimi (10 U/µl)
(Promega Corporation, WI, USA) 1 µl BSA (10 µg/µl)
86 µl steril ultra saf su (Reagent Grade Type 1)
Toplam hacim 100 µl.
3. Bu kar›fl›m›n içerisine, enzimin tamponu ile y›kanm›fl agaroz kal›b› konulup, çalkalamal›
su banyosunda 37°C’de 2 saat inkübe edilir(3). 4. ‹nkübasyon sonunda tüpler buzdolab›nda
15 dakika bekletilir.
5. Kal›plar elektroforez için haz›rd›r.
E.coli ve Klebsiella bakterilerinin DNA’s›n›
içeren kal›plar›n XbaI RE ile kesimi:
A.baumannii’deki ifllemler aynen tekrarla- n›r. Farkl› olarak: XbaI (20 U/örnek) enzimi (Promega Corporation, WI, USA) ve onun tam- ponu kullan›l›r.
E. Elektroforez jelinin haz›rlamas› ve ka- l›plar›n jele yüklenmesi(2):
1. 0.5 x TBE (44.5 mM Trisma base, 44.5 mM Borik asit, 1 mM EDTA, pH 8.0) içinde 100 ml olacak flekilde % 1’lik agaroz (pulsed-fi- eld certified agarose, Bio-Rad Laboratories) haz›rlan›r.
i. 1 g “pulsed-field certified agarose” 200 ml’lik balona konur.
ii. Üzerine 100 ml 0.5 x TBE eklenir, yavaflça kar›flt›r›larak agar›n da¤›lmas› sa¤lan›r.
iii. Balonun a¤z›na aliminyum folyo kapat›- larak mikrodalga f›r›nda 60 saniye tutu- lur, ç›kar›larak hafifçe kar›flt›r›l›r, tekrar 15 saniye mikrodalga f›r›n›nda tutulur.
iv. Agaroz iyice çözüldükten sonra, balon 45-50°C’lik su banyosuna konur.
2. Agaroz dökülecek kaset haz›rlan›r, s›zd›r- mamas› için etraf› bantlan›r. Su terazisi ile ta- mamen düzgün oldu¤u kontrol edilmifl bir zemine konur.
3. RE ile kesilmifl olan agaroz kal›plar›n›n her bi- ri, 15 diflli tara¤›n difllerinin uç k›sm›na (tara-
¤›n uç çizgisine tam paralel olacak flekilde) yerlefltirilir. Tara¤›n iki kenar ve ortas›ndaki difllerine kontrol sufluna ait kal›plar yüklenir.
4. Kurutma k⤛d› veya havlu ile agaroz kal›p- lar›n›n etraf›ndaki s›v›n›n fazlas› al›n›r. Mak- simum 5 dakika oda ›s›s›nda bekletildikten sonra, örnek konulan k›s›m DNA’n›n yürü- yece¤i yöne gelmek kayd›yla, tarak agaroz dökülecek kaset içine yerlefltirilir.
5. Su banyosundan ç›kar›lm›fl ve s›cakl›¤› yak- lafl›k 45-50°C (çok önemli) olan agaroz dik- katli bir flekilde hava kabarc›¤› oluflturulma- dan kaset içine dökülür.
6. Oda ›s›s›nda 20-30 dakika kat›laflmaya b›ra- k›l›r. Tarak dikkatlice ç›kar›l›r. ‹stenirse çu- kurlar % 1’lik agarozla doldurulabilir.
7. Sonra, agaroz kasetinin çerçeveleri ç›kar›l›r, tabla üzerindeki agaroz, içerisinde 1900-2000 ml
0.5 x TBE tamponu bulunan PFGE tank›na yerlefltirilir.
F. Elektroforez:
Her üç bakteri için ayn› elektroforez koflul- lar› uygulan›r. CHEF-DR II sisteminde (Bio-Rad Laboratories, Nazareth, Belgium) uygulanan elektoforez koflullar›: Bafllang›ç vurufl süresi 5 sn, bitifl vurufl süresi 30 sn, vurufl aç›s› 120°, ak›m 6 V/cm2, s›cakl›k 14°C, süre 20 saat.
G. Sonucun gözlenmesi ve analizi:
1. Eletroforezden sonra jel, 5 µg/ml etidyum bromür içeren 400 ml ultra saf su içine al›n›r.
20 dakika boyan›r.
2. UV ›fl›¤a alt›nda görüntülenir.
3. Gel logic 2200 imaging system (ayr›m gücü:
1708x1280 pixel, Kodak Company, NY, USA) kullan›larak DNA bant görüntülerinin foto¤- raf› çekilir. Resimler TIFF format›nda kay›t edilir.
4. GelCompar II yaz›l›m sistemi (version 3.0;
Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) kullan›larak bant profilleri analiz edilir. Ön- celikle her resimde bulunan üç adet standart (1, 7, 15. kuyucuklarda yürütülen) yard›m›
ile resimler aras› normalizasyon yap›l›r.
“Unweighted pair group method with mat- hematical averaging (UPGMA)” kullan›larak PFGE profillerinin, dendrogram› oluflturulur ve kümeleflme analizi yap›l›r. Bantlara ba¤l›
“Dice” benzerlik katsay›s›na göre sufllar ara- s›ndaki iliflki belirlenir. Benzerlik katsay›s›- n›n hesaplanmas›nda bant ve profil toleran- s›, % 1-1.5 olarak al›n›r(10,15).
5. Tenover ve ark.(13) taraf›ndan gelifltirilmifl kriterler kullan›larak izolatlar ayn›, yak›n iliflkili, muhtemel iliflkili ve iliflkisiz olarak de¤erlendirilir.
• Ayn› izolatlar: Ayn› say› ve boyutlarda bant içeren izolatlar için kullan›l›r. Bu izolatlar, genetik olarak farks›z kabul edi- lir. Epidemiyolojik olarak iliflkilidir.
• Yak›n iliflkili izolatlar: Salg›n suflu ile arala- r›nda 2-3 bant fark› vard›r. Büyük bir ola- s›l›kla salg›nla iliflkili sufllard›r.
• Muhtemel iliflkili izolatlar: Salg›n sufllar› ile aralar›nda 4-6 bant fark› vard›r. Muhte-
melen salg›nla iliflkilidirler.
• ‹liflkisiz izolatlar: Aralar›nda ≥7 bant fark›
olan sufllar salg›nla iliflkileri bulunmayan sufllard›r.
Yapt›¤›m›z optimizasyon çal›flmalar› so- nucunda:
1. E.coli, Klebsiella spp. ve A.baumannii için or- tak kal›p haz›rlama, kal›ptaki bakterilerin parçalanmas› ve kal›plar›n y›kanmas› afla- malar›nda kullan›lacak ortak protokol olufl- turulmufltur.
2. A.baumannii, Klebsiella spp. ve E.coli bakteri- lerinin tiplendirilmesinde kullan›labilecek ortak ve çal›flman›n ertesi günü sonuç al›na- bilen k›sa süreli bir protokol gelifltirilmifltir.
3. Literatürde ApaI enzimi için örnek bafl›na önerilen 60 U yerine 30 U, 40 U XbaI yerine 20 U’nin yeterli oldu¤u saptanm›flt›r.
4. Literatürde kullan›lan 4 ml hücre liziz tam- ponu yerine, 500 µl’lik hacmin de etkili ola- bildi¤i do¤rulanm›flt›r.
5. Gelifltirilen protokolün laboratuvar içi tek- rarlanabilirli¤i test edilmifltir.
TEfiEKKÜR: Proje deste¤i için TÜB‹TAK Sa¤l›k Bilimleri Araflt›rma Grubu’na teflekkür ederiz.
KAYNAKLAR
1. Bagattini M, Crivaro V, Di Popolo A et al: Mole- cular epidemiology of extended-spectrum beta- lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit, J Antimicrob Che- mother 2006;57(5):979-82.
2. Centers for Disease Control and Prevention: Stan- dardized laboratory protocol for molecular sub- typing of Escherichia coli 0157:H7, non-typhoidal Salmonella serotypes, and Shigella sonnei by pul- sed-field gel electrophoresis (PFGE), http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols/eco- li_salmonella_shigella_protocols.pdf.
3. Guducuoglu H, Durmaz R, Yaman G, Cizmeci Z, Berktas M, Durmaz B: Spread of a single clone Acinetobacter baumannii strain in an intensive care unit of a teaching hospital in Turkey, New Microbiol 2005;28(4):337-43.
4. Mamlouk K, Boutiba-Ben Boubaker I, Gautier V et al: Emergence and outbreaks of CTX-M beta-lac- tamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains in a Tunisian hospital, J Clin
Microbiol 2006;44(11):4049-56.
5. Maslow JN, Glaze T, Adams P, Lataillade M: Con- current outbreak of multidrug-resistant and sus- ceptible subclones of Acinetobacter baumannii affecting different wards of a single hospital, In- fect Control Hosp Epidemiol 2005;26(1):69-75.
6. Maslow JN, Slutsky AM, Arbeit RD: Application of pulsed-field gel electrophoresis to molecular epidemiology, “Persing HD, Smith TF, Tenover FC, White TJ (eds): Diagnostic Molecular Micro- biology: Principles and Applications” kitab›nda s.563-72, ASM Press, Washington DC (1993).
7. Naseer U, Natas OB, Haldorsen BC et al: Nosoco- mial outbreak of CTX-M-15-producing E.coli in Norway, APMIS 2007;115(2):120-6.
8. Ribot EM, Fitzgerald C, Kubota K, Swaminathan B, Barrett TJ: Rapid pulsed-field gel electrophore- sis protocol for subtyping of Campylobacter jeju- ni, J Clin Microbiol 2001;39(5):1889-94.
9. Rodriguez-Bano J, Navarro MD, Romero L et al:
Clinical and molecular epidemiology of exten- ded-spectrum beta-lactamase-producing Esche- richia coli as a cause of nosocomial infection or co- lonization: implications for control, Clin Infect Dis 2006;42(1):37-45.
10. Seifert H, Dolzani L, Bressan R et al: Standardiza- tion and interlaboratory reproducibility assess- ment of pulsed-field gel electrophoresis-genera- ted fingerprints of Acinetobacter baumannii, J Clin Microbiol 2005;43(9):4328-35.
11. Seifert H, Gerner-Smidt P: Comparison of riboty- ping and pulsed-field gel electrophoresis for mo- lecular typing of Acinetobacter isolates, J Clin Microbiol 1995;33(5):1402-7.
12. Stephens C, Francis SJ, Abell V, DiPersio JR, Wells P: Emergence of resistant Acinetobacter bauman- nii in critically ill patients within an acute care tea- ching hospital and a long-term acute care hospi- tal, Am J Infect Control 2007;35(4):212-5.
13. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV: How to se- lect and interpret molecular strain typing met- hods for epidemiological studies of bacterial in- fections: a review for healthcare epidemiologists.
Molecular Typing Working Group of the Society for Healthcare Epidemiology of America, Infect Control Hosp Epidemiol 1997;18(6):426-39.
14. Turabelidze D, Kotetishvili M, Kreger A, Morris JG Jr, Sulakvelidze A: Improved pulsed-field gel electrophoresis for typing vancomycin-resistant enterococci, J Clin Microbiol 2000;38(11):4242-5.
15. Zarrilli R, Casillo R, Di Popolo A et al: Molecular epidemiology of a clonal outbreak of multidrug- resistant Acinetobacter baumannii in a university hospital in Italy, Clin Microbiol Infect 2007;13(5):481-9.
