Gram Boyama
Bakterilerin hücre duvarı farklılıklarından yararlanılarak
bakterileri Gram (+) ve Gram (-) olarak ayırmaya yarayan temel bir yöntemdir.
Yöntemi bulan kişi Danimarkalı bilim insanı Hans Christian Gram’dır.
Bakterilere etki eden antibiyotikler ve bu bakterilerin
antibiyotiklere karşı duyarlılıkları Gram ile boyanma özellikleri ile yakından ilişkili olduğu için son derece önemli bir metotdur.
Hücre duvarında peptidoglikan bulundurmayan ya da hücre duvarı
bulunmayan bakteriler Gram boyama ile boyanmaz.
Gram Boyama
Gram (+) bakterilerde kalın bir peptidoglikan tabakası bulunurken, Gram (-) bakterilerde bu tabaka daha incedir.
Gram (+) bakterilerin hücre duvarında karbonhidratlar daha yoğunken Gram (-) bakterilerin hücre duvarında ise lipidler daha
fazladır. Ek olarak Gram (-) bakterilerin hücre duvarlarında lipopolisakkarit (LPS) denilen bir tabaka vardır.
Bu hücre duvarı farklılıkları bakterilerin Gram boyamada farklı renklerde gözükmesini sağlar. Gram (+) bakteriler mor, Gram (-)
bakteriler pembe-kırmızı gözükürler.
Gram Boyama
Malzemeler: Bacillus subtilis ve Escherichia coli’nin taze kültürü (karışık kültür olarak kullanılacaktır), öze, kristal viyolet, lugol çözeltisi, %95’lik etanol, safranin, lam, piset,
bunzen beki, mikroskop, immersiyon yağı Deneyin Yapılışı
1)Bakteriler aseptik koşullarda daha önce belirtildiği gibi lama konulur (yayma, kurutma, fiksasyon)
(İki farklı bakteri türü aseptik koşullarda tek bir lama
karışık olarak konulabilir)
Gram Boyama Prosedürü
Preparatın üzerine kristal viyole damlatılarak 1 dk beklenir
Preparat distile suyla yavaşça yıkanır.
Preparatın üzerine lugol konulur ve 1 dk beklenir.
Preparat distile suyla yavaşça yıkanır.
Preparata %95’lik etanol konularak 10-15 saniye beklenir. Bu sürenin fazla aşılmaması gerekir. (Dekolorizasyon aşaması).
Preparat distile su ile yavaşça yıkanır.
Preparatın üzerine safranin boya çözeltisi damlatılır ve 30 saniye beklenir.
Preparat distile suyla yavaşça ve akan suyun rengi berraklaşana kadar yıkanır.
Örnekler kurutulur ve mikroskopta incelenir. Mor renkli mikroorganizmalar Gram
(+), pembe-kırmızı renkte görülenler ise Gram (-) olarak ayrılır.
Gram Boyama Nasıl Çalışır?
lam
1) Kristal viole (mor) ile boyama-1 dakika Bu aşamada tüm mikroorganizmalar mora
boyanır.
lam
2) Lugol eklenmesi
Bu aşamada lügol ile kompleks yapılar oluşur.
lam
lam
3) Alkol ile dekolorizasyon Süreçteki en kritik aşama burasıdır.
Mor kompleksler Gram (+) hücrelerde kalın peptidoglikan yapıdan ötürü dışarı çıkamazken Gram (-)’lerde kompleks yapılar dışarı çıktığı için
Gram (-)’ler bu aşamada renksiz gözlenir
4) Safranin (pembe) eklenmesi
Bu aşamaya karşıt boyama (counter staining) de denir.
Zaten mora boyanmış olan Gram (+) ‘ler kırmızı renkteki safraninle boyanmazlar, buna karşın Gram (-)’ler renksiz
hale döndükleri için kırmızı-pembeye boyanırlar.
