iNSULiNE BAGIMLI DiABETES MELLiTUSLU HASTALARDA PLAZMA LiPiD PEROKSiT SEviYELERi VE ERiTROSiT GLUKOZ-6-FOSFAT

ARA$TIRMALAR (Research Reports)

iNSULiNE BAGIMLI DiABETES MELLiTUSLU HASTALARDA PLAZMA LiPiD PEROKSiT SEviYELERi VE ERiTROSiT GLUKOZ-6-FOSFAT

DEHIDROGENAZ AKTiviTESi

Plasma lipid peroxidation levels and erythrocyte glucose-6- phosphate dehydrogenase activity in patients with insulin-dependent diabetes mellitu s

Seval YILMAZ^1, Bilal 0STl)NDAG ²

Ozet

Amar;:Bu r;ali:jmada, insiiline baguitli diabetes mellituslu hastalarda lipid peroksidasyonunun gostergesi olan malondialdehit (MDA) diizeyleri ile ve eritrosit glukoz-6- fosfat dehidrogenaz (G-6-PD) aktivitesi olr;iilerek

hastaltkla olan ili:jkileri ara:jtmldi.

Gerer; veyontem: <;alt:jmada 30 insiiline bag1mli diabetes mellituslu hasta ile 20 sagltk!t ki:jiden olu:jan kontro/

grubunda kan glukozu, MDA diizeyleri ile eritrosit G-6- P D aktivitesi olr;iildii. Plazma MDA tayini, Satoh ve

Yagi'den modifiye edilen bir yontemle, spektrofotometrik olarak yap1ld1. Eritrosit G-6-PD aktivitesi Beutler 'in NADP 'nin NADP H 'a indirgenmesi esasina dayanan kinetik yontemiy/e tayin edildi.

Bulgular: Sag!tklt kontrol grubunda plazma MDA diizeyleri (ortalama ± SD) 1.92±0.33 nmol/ml bulunurken, komplikasyonsuz diabette 2.39±0.32 nmol/ml, noropati+retinopatili diabette 2. 97±0.47 nmol/ml bulundu. Eritrosit G-6-PD aktiviteleri kontrol grubunda 4. 72±1.47 UlgHb, komp/ikasyonsuz diabetik grupta 3.04±2.49 UlgHb, noropati+retinopatili diabetik grupta ise 2.98±1.59 UlgHb olarak belirlendi.

Serum glukoz diizeylerinde diabetik gruplarda anlamlL bir arll:j tespit edildi. Diabetik gruplann plazma MDA diizeyleri, kontrol grubundan anlaml1 derecede yiiksek, eritrosit G-6-PD aktiviteleri ise dii:jiik olarak saptand1

{p<0.05).

Sonur;: Sonur; olarak; Tip II diabetes mellitusda yiiksek MDA seviyeleri ile gosterildigi gibi. lipid peroksidasyonuna yo/ ar;an serbest oksijen radikallerinin artmasina bag!t olarak, eritrositlerde G-6-PD gibi eritrosit antioksidan enzim aktivitelerinin aza/abilecegi gorii:jiine vartld1.

Anahtar Kelimeler: Diabet, Glukoz, Glukoz fosfat dehidrogenaz, Lipid peroksidasyonu

F1rat Oniversilesi Veteriner Fakii/tesi ELAZIG Biyokimya. ArarGor.Dr. ^1, Y.Dof.Dr.^1. Ge/i~ tarihi: 9 $ubat I 998

Abstract

Purpose: In this study, plasma malondialdehyde (MDA, an index of lipid peroxidation) and erythrocyte glucose-6- phosphate dehydrogenase (G-6-PD) activity were investigated in 30 patients with insulin-dependent diabetes mellitus and in 20 healthy controls in order to determine whether there is any relation between these parameters and the disease.

Material and methods: Blood glucose, plasma MDA levels and G-6-PD activities were measured in 30 patients with insulin dependent diabetes mellitus and in 20 healthy controls. Plasma MDA levels were determined spectrophotometrically according to a method modified ji-om Satoh and Yagi. G-6-PD activities were measured by the method of Beutler which is based on reduction of NADP to NADPH.

Results: In the control group, the plasma MDA level (mean ±SD) was found to be l.92±0.33 nmollml, whereas in diabetic patients with neuropathy and retinopathy and in those without any complications, it was 2. 97±0.47 nmo//111/ and 2.39±0.32 nmol/m/, respectively.

Erythrocyte G-6-PD level in the control group was 4. 72±1.47 UlgHb, while in the diabetic group with neuropathy and retinopathy and in the diabetic group , without any complications it was 2.98±1.59 UlgHb and 3.04±2.49 UlgHb. respectively. Serum glucose level and plasma MDA level in the diabetic group were significantly higher than those of the control group. Erythrocyte G-6-PD levels were found to be significantly lower when compared with the control group {p<0.05).

Conclusion: As a result, we observed that G-6-PD activity was decreased in insulin-dependent diabetes mellitus due to increased free oxygen radicals which leads to lipid peroxidation, as indicated by high MDA levels.

Key Words: Diabetes, Glucose. Glucose phosphate dehydrogenase, Lipid peroxidation

Diabetes mellitus, ~iddetli insulin disfonksiyonuna bagh olarak ortaya yu<an karbonhidrat, lipit ve protein metabolizma bozuklugu ile karakterize, kompleks ve oldukya s1k rastlanan metabolik bir

Erciyes Tip Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2 I (3) 150-154, 1999 150

Yzlmaz, Ostundag

hastahkttr (l,2). Hiperglisemiye baglt olarak, belirli bir zaman sonunda ortaya ytkan retinopati, nefropati ve noropati, diabetes mellitusta gorillen en onemli komplikasyonlardir (1,3).

Son zamanlarda, diabette gori.ilen bu komplikasyonlarm olu~masmda serbest oksijen radikallerinin artmast ve antioksidan savunma sisteminin yetersiz olu~u sorumlu tutulmaktadtr (4).

Ozellikle · iyi kontrol edilmeyen diabette oksidatif aktivitenin~ artmas1 serbest radikal olu~umunu arttrmaktadir (2,5,6).

Olu~an lipid peroksitleri, kolayhkla y1kilarak en onemlisi malondialdehit (MDA) olan reaktif karbon bile~iklerini meydana getirirler. Bu nedenle, tiyobarbiti.irik asit (TBA) reaksiyonu ile MDA miktarmm oli;:i.imil dokulardaki lipid peroksidasyonunun derecesini yans1tmaktad1r (7-9).

Organizmalar, serbest oksijen radikallerinin hasanndan biyoloj ik bilti.inli.iklerini korumak iyin endojen antioksidan savunma sistemlerine sahiptirler. Pentoz fosfat yolunun ilk enzimi olan glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD) (E.C. l. l .1.49), oksijen sitotoksisitesine kar~t, hi.icresel savuruna mekanizmasmda yer alan onemli bir antioksidan enzimdir.

G-6-PD'nin eritrositlerde bulunu~u, bilhassa klinik ay1dan onemli olup G-6-PD aktivitesi i;:e~itli hastahk durumlarmda normalden sapmalar gosterebilmektedir (I 0). G-6-PD eksikliginde, detoksifikasyon s1rasmda kullanilan redtikte glutatyon (GSH), yeterli NADPH olu~turulamad1g1 ii;:in, tekrar eski etkinligini kazanmad1gmdan, eritrosit membranmm ve intraselliller ortamm oksidan etkisinde kalmasma ve ak1~kanhgm degi~mesine de neden olmaktadtr (II, 12). Enzim eksikliginde membranm doymu~ yag asitleri olan palmitik ve stearik asitlerin azald1g1, poliansatilre yag asitlerinden ozellikle ara~idonik asitin artt1g1 ₆ bildirilmi~tir. Ortamda a~m oksidan madde bulundugunda, G-6-PD eksikligi olan eritrositlerin membranlarinda peroksidasyon htzmm artt1g1 gosterilmi~tir (I 3).

<;::ah~mam1zda plazma MDA dilzeyleri, eritrosit G-6- PD aktiviteleri ara~tmlarak diabetin komplikasyonlannm patogenezinde oksidan ve antioksidan sistemlerin etkinligi incelenmeye i;:ah~Ilmt~ttr.

MATERY AL VE METOD

F1rat Oniversitesi Ttp Faki.iltesi Ara~ttrma Hastanesi ii;: Hastahklan Anabilim Dalt Endokrinoloji servisinde yatan, y11lar once tamlan konulmu~, y~

ortalamas1 47.24±9.29 yd olan, ve noropati+retinopati komplikasyonlu (n=l 8) ve komplikasyonsuz (n=l2) insillin bag1mh diabetes mellituslu toplam 30 hasta (I 9 K, 11 E) ile ya~

ortalamas1 41.88± 10.82 ytl olan 20 saghklt ki~i (12 K, 7 E) i;:ah~ma kapsamma almdt.

Bir gece ai;:ltktan sonra EDT A' h ttiplere alman venoz kan ornekleri derhal santrift.ij edilerek MDA tayini ii;:in plazma elde edildi. Eritrosit peletleri iii;:

kez serum fizyolojik (% 0,9'1uk NaCl) ile y1kanarak eritrosit stispansyonlan haz1rland1 ve G-6- PD analizi ir;in ornekler r;alt~madan hemen once I: IO hemolizat soltisyonu (2, 7 mmol Na2EDT A, 0,7 mol 2-merkaptoethanol, pH 7) ile hemolize edildi ( 14).

Plazma MDA tayini, Satoh (15) ve Yagi (16)'den modifiye edilen bir yontemle, spektrofotometrik olarak yap1ld1. Bu metot lipid peroksidasyonunun aldehid Urtinlerinden biri olan MDA ile TBA'nm reaksiyonu temeline dayanmaktad1r. Olu~an MDA, TBA ile pembe renkli bir kompleks olu~turmakta ve bu r;ozeltinin absorbans1 532 nm'de spektrofotometrik olarak olr;i.imi.i ile lipid peroksidasyonun derecesi saptanmaktad1r.

Eritrosit G-6-PD aktivitesi Beutler (l 7)'in NADP'nin NADPH'a indirgenmesi esasma dayanan kinetik yontem ile saptand1. Enzim aktivitesi 37°

C'de bir dakikada 340 nm'de olu~an 1 mmol NADPH olarak saptandt. Spesifik aktivite ise U/gHb olarak verildi. Eritrosit hemoglobin tayini iyin siyanmethemoglobin olu~umuna dayanan Drabkin (18) yontemi kullamldt. Serum glukoz di.izeyleri

151 Erciyes Tzp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21 (3) 150-154, 1999

jnsuline bagzmli diabetes mellituslu hastalarda plazma lipid peroksit seviyeleri ve eritrosit glukoz-6-fosfat dehidrogenaz aktivitesi

Technicon RA-XT otoanalizorde yapild1.

Gruplarda elde edilen sonu9lar tek yonlti varyans analiz testi (ANOV A) kullamlarak degerlendirildi.

Gruplar aras1 anlamhhk dtizeylerinin degerlendirmesinde ise (Post Anova) Tukey B ve Scheffe testleri kulla01ld1. Kontrol, komplikasyonsuz diabetik ve noropati+retinopatili diabetik gruplar kendi ic;:lerinde glukoz, MDA ve G- 6-PD parametreleri arasmda Pearson ve Spearman korelasyon testleri uyguland1.

BULGULAR

Tablo !'de kontrol, komplikasyonsuz diabetik ve noropati+retinopatili diabetiklerde ortalama serum glukoz, plazma MDA seviyeleri ile eritrosit G-6-PD aktiviteleri gosterildi.

Serum glukoz dtizeyi kontrol grubu ile kar~Ila~tmldtgmda, komplikasyonsuz diabetik grupta (p<0.001) ve noropati+retinopatili diabetik grupta (p<0.001) anlamh derecede art1~ bulundu.

Noropati+retinopatili diabetik gruptaki serum

glukoz dtizeyinin komplikasyonsuz diabetik gruba gore anlamh bir art1~ gostermedigi saptand1 (p>0.05).

Komplikasyonsuz diabetik ve noropati+retinopatili diabetik gruplarm plazma MDA dtizeyleri kontrol grubundan anlamh derecede ytiksek bulundu (s1ras1yla p<0.001, p<0.001). Noropati+retinopatili diabetik grup ile komplikasyonsuz diabetik grubun plazma MDA dtizeyleri arasmda da anlamh bir farkhllk tespit edildi (p<0.05).

Eritrosit G-6-PD aktivitesi kontrol grubu ile kar~Iia~tmld1gmda, komplikasyonsuz diabetik ve noropati+retinopatili diabetik gruplarda anlamh derecede dti~tik bulundu (p<0.001 ). Diabetik gruplar arasmda ise istatistiksel olarak bir fark bulunmadt (p>0.05). Korelasyon testleri kontrol grubu, noropati+retinopatili diabetik grup ve komplikasyonsuz diabetik gruplarda; glukoz, MDA ve G-6-PD arasmda yap1ld1. Noropati+retinopatili diabetik grupta plazma MDA dtizeyi ile eritrosit G- 6-PD arasmda bir korelasyon oldugu gozlendi (r:

0.513, p<0:05).

Tablo I. Saghkh ki~ilerde ve Diabetes Mellituslu hastalarda serum glukoz, plazma MDA seviyeleri ile eritrosit G-6-PD aktivite diizeyleri (ANOV A testi, post ANOV A testleri Tukey B ve Scheffe testleri)

Parametreler Gruplar

Diabetes Mellitus

Kontrol Noropati+Retinopatili DM Komplikasyonsuz DM p

I

n

(n=20) (n=l8) (n=l2)

Glukoz 87.44±16.79 209.90±18.56 189.58±41.99 P<0.05

(mg/dL)

PlazmaMDA 1.92±0.33 2.97±0.47 2.39±0.32 P<0.05

(nmol/ml)

EritrositG-6-DH 4.72±1.47 2.98±1.59 3.04±2.49 P<0.05

(U/g Hb)

Erciyes Tip Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21 (3) 150-154, 1999 152

Ytlmaz, Ostundag

T ARTISMA VE SONU(

Plazma lipid peroksitlerinin artmas1, saglam doku ve organlarda hasara yo! a9maktad1r. Lipid peroksidasyonu , diabetik hastalarda, uzun silrede ortaya 91kan komplikasyonlar i9in hazirlay1c1 bir faktor olabilmektedir. Diabetiklerde plazma lipid peroksitlerinin art!$! bu~ bireylerde gozlenen retinopatinin nedeni olabilir. ~u soylenebilir ki;

plazma lipid peroksit dUzeyi, diabetin prognozunu degerlendirmede faydali olabilmektedir ( 19).

Diabetes mellitusta antioksidan savunma sistemleri ve antioksidan maddelerin varhg1 olduk9a onemlidir. G-6-PD de onemli bir antioksidan enzim olarak kabul edilmektedir (20).

Bu 9ah~mam1zda plazma MDA dUzeyleri ve eritrosit G-6-PD aktiviteleri ve dolay1s1yla diabetik komplikasyonlann geli~imindeki ro!U incelendi.

<;ali~mam1zda kontrol grubu plazma MDA dUzeyleri, diabetik grubun plazma MDA dUzeyleri ile kar~Ila$tmld1gmda kontrol grubuna gore anlaml!

bir art1~ oldugu tesbit edildi. Aynca diabetik grubun eritrosit G-6-PD dUzeylerinin, kontrol grubuna gore daha dii~iik oldugu goriildii ve bu dU~Uk!Uk istatistiksel olarak anlamh bulundu. Blackman ve arkada~lan (21) plazma MDA dlizeylerinin diabetik hastalarda kontrol grubuna gore belirgin derecede daha yiiksek oldugunu bulmu~lard1r.

insulin eksikliginde artan serbest yag asitlerinin yliksek plazma MDA dlizeylerine katk1da bulundugu gosterilmi~tir. insulin hepatosit MDA Uretimini azaltmaktad1r. Diabetik ve sigara i9enlerde normal bireylere gore daha yUksek MDA degerine sahip oldugu bilpirilmi~tir. insan plazmasmdaki MDA diizeylerinin diabetik metabolizmasmdan daha 90k hipertrigliseridemi ve vaskU!er hastahga bag!J oldugu rapor edilmi~tir (21,22). Diabetiklerde plazma MDA diizeyi ylikselmekte ve artm1~ lipid peroksidasyonu diger doku ve organlarda hasar olu~turarak sekonder bozukluklarm da gostergesi olabilmektedir. Diabetik ve anjiopatisi olan hastalarda TBA reaktivitesinde onemli derecede artma, komplikasyonlan olmayanlarda ise normal plazma TBA dUzeyleri bildirilmi~tir. Bu art1~m serbest radikal a~m Uretimi

ve hilcre i9i antioksidan sistemin bozulmasmdan kaynaklanabilecegi ileri slirUlmektedir (23).

Retinopatili diabetik hastalarda da TBA reaktivite sinde art1~ gortilmti~tUr. Diab et komplikasyonlannda lipidlere ilaveten protein komplikasyonu da artar. Ozellikle, ekstrase!Uler proteinlerden kollajen, elastin, laminin, kristalin ve miyelin k1lifmdaki proteinlerde meydana gelen degi~iklikler onemlidir. Sonu9ta bu proteinlerce zengin olan dokularda (lens, damar, basal membranlar vb) meydana gelen yap1sal degi~iklikler katarakt, mi kroan j iopati, ateroskleroz ve nefropati gibi diabet komplikasyonlannda onemli rol oynar. Artm1~ lipid peroksidasyonunun , di abet komplikasyonlannm bir sonucu ya da sebebi olup olmad1g1 tam olarak bilinmemektedir. Ancak, lipid peroksidasyonunun, devamh bir siklus olan oksidatif stres ve hasann bir par9as1 olduguna inanilmaktadtr.

Yani, lipid peroksidasyonu doku hasannt, doku hasan da lipid peroksidasyonunu arttmr (24).

Nehal ve arkada~lan (25), Costagliola ve arkada~lan (26) diabetik bireylerde eritrosit ve doku G-6-PD dtizeylerini kar~1la~t1rm1~lar ve diabetiklerde, saghkl! bireylere gore G-6-PD enzim aktivitesini belirgin derecede dU$Uk, instilinin neden oldugu hipoglisemide ise G-6-PD aktivitesinin arttlgm1 saptam1~lardtr. Bizim bulgulanm1z Costagliola ve arkada~larmm bulgulan ile uyum i9indedir.

Diabetik hastalann lokositlerinde, insulin eksikligi sonucu glikolitik yo! bozulur, enerji kaynag1 olan A TP'nin azalrnas1 pentoz fosfat yolu vas1tas1yla oksidatif glikolizin artmasma ve boylece stiperoksid ve benzeri rnolekUllerin daha fazla Uretilmesine sebep olur. fe ntoz fosfat yoluyla olu~an bu oksidanlar fagositik, kemotaktik ve diger muhtemel defektlere yol a9arak hUcreye zarar verirler (27).

Bu 9ah$mada elde edilen veriler, diabetik hastalarda anj iopati patogenezinde oksidan sistemin (MDA) a~m ilretimi ve antioksidan savunma sistem enzimlerinden biri olan G-6-PD enzim etkilenmesinin onemli etken faktorlerden biri olabilecegini gostermektedir.

153 Erciyes Tzp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21 (3) 150-154, 1999

jnsiiline bag1mft diabetes mellituslu hastalarda plazma lipid peroksit seviyeleri ve erilrosit glukoz-6-fosfat dehidrogenaz alctivitesi

KAYNAKLAR

I. Yenigiin M. Her ydnii ile diabetes mellitus. Ed Yenigiin M. Haseki Hastanesi Vakfi.. istanbul 1995, ss 3-45; 547-737.

2. Wolf SP. Diabetes mellitus and free radicals. In:

Cheeseman KH, Slater TF. (eds), Free Radicals in Medicine. British Medical Bulletin. London.

1993, pp 643-649.

3. Kahn CR. Joslin 's diabetes mellitus. In. Kahn CR, Weir CC (Eds) A Warely Company. London, 1994, pp 63/-737.

4. Brownlee M, Cerami A. The Bioi:hemistry of the complications of diabetes mellitus. Ann Rev Biochem 1981: 50.385-432.

5. Wolff SP. and Dean RT Glucose au/oxidation and protein modification: The potem,ul mlc· ,,, 'autoxidative glycosylation' in dwhe!L'.1. Biochem J /987; 245:243-250.

6. Pekcan M, Aydin R, Alpuslw1 F I J/..11/c'/1 serbest radikalleri hasta/1klarda yeni b,r do11c·111 noktas1 mt? GATA Biilteni 1987; 29:869-880.

7. Bulkley GB. The role of oxygen free radicals in human disease processes. Surgery 1984; 9-1. 407-411.

8. Draper HH and Hadley M. Malondialdehyde determination as index of" lipic! peroxidation.

Methods in Enzymol I 990: I 86. F: I

-- n -

9. Bird RP, Draper HH. Comparative studies 011

different methods of malonaldehyde determination. Methods in Enzymol 1984;

105:299-305.

10. Goziikara EM. Glukoz-6-fo5fat dehidrogenaz enziminin dzellikleri, metabolik ve klinik a~·tdan dnemi. Biyokimya Dergisi 1978; J: 2-17.

11. Schaeffer F, Stainer RY. Glukoz-6-phosphate dehydrogenase, kinetics and molecular properties. Arch Microbial 1978; 116-119.

12. Beutler E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. In: CR Scriver (ed), The metabolic basis of the inherited disease· Mc Graw Hill, New York 1983, pp 1629-1653,

13. Clemens MR, Einsele H and Waller HD. The fatty acid composition of red cells deficient in glucose-6-phosphate dehydrogenase and their susceptibility to lipid peroxidation. Klin

Wochenschr /985; 63:578-582.

/4. Beutler E, Blume KG, Kaplan JC, Lohr GW, Ramot B, Valentine WN. International committee for standardizatio n in haematology:

Recommended methods for red-cell enzyme analysis. Br J Haematol !977;35:331-340.

15. Satoh K. Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method Clin Chim Acta /978; 90:37-43.

16. Yagi K. Dedection lipid peroxidation assay of blood plasma or serum. Methods in Enzymology

I 9R..f; /05.· 328-33 /.

17. Beutler E. Red cell metabolism. A Manual of Biochemical Methods. (3rd ed.) Grune-Stratton, Orlando 1984, pp 68-70.

18. Fairbank VF and Klee CG. Biochemical aspects of hematolo?Jl (2 nd ed) In: Tietz NW (ed) Texbook of Clinirnl (. 'hemislt)' WB Sounders Company.

l'/11/uddphia, CSA 1986, ppl506-/50 7.

19. Yagi K. Assay for serum lipid peroxide level and its clinical significance. Academic Press. New York 1982, pp 224-241.

20. Costagliola C. Oxidative state oj'glutathione in rl'd /,/nnd cells and plasma of diabetic patients.

< /111 /'h1·.111J/ 1Jiuche111 /990; 8:204.

21. Blackman BC. White !', Tsou W and Finkel D.

Peroxidation of plasma and platelet lipid~ in chronic cigarette smokers and insulin dependent diahetics. Ann NY Acad Sci 1989; 435:385-386.

2l Nishigaki I, Hatta N, Sakamoto N, et al. lipid peroxide levels of serum lipoprotein fractions of diabetic patiens. Biochem Med 1978; 25:373-378. 23. Oberley LW. Free radicals and diabetes. Free

Radie Biol Med J 988; 5: 113-124.

24. Pitkanen OM, Martin JM, Hallman M, et al. Free radical activity during development of insulin- dependent diabetes melfitus in the rat. life Sci 199 I; 50: 335-339.

25.Nehal M, Baquer NZ Effect of diabetes and insulin-induced hypoglycemia on hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase in red blood cells. Biochem Int /989; /9 /: 185-/9/.

26. Costagliola C, Iuliano G, Menzione M, Nesti A, Simonelli F, Rinaldi E. Systemic human diseases as oxidative risk factors in cataractogenesis.

Diabetes. Ophthalmic Res 1988; 20:308-313. 27. Bagdade JD, Root RK, Bulger RJ Impaired

leukocyte function in patients with poorly controlled diabetes. Diabetes 1974; 23:9-15.

Erciyes Tlp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 21 (3) 150-154, 1999 154