T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
BLASTOCYSTIS TÜRLERİNDE PİROSEKANS YÖNTEMİYLE ALTTÜR BELİRLENMESİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Tuğçe Nil YANTIRA
Danışman Öğretim Üyesi Doc. Dr. Funda DOĞRUMAN AL
ANKARA Haziran-2013
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
BLASTOCYSTIS TÜRLERİNDE PİROSEKANS YÖNTEMİYLE ALTTÜR BELİRLENMESİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Tuğçe Nil YANTIRA
Danışman Öğretim Üyesi Doc. Dr. Funda DOĞRUMAN AL
Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 01-2011/52 proje numarası ile desteklenmiştir.
ANKARA Haziran-2013
II
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay………...I İçindekiler………..II Resimler Listesi………..V Şekiller Listesi………...VII Tablolar Listesi...IX Semboller, Kısaltmalar………..X
1. GİRİŞ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 3
2.1. Blastocystis ... 3
2.2. Tarihçesi ... 4
2.3. Taksonomisi ... 5
2.4. Morfolojisi... 6
2.5. Yaşam Döngüsü ... 8
2.6. Epidemiyolojisi ... 10
2.7. Patogenez... 12
2.8. İmmünolojik Özellikleri ... 13
2.9. Klinik ... 15
2.10. Tedavi ... 16
2.11. Tanı Yöntemleri ... 17
2.11.1. Mikroskobik Tanı ... 17
2.11.2. Kültür ... 19
2.11.3. İmmünolojik Tanı ... 20
2.11.4. Moleküler Tanı ... 20
III
3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 29
3.1. Örneklerin Toplanması ... 29
3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler ... 29
3.2.1. Kullanılan Cihazlar ... 29
3.2.2. Kullanılan Kimyasalar ... 31
3.2.3. KullanılanTicari Kitler ... 32
3.3. Yöntemler ... 32
3.3.1. Direkt Mikroskobik İnceleme Solusyonlarının Hazırlanışı ... 32
3.3.2. Kültür Solusyonunun Hazırlanışı ... 33
3.3.3. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ... 35
3.3.4. Ekstraksiyon ... 35
3.3.5. DNA’ nın Çoğaltılması ve Gösterilmesi ... 37
3.3.6. Elektroforez için kullanılan solüsyonlar ... 40
3.3.7. Pirosekans ... 42
3.3.8. İstatistiksel Analiz ... 64
4. BULGULAR ... 65
4.1. Blastocystis Mikroskobisi ... 65
4.2. Nanodrop ile DNA Miktarı Ölçümü ... 67
4.3. PZR Sonuçları ... 69
4.4. Pirosekans Sonuçları ... 72
5. TARTIŞMA ... 81
6. SONUÇ ... 90
7. ÖZET ... 93
8. SUMMARY ... 96
IV
9. KAYNAKLAR ... 99 10. EKLER ... 115 11. ÖZGEÇMİŞ ... 117
V
Resimler
Resim 1 : Trikrom boyamada Blastocystis protozoonları. (Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Parazitoloji
Laboratuvarında çekilmiştir.) ... 18
Resim 2 : Dizilemede forward (yeşil), rewerse (sarı) ve sekans primerine (mavi) ait olan ortak gen bölgeleri ... 43
Resim 3: Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu (1) ... 55
Resim 4: Çalkalama işleminin uygulandığı shaker ... 56
Resim 5: Pyromark Q24 vakum çalışma istasyonu (2) ... 57
Resim 6: Pyromark Q24 PCR probu ... 58
Resim 7: Plaka tutucu ... 59
Resim 8: Isı bloğu ... 60
Resim 9: Pyromark Q24 Cihazı ... 60
Resim 10: Pyromark Q24 Kartuş ve Dağılımı ... 61
Resim 11: Pyromark Q24 Cihazına ait kartuş yerleşim konumu, dağıtım ünitesi ... 61
Resim 12: Pyromark Q24 Cihazına Ait İşlem Haznesi ... 62
Resim 13: Serum fizyolojikle hazırlanan direk mikroskobi preparatında Blastocystis protozoonu ... 65
Resim 14: Lugol solüsyonu hazırlanan direk mikroskobi preparatında Blastocystis protozoonu ... 66
Resim 15: Ringer’s solüsyonunda üretilen Blastocystis protozoonunun kültür solüsyonundan yapılan direk mikroskobisindeki görünümü. ... 66
VI
Resim 16: SB83 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T5, T6, T8, T17, T20, T37, T46, T109 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 1 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol ... 70 Resim 17: SB340 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T7, T17, T34, T39, T41, T43, T54, T70, T71 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 2 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol ... 70 Resim 18: SB227 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası PK, T12, T15, T25, T32, T89, T101, T117, T154, T179 örneklerine ait jel elektroforez görüntüsü ( subtip 3 ) M: moleküler ağırlık standartı (Marker) PK: pozitif kontrol ... 71 Resim 19: SB82, SB227, SB340 primeri kulanılarak yapılan Konvansiyonel PZR sonrası mix subtip olarak saptanan T17 subtip 1 ve 2 , T39 subtip 2 ve 3 ve T43 subtip 2 ve 3 olarak genotiplendirilen örneklere ait jel elektroforez görüntüsü M: moleküler ağırlık standartı (Marker) ... 71
VII
Şekiller
Şekil 1: Blastocystis yaşam döngüsü. ... 9
Şekil 2: Serbest kalan pirofosfatlar ... 63
Şekil 3: Sülfiraz ve lusiferaz aktivitesi ... 63
Şekil 4: Apiraz aktivitesi ... 63
Şekil 5: T42 numaralı örneğe ait NanoDrop analiz ekranı görüntüsü ... 67
Şekil 6 : Pyromark Q24 cihazına ait Pyromark 2.0.6 analiz programının ekran görüntüsü ... 73
Şekil 7: Pirosekans yöntemi ile düşük kalite olarak genotiplendirilmesi yapılan T32 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 74
Şekil 8: Pirosekans yöntemi ile düşük kalitede olarak genotiplendirilmesi yapılan T148 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 75
Şekil 9: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 1 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T1 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 76
Şekil 10: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 2 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T7 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 76
Şekil 11: Pirosekans yöntemi ile birebir dizayn edilen subtip 3 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T117 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 77
Şekil 12: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 1 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T5 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 77
VIII
Şekil 13: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 2 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T4 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 78 Şekil 14: Pyromark Q24 protokolüne göre kontrol edildiğinde birebir dizayn edilen subtip 3 dizisi ile uyumlu olarak genotiplendirilmesi yapılan T168 nolu DNA örneğinin nükleotid dizilerinin gösterilmesi ... 78
IX
Tablolar
Tablo 1: Konvansiyonel PZR sırasında kulanılan STS primerlerinin dizileri
... 37
Tablo 2: PZR reaksiyon karışımı ... 38
Tablo 3: STS 1-3-5 amplifikasyonu için reaksiyon şartları ... 39
Tablo 4: STS 2-4-6-7 amplifikasyonu için reaksiyon şartları ... 39
Tablo 5: Pirosekans Subtip Dizileri ... 42
Tablo 6: 2x PyroMark PCR Master Mix içeren reaksiyon karışımı ... 53
Tablo 7: PZR amplifikasyonu için reaksiyon şartları ... 54
Tablo 8: Kullanılacak bağlanma tamponu, streptavidin, RNase-serbest su ve PCR ürün miktarları ... 56
Tablo 9: Annealing Buffer ve Sekans Primeri Miktarları ... 59
Tablo 10: Kappa Testi Değer Aralığı ... 64
Tablo 11: Örneklerin ekstraksiyon sonrası DNA miktarları (ng/μl) ... 68
Tablo12: Çalışmaya dahil edilen örneklerin PCR reaksiyonu sonrası Subtip dağılımı ... 69
Tablo 13: Çalışmaya dahil edilen örneklerin pirosekans sonrası subtip dağılımı ... 72
Tablo 14: Blastocystis örneklerinin Konvansiyonel PZR ve Pirosekans Sonuçları ... 79
Tablo 15: Blastocystis saptanmasında iki farklı moleküler yöntem olan Pirosekans ve Konvansiyonel PZR ’nin uyumu ... 80
X
Semboller , Kısaltmalar DNA: Deoksiribonükleik Asit
PZR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
RFLP: Restriction Fragment Length Polimorphism B. hominis: Blastocystis hominis
PBS: Phosphate Buffered Saline
TRİS: Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane EDTA: Etilen Diamin Tetra Asetik Asit TE: Tris, EDTA Buffer
Rpm: Revolutions per minute TBE: Tris-Borate-EDTA Bp: Base Pair (baz çifti) ml: Mililitre
µl: Mikrolitre
dNTP: Deoksiribonükleotid Trifosfat
1
1. GİRİŞ
Paraziter hastalıkların tüm dünyada yaklaşık dört milyar insanı etkilediği tahmin edilmektedir.¹ Bu hastalıklar, özellikle hijyen ve sanitasyonu, sosyoekonomik düzeyi, eğitim durumu ve yaşam standartları düşük olan toplumları ciddi şekilde tehdit etmektedir.2
Yapılan çalışmalarda Blastocystis’ in sağlıklı bireylerde ve gastrointestinal semptomu olan hastalarda en sık görülen protozoon olduğu bildirilmiştir.³ Patojenik potansiyeli tartışmalı olmakla birlikte hem semptomatik hem de asemptomatik bireylerde varlığı tespit edilmişitir.4
Blastocystis insanlarda ve hayvanlarda görülmekte olan bir bağırsak parazitidir. Gelişmiş ülkelere oranla gelişmekte olan ülkelerde
%30-50 oranlarında yaygınlığa sahiptir.5
Birçok durumda Blastocystis’ in tek başına patojen olduğu
olgular bulunmaktadır. Tanısı genel olarak ışık mikroskobu ile yapılır.
Boyutları değişen şekillerde avakuoler, vakuoler, granular, multivakuoler, ameboid ve kist formları mevcuttur.6 Transmisyon elektron mikroskobisi özellikle çok yağ ve glikojen deposu olan atipik Blastocystis kistlerini ayırt etmede kullanılabilir.7
Alt türe özgü tanı primerleri olan STS (sequence tagged site) primerlerinin Yoshikawa tarafında Blastocystis’ in alltür tayini için dizayn edilmesi araştırma yöntemlerinin ilerlemesine çok hızlı bir yön kazandırmıştır.8 Diğer moleküler araştırma yöntemleri arasında RFLP, DNA dizi analizi, DNA barkoding, gerçek zamanlı PZR ve nested PZR bulunmaktadır.9
2
Konvansiyonel PZR yönteminin çeşitli dezavantajlara sahip olması Blastocystis çalışmalarında da farklı yöntemlerin denenmesine olanak sağlamıştır. Son zamanlarda kullanımı iyice artan ve özellikle viral etkenlerin tanısında sık kullanılan pirosekans yöntemi birçok moleküler yöntemin aksine hızlı, zahmetsiz ve spesifik sonuçlar elde edilmesine olanak tanıyan bir DNA dizi analiz tekniğidir.10
Bakteriyel ve fungal etkenlerin tanısında da sık kullanımı olan pirosekans yönteminin parazitolojik araştırmalarda kullanıldığı az sayıda çalışma mevcuttur.11 2007 yılında Stensvold ve ark. Blastocystis genotiplendirmesini pirosekans yöntemini kullanarak gerçekleştirdikleri bir çalışma bulunmaktadır.12
Çalışmamızda son yıllarda rutin tanıda da kulanılmaya başlanmış olan ikinci jenerasyon DNA dizi analiz yöntemi olan pirosekans yönteminin Blastocystis protozoonunun alttür tayininin belirlenmesinde kullanımı amaçlanmıştır. Konvansiyonel PZR yönteminin kontaminasyon riski taşıyan emek yoğun ve zaman alıcı bir yöntemdir. Blastocystis’in altürlerinin belirlenmesinde STS primerleri kullanılarak yapılan konvansiyonel PZR ile yedi alttür tayini yapılmaktadır. Çalışmamızda kültür (Ringer’s solusyonu) ile elde edilen 60 Blastocystis izolatının STS primerleri kullanılarak konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemi ile alt türleri belirlenmiştir. Bu çalışma ülkemizde pirosekans yöntemiyle Blastocystis alttürlerinin belirlendiği ilk çalışma özelliğindedir.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Blastocystis
Blastocystis’ in patojen olduğunu söylemek için klinik belirtilere neden olabilecek başka bir protozoon, bakteri ve viral etken görülmemesi gerekmektedir. Bakteriyel ve viral ajanlar olmaksızın, fazla sayıda Blastocystis var ise bunun patojeniteden sorumlu olduğu düşünülmektedir.13
Blastocystis uzun yıllar sınıflandırılamamış, kimi yazarlarca mantar, kimi yazarlarca protozoon sınıflamasına dahil edilmiş olan bir mikroorganizmadır. Ancak protozoon besiyerinde üremesi, mantar ve bakteri besiyerinde üreyememesi; protozoonlara etkili ilaçlara duyarlı olup, amphoterisine dirençli olması; hücre çeperinin protozoonlara benzeyip, yavaş hareket eden pseudopodlarının olması gibi nedenlerle bugün protozoon olarak kabul edilmektedir.14
Blastocystis enfeksiyonu, fekal-oral yolla bulaşmaktadır;
genellikle asemptomatiktir. Semptomatik olgularda ishal, karın ağrısı, kramp, bulantı, kusma, ateş, şişkinlik, gaz, kaşıntı, kilo kaybı, dışkıda lökosit, rektal kanama, eozinofili, anemi görülebilmektedir. Blastocystis gelişmekte olan ülkelerde yaşayanlarda gelişmiş ülkelere oranla daha sık görülmektedir.14
Son yıllarda yapılan çalışmalar ile bulaş yolları aydınlatılmıştır. İnsan-insan , hayvan-hayvan , insan-hayvan , hayvan- insan geçişleri moleküler yöntemler kullanılarak gösterilmiştir. Hayvan bakıcılarında %41 gibi yüksek oranlarda belirlenmesi Blastocystis türlerinin aynı zamanda zoonotik özellik taşıdığını göstermiştir.15
4
Henüz insan ve diğer canlılarda Blastocystis’ in neden olduğu hastalık tablosu tam olarak tanımlanmamıştır. Gastrointestinal hastalıklarda ancak diğer infeksiyöz ve noninfeksiyöz nedenlerin eliminasyonu yapıldıktan sonra etken olarak sorumlu tutulabileceği belirtilmiştir. Fakat tümüyle diğer etkenlerin araştırılıp belirlenmesinin güç olması nedeniyle bu yaklaşım üzerinde tartışmalar sürmektedir.16
2.2. Tarihçesi
Sınıflandırması, yaşam döngüsü, biyolojik özellikleri, epidemiyolojisi, özellikle de patojenitesi açısından birçok bilinmezlik içeren, araştırmalar sonucunda farklı ve karşıt görüşlerin ortaya konulduğu Blastocystis, ilk defa 1911 yılında Alexeieff tarafından maya mantarı olarak tanımlanarak Blastocystis enterocola olarak isimlendirilmiştir.16
Brumpt, 1912 yılında farklı konaklarda Blastocystis’ in farklı türlerinin olduğunu belirtmiş ve insanlardan izole edilen türüne günümüzde de geçerliliğini koruyan Blastocystis hominis (B.hominis) denilmesini önermiştir.17
Taze dışkıda görülen Blastocystis nükleuslarının belirlenememesi, mantar görünümünde olması, ısıtılmadan psödopodların görülememesi, boyutlarındaki değişkenliğin herhangi bir protozoondan beklenenden çok daha geniş sınırlarda olması, tomurcuklanma ile üremesi nedeniyle önce mantar olarak düşünülmüştür. Özellikle tropikal ve subtropikal ülkelerde daha sık olarak rastlanılmakta tüm dünyada yaygın olarak bulunmaktadır.18,19
Blastocystis hakkında 1967 yılında Zierdt’ in bu patojenin çeşitli formları olduğunu tanımlanmıştır. Günümüze kadar olan süreçte,
5
Blastocystis’ in insanlarda patojen olduğuna dair oldukça fazla sayıda araştırma yayınlanmıştır.17
2.3. Taksonomisi
B.hominis, Zierdt tarafından 1988’ de protozoon olarak tanımlanmış ve Sarcodina subfilumunda sınıflandırılmıştır. Blastocystis mantar ve bakteri besiyerinde üreyememesine karşın barsak protozoonları için hazırlanan besiyerlerinde üremektedir. Kültürde ürerken bakterilere gereksinim duyması, aksenik olarak güç üremesi, 33°C altında çoğalamaması, 30°C altında ölmesi, amfoterisine dirençli, protozoonlara etkili ilaçlara karşı duyarlı olması protozoonlara daha yakın olduğu izlenimi vermektedir. Ayrıca hücre çeperinin protozoonlarınkine benzemesi, endodiyogeni ile çoğalması, yavaş hareket eden pseudopodlarının olması, önceden vakuol, bugün ise santral cisim olarak adlandırılan üreme organelinin varlığı nedeniyle protozoonlar içerisinde olması gerektiği ileri sürülmüştür.20
Sınıflandırması tartışılan B.hominis, yapılan moleküler çalışmalar sonucunda 1996 yılında Silberman ve ark.’ nın B.hominis SSUrRNA’sının sekanslanmasını gerçekleştirmeleri ile heterojen, tek ve çok hücreli protistaların (kahverengi algler, diatomlar, krizofitler, su küfleri gibi) yer aldığı Stramenopile grubunun içerisinde protozoon olarak tanımlanmıştır. Son olarak da Cavalier-Smith 1998’de Stramenopile’in Chromista aleminin altındaki Heterokonta bölümüyle (infrakingdom) identik olduğunu belirterek B.hominis’in Heterokontid Chromista olduğunu ifade etmiştir. Sarcomastigophora sınıfında, Blastocystea takımında Blastocystidae ailesinde Blastocystis cinsi ve hominis türü olarak tanımlanmaktadır.
6
Günümüzde Blastocystis alttürleri insan ve hayvanlarda da enfeksiyona neden olmaktadır. Bu sebeple isimlendirmesinde Blastocystis sp. kullanılmaktadır.23
2.4. Morfolojisi
Kültür ve direkt dışkı incelemelerinde Blastocystis’ in farklı morfolojik tipleri görülebilmektedir. Morfolojik formların nitelik ve patojenite ile ilişkisi henüz bilinmemektedir. Dışkı örneklerinde en sık olarak sırasıyla vakuoler, granüler, multivakuoler ve kist formunun görüldüğü bildirilmiştir.
Ameboid form çok nadir olarak bildirilmiştir. Avakuoler formun insan bağırsağında bulunduğu düşünülmektedir. Kültürde vakuoler ve granüler formun baskın olduğu, kültür ortamındaki değişikliklerin hangi türün görüleceğini belirlenmesini sağlayabileceği düşünülmektedir.20,22
Elektron mikroskobik incelemelerde, Blastocystis’ in tüm formlarında nükleusta elektron opak materyalin, nükleus kenarında kresentrik bant görünümünde yer aldığı tespit edilmiştir. Bu morfolojik görüntünün hücre döngüsünün evrelerinden veya fizyolojik koşullardan bağımsız olduğu da gözlenmiştir. Blastocystis’ in sitoplazmasında mitokondri benzeri organellerin farklı sayıda ve morfolojide olduğu, ayrıca diğer ökaryotik hücre yapıları olan golgi kompleks, endoplazmik retikulum, poliribozomların da görüldüğü belirtilmiştir.24
1. Vakuoler form (Santral cisim): Tipik Blastocystis formu olup rutin tanıda ışık mikroskobunda aranan ve tanınan formdur. Kültürde de en sık bu form görülmektedir. Daha çok yuvarlak veya hafif düzensiz çeperli olup boyutları da farklı çaplarda olabilmektedir (2-200 μm). Dışkı örneklerinde yaklaşık olarak ortalama 4 - 15 μm boyutunda görülmekte, daha geniş çaplar kültürde bulunabilmektedir.22,24
7
2. Granüler form: Morfolojik olarak vakuoler form ile benzer özellik taşımakla birlikte santral vakuol içeriği farklılık göstermektedir. Boyutları 6,5 - 80 μm arasında değişmektedir.20 Granuler form, vakuoler forma benzer. Ancak morfolojik ve sitokimyasal olarak değişik merkezi vakuol içeriğine sahiptir.25
3. Multivakouler form: Dışkı materyalinden alınan formda, kültürden gelen formdaki tek büyük vakuol yerine çok sayıda, değişik büyüklük ve morfolojide vakuoller bulunabilmektedir.26,27 Özellikle taze dışkı örneklerinde görüldüğü belirtilmiştir. Boyutları 5 - 8 μm olup sitoplazmasında çok sayıda küçük vakuoller içerdiği bildirilmiştir. Kültür ortamında vakouler veya granüler forma dönüşebilmektedir.20,24
4. Avakuoler form: Oldukça nadir rastlanan bir form olarak bilinmektedir. Boyutu 5 μm civarında olup yüzey örtüsü ve vakuolü yoktur.24 Avakuoler formlarda organel matrikse uzanan sayısız krista bulunmaktadır. Kültür formlarda bu yapılar oldukça az sayıdadır ve kısa tübüler veya kesecik şeklindedirler. Avakuoler formlarda mitokondri benzeri organeller diğer formlardakilere göre daha az elektron opaktır. Bu farklılıkların anlamı henüz bilinmemektedir.26,27
5. Kist formu: Blastocystis ’ in kist benzeri formu ilk kez Melhorn tarafından AIDS’li bir hastanın dışkısında bulunmuştur.28 Kist / kistik / dirençli form da denilmektedir. Blastocystis’ in kist formu kültürdeki vakuoler ve granuler formlardan ve genelde taze dışkı örneklerindeki multivakuoler formlardan küçüktür.29 Kalın çok katmanlı bir duvar organizmayı çevreler. Boyutu 3-10 μm olup sıklıkla da 5 μm’ den küçük olarak görülmekte ve ışık mikroskobu ile tanımlanmasının zor olduğu
8
bildirilmektedir. Sitoplazmasında içeriği glikojen ve lipid olan çok sayıda vakuol içermektedir.22,24
6. Amoeboid form: Santral vakuol yoktur ve hücre merkezine yakın bir veya iki nükleus vardır. Hücreler Blastocystis’ in diğer formlarında görünen morfolojik özelliklerin çok azını taşımaktadır.30 Amoeboid / amoebiform denilen bu formun boyutu 3 – 8 μm olup psödopodlar yaparak bakteriler ile beslendiği ileri sürülmektedir.20,22,24
2.5. Yaşam Döngüsü
Çeşitli yaşam döngüleri ileri sürülmüş fakat hiçbiri in vivo ve in vitro olarak doğrulanamamıştır. Işık ve elektron mikroskobunda en iyi gösterilmiş üreme şekli (özellikle kist formunda) binary füzyon/ikiye bölünmedir. Vakuoler formun multivakuoler formdan, vakuollerin genişlemesi veya birleşmesiyle oluştuğu gösterilmiştir. Granüler formun kültür ortamında ortam koşullarının değişmesiyle vakuoler formdan oluştuğu gösterilmiştir.
9 Şekil 1: Blastocystis yaşam döngüsü.31
Blastocystis’in infektif formunun kist formu olduğu düşünülmekte ve oral yolla alınan kistlerin bağırsakta ekskiste olarak enfeksiyonun oluştuğu belirtilmektedir. Yaygın olarak kabul gören yaşam döngüsünde iki farklı kist yapısının olduğu, ince duvarlı kist yapısının otoenfeksiyondan, kalın duvarlı kist yapısının ise dışkı ile dışarı atılarak su ve besinlerin kontaminasyonundan sorumlu olduğu belirtilmektedir.
Vakuoler form bağırsaklarda ya multivakuoler forma dönüşerek prekist formu oluşturup şizogoni ile ince duvarlı kist yapısının oluşumuna ya da amoeboid forma dönüşüp prekist oluştuktan sonra şizogoni ile kalın duvarlı kistlerin meydana gelerek dışkı ile atılmalarıyla sonuçlanan yaşam döngüsünde yer almaktadır.27,32
10
İnsan vücudunun Blastocystis in kist duvarını eritebilecek enzimleri vardır ve mide asidi veya barsak enzimleri olmadan da kist duvarı çözülüp yavru hücreler serbestleşebilir. Kist formundaki sitoplazmik görünüm bağırsaklarda bulunan avakuoler formunkine benzer. Kistler taze dışkı materyalinden çok, beklemiş dışkı materyallerinde görülür. Bu bulgu, kist formunun oluşumunun, konaktan çevre koşullarına geçişe verilen bir yanıt olabileceğini göstermektedir.33
2.6. Epidemiyolojisi
Fekal-oral yolla bulaşan Blastocystis tüm dünyada, özellikle tropikal ve subtropikal bölgelerdeki ülkelerde, gelişmekte olan ülkeler ve hijyen koşullarının düşük olduğu toplumlarda % 50’ ye varan oranlarda, gelişmiş ülkeler ve hijyen koşullarının iyi olduğu toplumlarda yaklaşık % 10 oranında saptandığı bildirilmektedir. Yapılan çalışmalarda gastrointestinal semptomu olan hastalarda ve sağlıklı bireylerde en sık görülen protozoon olduğu bildirilmiştir.34
Tüm dünyada görülen bir parazit olup özellikle tropikal ve subtropikal bölgelerde daha sıktır. Prevalansı gelişmiş ülkelerde % 1,5 ile
% 10, gelişmekte olan ülkelerde ise % 30 ile % 50 arasında değişmektedir.35
Son yıllarda prevalans çalışmaları önemli bir artış göstermiş, Bu çalışmalarda, Blastocystis’ in genotip dağılımına ışık tutmuştur.3
Ülkeden ülkeye ve aynı ülkenin farklı bölgelerinde prevalansı değişmektedir. Hayvanlar ve insanlarda kötü hijyen koşulları, kontamine yiyecek veya su ve tüketimine bağlı olarak görülme sıklığı artmaktadır.20
11
Blastocystis alttür dağılımı Türkiye'de, diğer ülkelerde görülen alttürlerine büyük bir benzerlik taşımaktadır. Özyurt ve ark.
çalışmasına göre prevalansı daha önce yapılmış mevcut çalışmalarla benzerlik göstermektedir. İnsanda Blastocystis enfeksiyonlarından özellikle subtip 3’ ün , ayrıca subtip 1, 2 ve 4 ün de izole edildiği tespit edilmiştir. Subtip 5-9 un insanlarda enfeksiyona nadiren neden olduğu gösterilmiştir.37
Kaya ve ark.'nın yaptıkları bir başka çalışmada; Blastocystis ile birlikte bağırsak semptomlarının sıklıkla görüldüğü, olası diğer etkenlerin elimine edilmesi durumunda Blastocystis’ in de patojenite açısından değerlendirilmesinin yararlı olacağı bildirilmiştir.38
İnceboz ve ark; İzmir bölgesinde gastrointestinal şikayetler ile hastaneye başvuran çocukların %15,5’inde Blastocystis saptamıştır.39
İrritabl bağırsak sendromu (IBS) olan hastaların (150 olgu)
% 32’ sinde mikroskobik inceleme, % 46’ sında ise kültürle Blastocystis saptanmış, IBS’lu olmayan ishalli kontrol grubunda ise bu oran % 7 olarak belirlenmiştir. Blastocystis’in IBS etyolojisinde rol oynayabileceği hipotezi ortaya çıkmıştır.4
Türkiye’ de Blastocystis prevalansı % 1,4 -% 44,3 arasında bildirilmektedir. Çalışmalar incelendiğinde bazı araştırıcıların X40 objektifle incelenen mikroskop sahasında beş ve daha fazla sayıda Blastocystis’ i bildirdikleri, bazılarının ise sayıyı dikkate almadan bildirim yapmaları prevalansın geniş sınırlarda yer almasının sebebi olarak görülmektedir.40,41
12
2.7. Patogenez
1967 yılında, Zierdt ve ark. Blastocystis’ in bir protozoon olduğunu kanıtlamasından günümüze kadar Blastocystis’ in insanlarda potansiyel patojen olduğunu bildiren bir çok çalışma yayınlanmıştır.17,42
Blastocystis türlerinde antijenik ve genetik olarak heterojenitenin gözlenmesi, virulan ve avirulan kökenlerin olabileceğini düşündürmekte ve farklı Blastocystis türlerinin insanda enfeksiyon yapabileceğini olası kılmaktadır. Farklı serotiplerin, patojenik olarak farklı düzeylerde etkili olabileceği görüşü de mevcuttur.42,43,44
Zuckerman ve ark. radyoaktif bir belirteç kullanarak yaptıkları araştırmada, Blastocystis enfeksiyonu olan hastalarda bağırsak geçirgenliğinin bozulduğunu göstermiştir.45
Henüz insan ve diğer canlılarda Blastocystis’ in neden olduğu hastalık tablosu tam olarak tanımlanmamıştır. Gastrointestinal hastalıklarda ancak diğer infeksiyöz ve noninfeksiyöz nedenlerin eliminasyonu yapıldıktan sonra etken olarak sorumlu tutulabileceği belirtilmiştir. Fakat tümüyle diğer etkenlerin araştırılıp belirlenmesinin güç olması nedeniyle bu yaklaşım üzerinde tartışmalar sürmektedir. Yeterli sayıda olgu-kontrol çalışmalarının yapılmamış olması olguların seçimi ve sonuçların yorumundaki zorluğa neden olmaktadır. Bazı araştırıcılar Blastocystis’in patojen olmadığını, semptomatik olgularda saptanmasının bu protozoonu sorumlu kılmaya yetmediğini, oluşan semptomların eşlik eden patojenlerle ya da nonenfeksiyöz nedenlerle ilişkili olduğunu öne sürmüşlerdir.16
13
Blastocystis enfeksiyonu olan insanlarda, serum IgG yanıtı saptanmamıştır. Kist formun dış katmanına karşı IgG2 yanıtı geliştiği ve irritabl kolon sendromlu hastalarda bu yanıtın daha şiddetli olduğunu bildirmiştir.7
Long ve ark. yaptığı çalışmada Blastocystis’ in IL-8 ve granulosit-makrofaj koloni sitimülasyon faktörlerinde 24 saat sonunda artışa neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca Blastocystis’in enfeksiyonun başlangıç aşamasında konağın bağışıklığını düşürerek diğer fırsatçı patojenlerin konakta enfeksiyona sebep olmasını kolaylaştırdığı gözlemlenmiştir.46
Blastocystis’in patojenitesini ve virülans faktörlerini belirlemeye yönelik yapılan çalışmalarda, parazitin belirli hücre dizilerinde (HT-29 kolon epitel hücre dizisi) sitopatik etki yapabildiği ve yine bu hücrelerden proinflamatuvar bir sitokin olan IL-8 ve GM-CSF üretimini indüklediği belirlenmiştir.47,48
Çeşitli sayıda çalışma Blastocystis’in patojenik belirsizliğinin olduğunu göstermektedir. Ayrıca Blastocystis‘ in konaktaki yoğunluğu ve farklı alttürlerin patojenik etkisini konağa bağlı olduğunu gösteren çalışmalar da mevcuttur. Blastocystis immün sistemi baskılanmış olan HIV li hastalarda tedavi edilmesi açısından klinik öneme sahiptir.49
2.8. İmmünolojik Özellikleri
Araştırıcılar koruyucu immüniteye bağlı olarak bazı hastalarda kendini sınırlayan Blastocystis enfeksiyonu olduğunu ileri sürmüşlerdir. Geç çocukluk ve erişkinlik dönemlerinde enfeksiyon hızının düşük olması daha önce geçirilen enfeksiyon ile immün yanıtın aktive
14
edildiğini göstermektedir. Bazı çalışmalarda ise erişkinlerde yüksek enfeksiyon hızı saptanmıştır. Toplumda Blastocystis’e karşı kazanılmış koruyucu bağışıklık ve doğuştan bağışıklık ile ilgili bilgiler sınırlıdır.50
Antikor yanıtının olmadığını savunan görüşlerin yanında IBS olan ve Blastocystis enfeksiyonu saptanan hastalarda IgG2 subtipinin kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Bu antikorun, lenfosit ve makrofajlara sunulmak üzere bağırsaklardaki Peyer plaklarında bulunan M hücreleri tarafından taşınan, parazitin yüzey çeperindeki yapılara karşı oluştuğu ileri sürülmüştür.51
Blastocystis enfeksiyonlarına konak yanıtının araştırılmasında uygun hayvan modeli geliştirilmesinin büyük yarar sağlayacağı belirtilmiştir.22 Ratların Blastocystis enfeksiyonuna daha duyarlı oldukları, fare, hamster ve tavşanın ise uygun model olmadığı gösterilmiştir.52,53
Blastocystis ’in yüzey çeperindeki karbonhidrat epitoplarına karşı spesifik IgM tipinde monoklonal antikor yanıtı oluştuğu yapılan araştırmalarda gösterilmiştir. Bu monoklonal antikorlardan bir kısmının B.hominis’in yüzey çeperindeki epitoplara spesifik iken, bir kısmının santral cisme bağlanarak aynı zamanda başka Blastocystis kökenleri ile de çarpraz reaksiyon verdiği tespit edilmiştir. Bu durumda yüzey çeperindeki antijenik yapıların türe spesifik, santral vakuoldeki yapıların ise cinse spesifik olduğu görüşü ileri sürülmüştür. Enfekte hastalarda esas immun yanıtın yüzey çeperi karbonhidratlarına karşı olduğu ve yüzey çeperinin Blastocystis paraziti için immünolojik yanıta karşı bir bariyer görevi yaptığı da bildirilmiştir.54,55
15
Blastocystis ’e karşı sitotoksik özellik taşımayan bu mAb yanıtının yanında, sitotoksik özellik taşıyan ve spesifik olarak 30kDa plazma membranı ilişkili proteine bağlanan sitotoksik mAb (ID5) ile ilgili yapılan araştırmada ID5 epitopunun tür ve izolat spesifik olduğu belirlenmiştir. Blastocystis’ in bu sitotoksik mAb ile yapılan uzun süreli kültürlerinde, bazı kökenlerde sitotoksik etkinin meydana gelmediği gösterilmiştir. Bu durum 30 kDa proteininin tüm izolatlarda olmaması nedeniyle fonksiyonel öneme sahip olduğu ve kökenlerin ID5 duyarlı ve dirençli olarak ayrılabileceği şeklinde açıklanmıştır.44,56,57
Blastocystis’in hücre yüzeyinde bulunan karbonhidrat yapısındaki antijenlerin, antikor oluşumunu sağladığı belirlenmiştir. Henüz antijen yapıları konusunda bilgiler yetersiz olup, subtipler arasında ortak antijenlerin ve subtiplere özgü antijenik yapıların tespit edilmesine yönelik çalışmalar, özellikle serolojik tanı araçlarının geliştirilmesinde ve tedavi yaklaşımlarının belirlenmesinde büyük yarar sağlayacaktır.9
2.9. Klinik
Klinik olarak, sulu diyare, karın ağrısı, karında şişkinlik hissi, gaz yakınmaları, mide bulantısı, kabızlık, iştahsızlık, kilo kaybı, fekal lökosit, rektal kanama, anemi, kaşıntı, kanda % 4-12 oranında eozinofili görülebilmektedir. Blastocystis saptanan hastalarda rektal kanama, anemi ve inflamatuar semptomlar, düşük hemoglobin ve hematokrit değerlerine yol açmaktadır.13,58
Akut gastroenterit olgularında, örnekler Trikrom boyası ile boyandığında % 15-20’den % 60’ a varan oranlarda Blastocystis görüldüğü bildirilmiştir.38
16
Blastocystis ’e bağlı olduğu düşünülen enfeksiyonlarda semptomlar kendisine özgü değildir. En sık görülen belirtiler arasında ishal, abdominal ağrı ve kramplar, rahatsızlık hissi ve bulantı yer almaktadır. Akut olgularda fazla miktarda su gibi ishal tarif edilmiştir.
İştahsızlık, yorgunluk ve gaz gibi diğer şikayetler de gözlemlenmiştir.59
Bazı olgularda ateş, rektal kanama, eozinofili, hepatomegali ve splenomegali, deri döküntüleri ve kaşıntıya rastlandığı bildirilmektedir.60
Semptomsuz enfeksiyonların tahmin edilenden daha fazla olduğu düşünülmektedir. Çünkü tanıda Blastocystis’ in tüm formlarına bakılmamakta ve bazı araştırmalarda tanı kriteri olarak X40 büyütme ile
“her sahada 5 ve üstü sayıda Blastocystis formlarının varlığı” enfeksiyon olarak kabul edilmektedir.61
2.10. Tedavi
Blastocystis tedavisinde tercih edilecek seçenekler metronidazol ve nitroimidazoller, mümkün olan ülkelerde ise iyodokinolondur. Tedavi başarısız olursa daha ileri tedavinin seçimi ampiriktir.Ko-trimoksazol, trimetoprim-sülfametaksazol veya aminoglikozid, paromomisin ikinci tedavi seçeneği olarak en uygun seçimdir. Kemoterapi, semptomu olmayan hafif veya geçici semptomları olan hastalar için önerilmez.36,62
Tedavide çok etkili veya orta düzeyde etkili furazolidon, kinakrin, ornidazol, tinidazol ve ketokonazol gibi ilaçlar da bildirilmiştir.63,64 Tedavi edilmeyen Blastocystis olgularında insan gastrointestinal sisteminde birkaç haftadan birkaç yıla kadar kaldığını bildiren raporlar mevcuttur.65
17
2.11. Tanı Yöntemleri
Diğer klinik laboratuvarların aksine, klinik parazitoloji laboratuarlarında bireysel değişiklikler ve kişisel değerlendirmeleri de içeren bir çok manuel test kullanılmaktadır. Geleneksel tanı yöntemlerinde deneyimli personel ve zaman önemli bir faktördür. Tanıda en çok kullanılan metod ışık mikroskobisinde incelemedir.66
Enfeksiyonun tanısında rutin dışkı muayenesinin dışında;
nativ-lugol , çoklaştırma yöntemi, Blastocystis kültürü, trikrom boyama yöntemi, modifiye Ziehl-Neelsen boya metodu kullanılmaktadır. Ayrıca immünolojik yöntemlerde indirek immun floresan antikor (İFA) ve ELİSA yöntemleri antikor belirlemede kullanılmıştır.67
Blastocystis’ in tanısı halen mikroskobi ve daha hassas olan kültür yöntemine dayanmaktadır.68
2.11.1. Mikroskobik Tanı
Tanıda en çok kullanılan metod ışık mikroskobisinde incelemedir. Bu aşamada yapılan nativ-lugol inceleme kolay olup en sık kullanılan yöntemdir. Boyalı preparat incelemesinin özellikle de trikrom boyama yöntemi ile hazırlanan preparat incelemesinin çok değerli olduğu belirtilmektedir. Ayrıca hematoksilen, Gram, Giemsa, Wright boyama yöntemlerinin de başarılı olduğu tespit edilmiştir.24
18
Resim 1 : Trikrom boyamada Blastocystis protozoonları. (Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Parazitoloji Laboratuvarında çekilmiştir.)
Işık mikroskobisinde 3-20 μm boyutlarında tek vakuollü ve bu vakolü çevreleyen dar sitoplazma içerisinde görülen 4 ila 6 noktasal yapı ve en dışta kalın bir duvar yapısı tipik görünümü oluşturmaktadır. Trikrom boyamada ise nativ-lugol inceleme ile gözden kaçan formlar görülebilir.
Küçük kırmızı boyanan nükleus ve mitokondri benzeri organeller, kırmızı veya yeşil boyanan vakuol ile özellikle kist formunda, yeşil boyanan kalın hücre duvarı görülebilir. Vakuolün içeriğine göre boyanma değişikliği gösterdiği bildirilmiştir. 24,69
Dışkı mikroskobisinde nadir, az sayıda orta yoğunlukta çok sayıda gibi kantitasyonun yapılması ve olgulardan farklı zamanlarda en az üç kez örnek alınarak incelenmesi, bu arada olguların diğer paraziter, bakteriyel ve viral etkenler açısından da değerlendirilmelerinin gerektiği belirtilmektedir.69
Blastocystis tanısı genellikle ışık mikroskobu ile özellikle vakuollü formunun görülmesiyle kolayca konur. Tanı koyarken
19
lökositlerden, Cryptosporidium spp. ve özellikle Entamoeba histolytica, Entamoeba hartmanii ve Endolimax nana gibi diğer protozoon kistlerinden ayırt edilmelidir. Distile su ve diğer protozoonlar için kullanılan konsantrasyon metodları, Blastocystis' in vakuollü, granuler ve multivakuollü formlarını parçaladığı için, bunun yerine izotonik tuzlu su kullanılmalıdır.70
2.11.2. Kültür
Kültür yapılmadan önce konsantrasyon metodlarının uygulanması, bazı araştırıcılar tarafından, hücrelerin parçalanmasına neden olduğu gerekçesiyle önerilmemekle birlikte bazı araştırıcılar konsantrasyon metodu ile başarılı olduklarını belirtmişlerdir.22,69,71,72
Bazı çalışmalarda kültürün mikroskobik incelemeye üstünlüğü gösterilmekle birlikte çok sayıda Blastocystis var ise kültürün başarılı olabileceği, bunun da mikroskobik inceleme ile tanınacağını belirten görüşlerde mevcuttur.5,71,72
Kültürde Blastocystis ’in üremesi için anaerobik ortam ve 37°C’lik ısı sağlanmalıdır. Boeck ve Drbohlav’ın yoğunlaştırılmış yumurtalı besiyeri, Dobell and Laidlaw besiyeri (ringer solüsyonu +%20 insan serumu+streptomisin sülfat), Diamond’s triptikaz serum monofazik besiyeri, Minimal essential medium (MEM)+%10 at serumlu, Iscove’s modified Dulbecco’s medium +%10 at serumu ve Ringer’s solusyonu kullanılan kültürler arasında belirtilmektedir.16
Araştırıcılar, bir çok rutin laboratuarında kullanılan direkt dışkı inceleme metoduna göre kültür metodunun daha özgül olduğunu saptamışlardır.73
20
2.11.3. İmmünolojik Tanı
Klinik tanıya yönelik uygun antikor ve immünolojik testler bulunmamaktadır. Fakat araştırma amaçlı indirekt immünfloresan antikor (IFA) ve ELISA yöntemleri Blastocystis antikor belirlemede kullanılmıştır.74
Blastocystis ile enfekte semptomatik ve asemptomatik olgular ile sağlıklı kontrol grubundaki olguların ELISA yöntemiyle serum ve dışkılarında anti- Blastocystis IgA ve serum IgG düzeyleri ile serum ve dışkıda Blastocystis antijenlerinin araştırıldığı çalışmada, semptomatik Blastocystis enfeksiyonu olan olgulardaki tüm antikor düzeyleri kontrollerden yüksek saptanmış olup, özellikle sekretuvar IgA’nın humoral IgA’dan daha yüksek düzeyde tespit edildiği belirtilmiştir. Dışkı ve serumda, spesifik antijenlerden, dışkıdaki daha yüksek olmak üzere, her iki antijen düzeyinin kontrollerden daha yüksek tespit edildiği belirlenmiştir.
Kontrol olgularında antikor yanıtı ve antijen saptanmamıştır.75
İnvaziv yöntemler olan endoskopi ve kolonoskopi ile tanımlanan olgular mevcuttur. Moleküler yöntemler ise araştırma amaçlı kullanılmaktadır.16
2.11.4. Moleküler Tanı
Blastocystis’in moleküler analizinde PZR, nested PZR, dideoksi sekanslama, RFLP, pirosekans yöntemleri kullanılmaktadır.23 Son yıllarda farklı mikroorganizmalar için kullanılmaya başlanmış olan pirosekans yönteminin Blastocystis genotiplendirmesinde kullanımına yönelik sadece bir çalışma mevcuttur.12
21
Blastocystis’in alttürlerini moleküler teknikler kulanmadan birbirlerinden morfolojik olarak ayırt etmek imkansızdır.76 Konvansiyonel PZR’nin doğrudan dışkı örneklerinde Blastocystis’ in tespitinde oldukça duyarsız olduğu, bu nedenle, moleküler analizini kolaylaştırmak için in vitro çoğaltma yöntemi hala yaygın olarak kullanılmaktadır.77,78
Yoshikawa ve arkadaşları tarafından geliştirilen sequenced- tagged site (STS) primerleri ile insan dışkısından izole edilen Blastocystis türlerinden güvenilir bir şekilde yedi farklı alttüre ayırt edilebilmektedir.79 Blastocystis alttür tayini için bu bölgeyi taramak amacıyla STS primerlerini geliştirerek, yedi farklı alttür tanımlanmasını olanak sağlamışlardır.23
Sequence-tagged site (STS); genomda tek kopya olarak bulunan kısa dizidir. STS içinde tekrarlayan diziler olmakla birlikte, her iki uç bölge iyi korunmuş benzersiz (unique) diziler taşır. Bu bölgeye yönelik primer geliştirilebilmesi için ilgili bölgenin (SSUrDNA) DNA dizi analizine gereksinim duyulur. Aynı tür içindeki farklı üyelerin veya yakın ilişkili türlerin çalışılması için iyi bir genetik araçtır.80
SSU-rDNA PCR-RFLP (riboprinting) analizi Blastocystis alttür tayininde tanıda hızlı, ucuz ve yaygın kullanılan diğer bir yöntemdir.
Fakat PZR ürünleri farklı restriksiyon endonükleazlar kullanarak farklı primerlerle amplifiye edildiğinde farklı yöntemlerin kullanıldığı çalışmalarla karşılaştırılması zordur. Ribodemlerin ortaya çıkarılmasında sadece iki veya üç enzimin kullanılması, aynı paterni gösteren ama farklı genetik sekanslara sahip izolatların tanımlanmasını güçleştirmektedir.81
DNA barkoding yöntemi ile Blastocystis SSU rDNA’ sının 5’
ucundaki yaklaşık 600 bç’ lik bölgenin dizi analizi, subtiplendirmede yararlı olabileceği saptanmıştır.82
22
RFLP yöntemi dideoksi sekanslama ve intragenik bölgelerin ard arda PCR’ına dayalı bir yöntemdir. PCR-RFLP analiz yöntemi Blastocystis ssrRNA gen bölgesinin dayalı olarak oluşturulmuştur ve amplifikasyondaki primerler arasında çeşitlilikler tanımlanmamıştır.23
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
1985 yılında Kary Mullis tarafından ilk kez bilim dünyasına sunulmuş olup, günümüzde modern bilime önemli katkılar sağlamıştır. Bu yöntem moleküler teknolojideki önemli gelişmelerden biridir.
PCR bakteri virüs mantar parazit ve protozoon gibi etkenlere ait hedef nükleik asit zincirlerinin ve primer adı verilen spesifik komplementer oligonükleotitler ve ısıya dayanıklı polimeraz enzimleri (Taq) kullanarak in vitro olarak çoğaltılmasını sağlayan oldukça özgün güvenilir bir moleküler tekniktir.83,8 Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), in vitro koşullarında DNA dizilerinin çoğaltılması esasına dayanmaktadır.
PZR; basit, spesifik ve hassas bir tekniktir. 85,86
Etken DNA’sının belirli bir bölgesinin nükleotid dizilerinin saptanmasında; Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), Jel elektroforezi kullanılarak gerçekleştirilir. PZR tekniği, temelde üç aşamadan oluşmaktadır;
DNA Zincirinin Açılması (Denaturation)
Kalıp DNA (template DNA), 92-95⁰C’ de 1-2 dakika tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçikleri birbirlerinden ayrılmaktadır. DNA
23
zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak gerekebilir.88
Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması (Annealing)
Reaksiyon sıcaklığının, 37-65⁰C’ ye düşürülerek oligonükleotid primerlerinin açılan DNA zincirlerinin kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması işlemidir. Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak 30-60 saniyede gerçekleşmektedir.87
Primer Uzaması (Primer Extesion)
DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polymerase) vasıtasıyla uzatılmasıdır. Taq DNA polymerase 72
oC sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır.84 PZR sonucunda elde edilen ürün, çoğaltılması hedeflenen DNA parçası ile iki primerin toplam uzunluğu kadardır. Üç basamaktan (denaturation, annealing, primer extension) oluşan işlem, bir PZR devrini temsil eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA parçacığı çoğaltılır. PZR sonucunda elde edilen DNA parçacıkları agaroz veya poliakrilamit jellerde yürütüldükten sonra, etidyum bromid (EtBr) ile gözlemlenir.88
Konvansiyonel PZR yöntemi yüksek duyarlılığına rağmen uzun işlem basamakları zaman kaybına yol açmaktadır. Blastocystis alt türlerinin tayininde çok sayıda Blastocystis izolatinin alttür tayininin yapılması her izolat için yedi farklı primer ile reaksiyon gerektirmektedir.
Uzun sürede gerçekleştirilip yoğun emek harcanan bir yöntem özelliği
24
taşımaktadır. Epidemiyolojik çalışmaların yapılmasında bu durum zorluk yaratmaktadır. Son zamanlarda bir çok alanda olduğu gibi parazitoloji alanında da gerçek zamanlı PZR ve DNA dizi analizinin kullanımı araştırıcılar arasında yaygınlaşmıştır.
DNA Dizi Analizi
DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır. Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.
Etken DNA’sının belirli bir bölgesinin nükleotid dizilerinin saptanması; Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), Dizileme (Sekans Reaksiyonu), Jel elektroforezi görüntüleme ve bilgisayarda değerlendirme ile gerçekleştirilir.
1965 yılında Robert Holley tarafından 74 nükleotidlik bir tRNA molekülünün dizi analizi yapılmıştır. 1977 yılında Allan Maxam- Walter Gilbert ve Frederick Sanger tarafından iki farklı DNA dizi analizi yöntemi bulunmuştur. 1982 yılında Akiyoshi Wada DNA dizi analizinin otomatik olarak yapılmasını önermiştir ve robotlar geliştirilmeye başlanmıştır.
1986 yılında California Teknoloji Enstitüsünden (Caltech) Leroy Hood ve Llyod Smith tarafından DNA dizi analizinde kullanılacak tam otomatik bir makine bulunmuştur. DNA dizi analizinde günümüzde birbirinden farklı iki yöntem kullanılmaktadır.
25
Bu iki yöntem;
1- Maxam ve Gilbert’in kimyasal kırılma yöntemi.89
2- Sanger-Coulson’un zincir sonlanma yöntemi.90
Bu iki yöntemden, Sanger – Coulson’un yöntemi günümüzde daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Allan Maxam ve Walter Gilbert ‘in geliştirdikleri yöntemin prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asit ’in, DNA’ da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotitlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır.91
Bu yöntemde, nükleotit dizisi saptanacak olan DNA önce 5’- ucundan P ile ya da floresan bir boya ile işaretlenir. DNA’ nın iki iplikciği birbirinden ayrılarak ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA’ nın yalnızca bir ucundan işaretlenmesi sağlanır. İkinci adımda ise DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A, C, G ya da T nükleotitlerini değiştirmek ve kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir. Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpde farklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir. Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5’- pozisyonlarından işaretli ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA fragmenti elde edilmiş olur. Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri, jel elektroforezi ile birbirlerinden büyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografi uygulanarak bantlar görüntülenir.92
Sanger metodu ile uzun DNA bölgelerinin dizilenmesi için dizileme öncesi uygulanması gereken koloni ve klonlama yöntemlerinin
26
çok uzun süre alan zahmetli işlemler olması bilim adamlarının alternatif yöntemleri araştırmaya sokmuştur.93
Otomatik DNA Dizi Analizi
İnsan Genom Projesi gibi büyük projeler çok sayıda DNA dizi analizi yapılmasını gerektirmektedir. Artan analiz sayısı, uzun zaman ve yüksek iş gücü gerektirir. Bu gelişmeler sonucunda otomasyon kaçınılmaz olmuştur. Otomatik DNA dizi analizleri zaman kazancı yanında, standart çalışma koşulları ve elde edilen sonuçların değerlendirilmesinde de yarar sağlamıştır.
Otomatik analizde de Sanger’ in enzimatik DNA sentezine dayanan zincir sonlanma yöntemi kullanılmıştır. Otomatik DNA dizi analiz cihazları basit olarak, sabit bilgisayarda yüklü programlar ile bu programların yönettiği elektroforez sistemini içerir. Elektroforetik ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile monokromatik bir ışık oluşturulur. Söz konusu DNA’ nın bulunduğu jelmatriks bu monokromatik ışık ile taranır.
Elektroforez süresince DNA’ ya bağlanan floresan boya ışık ile taranan bölgeye geldiğinde uyarılır. Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı geri yansıtır. Yansıyan bu ışık demeti bir detektör tarafından kaydedilir. Kaydedilen veriler bilgisayar programları ile değerlendirilerek sonuçlar grafiksel ya da matematiksel olarak bilgisayar ekranına aktarılır.91
Bu yöntem sayesinde, istenen DNA dizisinin nükleotid bazında içeriği saptanır. Primerler aracılığıyla uzatılan DNA dizisine eklenen her işaretli nükleotid yardımı ile DNA bölgesinin içeriği tespit edilebilir.
27
Pirosekans
Son yılardaki kayda değer teknolojik yenilikler karmaşık örneklerin daha önce görülmemiş hızda dizilenmesine olanak sağlamıştır.
Bu doğrultuda 1996’ da Rogaghi ve arkadaşları sentez yoluyla dizileme prensibine dayalı pirosekans metodunu geliştirmiştir.93
Pirosekans DNA polimerizasyon tepkimesi sırasında ortaya çıkan PPi tespitine dayalı gerçek zamanlı bir dizi analiz yöntemidir. İlk olarak bu yöntem DNA polimeraz aktivitesini izlemede kullanılmıştır.94
Etken DNA’sının belirli bir bölgesinin nükleotid dizilerinin saptanmasında; Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR), Dizileme (Pirosekans reaksiyonu), Bilgisayarda değerlendirme şeklindedir.
Sekanslama işlemi PZR ürünlerinin tek zincir DNA (ssDNA) ya dönüşmesi ile başlar. Tek sarmal DNA kalıp olarak kullanılmak üzere izole edilir, her bir primer çifti biotin ile 5' ucundan işaretlenir. Sekans primeri PZR ile çoğaltılmış olan bir tek zincir DNA ile hibridize edilir.94
Enzim olarak DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lüsiferaz ve apiraz kullanılır. Substrat olarak adenozin 5‘ fosfosülfat ve lusiferin ile inkübe edilir. dNTP (deoksiribonükleotid trifosfat) lardan ilki reaksiyona eklenir.95
Eğer dNTP kalıp DNA’ daki baza komplementer ise ortamda bulunan DNA polimeraz, bu dNTP’nin DNA sarmalına eklenmesini kataliz eder. dNTP DNA kalıbına bağlanırken dNTP üzerindeki 2 adet fosfat açığa çıkar ve ortama 2 fosfatlı bir yapı olan pirofosfat (PPi) ortama geçmiş olur.
28
Her nükleotid eklenmesinde bir pirofosfat serbest kalır. Ortama çıkan pirofosfat; ATP sülfiraz yardımı ile ATP’ ye çevrilir. Oluşan ATP’ nin yardımı ile lusiferin, oksilusiferin’ e dönüşür. Oksilusiferin ise görünür bir ışın yayar. Oluşan bu ışın miktarı ATP miktarı ile orantılıdır. Oluşan ışın CCD (kızıl ötesi) kamera ile tespit edilir ve seri tepecik şeklinde kaydedilir.
Işınların seri tepecik şeklinde kaydedilmesine program adı verilir. Işın programda bir yükseklik veya tepecik şeklinde görülür. Her bir tepeciğin yüksekliği eklenmiş olan nükleotid sayısıyla orantılıdır Işın miktarı ATP miktarı ile orantılıdır. Işın program’da bir yükseklik olarak görülür.
Nükleotid parçalayıcı bir enzim olan apiraz devamlı olarak ATP ve dNTP’
leri parçalar. Böylece ışık oluşumu kesilir. Yani ortamda yeni reaksiyon oluşturacak dNTP ve ATP kalmamış olur ve bu şekilde ortam ikinci nükleotidin ilave edilmesine hazırlanmış olur.95
Dört enzimin yer aldığı bu aşamalar kapalı bir sistemde, plakta ve tek bir kuyucukta yapılabilir. İşlemin süresi kısadır. Apiraz ATP’yi ve bağlanmamış olan dNTP’leri parçalar ışık kesilir. Reaksiyon solüsyonu yenilenir. Komplementer DNA zinciri yapılır. Nükleotid dizisi program’daki sinyal tepeciklerinden saptanır. Program’da iki kat yükseklik gösteren tepecikler eş iki nükleotidin ardarda bağlanması sonucu oluşmaktadır.95
Pirosekans yöntemi DNA sentezi esnasında açığa çıkan pirofosfatların saptanması esasına dayanan bir real-time (gerçek-zamanlı) kantitatif dizi analizi tekniği olması; konvansiyonel PCR yöntemine göre, uygulaması basit, kolay değerlendirilen, hızlı ve real-time (gerçek-zamanlı) olması nedeniyle tercih edilmektedir. Aynı zamanda jel elektroforezine gerek duyulmaması ile kapalı sistem PCR yöntemi olarak büyük avantaja sahiptir.96
29
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Örneklerin Toplanması
Çalışmaya Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarı ve Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuarına 2011-2012 yılları arasında rutin inceleme için gelen hastalardan alınan dışkı örnekleri dahil edilmiştir.
Dışkı örnekleri geniş ağızlı, kuru, temiz ve plastik kapaklı steril toplama kaplarına alındı. Mikroskobik olarak incelendi Blastocystis pozitifliği saptanan örneklerden, kültürde ( Ringer’s solusyonu % 10 at serumu ve % 0,05 asparajin) üremesi sağlanan suşların ekstraksiyon ile DNA izolasyonu yapıldıktan sonra konvansiyonel PZR ve pirosekans yöntemi ile tiplendirilmek üzere -20⁰C de muhafaza edildi.
3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler
3.2.1. Kullanılan Cihazlar
Santrifüj ( Boeco U-32 R, Almanya )
Mikrosantrifüj (Beckman Coulter, Almanya)
Spin Santrifüj (Biosan, Almanya)
Vorteks ( Boeco U-32 R, V1 Plus, Almanya )
Hassas Terazi ( Kern PFB, Almanya )
Etüv ( Nüve, Türkiye )
Işık Mikroskobu ( Olympus CX31, Japonya )
Biyogüvenlik kabini ( Metisafe Class 2, Türkiye )
Thermal Cycler, Gene Amp PCR System 9700 ( Applied Biosystems, ABD )
30
Otoklav ( Sanyo MLS-3020-U, Japonya )
Ben mari ( Techne TE-8J, İngiltere )
Mikrodalga Fırın ( Arçelik, Türkiye )
pH Metre ( Fisher Scientific, ABD )
Jel Görüntüleme Sistemi ( Uvitec Fine Reader, İngiltere)
NanoDrop ND1000 UV-Vis Spektrofotometre ( Thermo Scientific, ABD)
Soğutucu , 2-8⁰C ( Uğur, Turkiye )
Derin Dondurucu, -20 ºC ( Uğur, Türkiye )
Vakum Santrifüj ( Labconco, USA )
Elektroforez Güç Kaynağı ( Wealtec, Tayvan )
Elektroforez Tankı ( Agagel Mini Biometra, Almanya )
Mikropipet ; 0,5-10 µl’lik —10-100 µl’lik --100-1000 µl’lik ( Continental lab, Beta pette, Canada )
Steril pipet uçları ( Grainer Bio One, Almanya )
0,5-1,5 ml’lik Ependorf (Grainer Bio One, Almanya )
15-50 ml’ lik Grayner ( Grainer Bio One, Almanya )
Lam (Citoglas, Çin)
Lamel (18x18) Cover glass, Çin)
Cam Malzemeler
Thermal Cycler ( Sensoquest Labcycler, Almanya )
Pyromark Q24 Cihazı ( Cat. No. 9001514, Almanya)
Pyromark Q24 MDx Vakum İstasyonu (Cat. No. 9001518 [220V], Almanya )
PyroMark Q24 Kartuş ( Cat. No. 979302, Almanya )
Millipore Saf su Cihazı ( Merck, Almanya )
Euro-Line T-Shaker ( Almanya )
Spin Cihazı ( Combi –Spin FVL-2400N, Litvanya )
80 ⁰C’ye Ulaşabilen Isı Bloğu ( Wealtec HB-1,Tayvan )
31
PCR plakaları
Plaka mikseri
3.2.2. Kullanılan Kimyasalar
At serumu (Gibco, Almanya)
L-Asparajin (Merck, Almanya)
Sodyum klorür (Sigma, Almanya)
Kalsiyum klorür (Sigma, Almanya)
Potasyum klorür (Sigma, Almanya)
Toz halindeki iyot kristalleri (Sigma, Almanya)
Serum fizyolojik (Sigma, Almanya)
Steril distile su
EDTA (Applichem, Almanya)
Borik Asit (Applichem, Almanya)
Tris (Amresco, Canada)
Triton X-100 (Sigma, Almanya)
Orange G (Applichem, Almanya)
Glasiyel Asetik Asit (Merck, Almanya)
Etidyum Bromür (Sigma, Almanya)
Ultra distile Su (D. Zeydanlı, Türkiye)
Etil Alkol (Merck, Almanya)
Serum Fizyolojik (Sigma, Almanya)
Primerler: Thermo Scientific ( Almanya)
Size marker ( New England Biolabs, Almanya )
Hemo KlenTaq Reaction Buffer ( New England Biolabs, Almanya )
Tag DNA polimeraz ( Hemo KlenTaq, New England Biolabs, Almanya)
dNTP (Thermo scientific-Finnzymes,USA )
32
Marker, DNA Ladder (New England Biolabs, Almanya)
DNase, RNase Free Su
Annealing Buffer
3.2.3. Kullanılan Ticari Kitler
Pirosekans kit (Pyromark Q24 kit, Almanya)
DNAzol (MRCgene, Almanya)
3.3.Yöntemler
3.3.1. Direkt Mikroskobik İnceleme Solüsyonlarının Hazırlanışı
Direkt mikroskobi de kullanılan solüsyonlar aşağıdaki şekilde hazırlandı.
Serum Fizyolojik
NaCl 8.5 g.
Distile su 1000 ml.
Lugol’ un İyot Solüsyonu
Potasyum iyodür 10 g.
Kristal iyot 5 g.
33
Distile su 100 ml.
Tüm dışkı örneklerinden serum fizyolojik ve Lugol’ un İyot solüsyonu ile lam ve lamel arası preparatlar hazırlandı. Bu preparatlar, ışık mikroskobunda önce düşük büyütmeli, daha sonrada yüksek büyütmeli objektiflerde incelendi. Her preparat lökosit, eritrosit, protozoa kist ve trofozoitleri açısından değerlendirildi. Blastocystis açısından pozitif hasta örneklere ekstraksiyon için iki adet kültür yapıldı.
3.3.2. Kültür Solüsyonunun Hazırlanışı
Ringer’s Solüsyonu
Stok solusyon 10x olarak hazırlandı.
NaCl 86 g,
CaCl 3.3 g,
KCl 3.0 g,
Asparagine 5gr,
pH:7.2- 7.4
Karışım 1000 ml distile su ile tamamlandı ve otoklavlandı. 1X oranında dilüe edilerek kullanıldı.
34
Bu solüsyondan % 10 at serumu (56 ⁰C’de 30 dk inaktive edilmiş) içeren 1X’ lik kültürler hazırlandı. Çalışmaya alınan örneklerde Blastocystis pozitif örneklerin üretilmesi amacıyla kültüre alındı. Kültür için Ringer’s solüsyonu kullanıldı. Katı dışkı örneklerinden 2 gr, sıvı örneklerden 1 ml alınarak, graynerlardaki Ringer’s solüsyonunun içine ekimi yapıldı ve tüplerin ağzı sıkıca kapatıldı. Daha sonra 37 ⁰C’ lik etüvde inkübasyona bırakıldı ve 3 gün sonra üreme kontrolü için mikroskobik olarak değerlendirilmeye alındı.
Üreme kontrolü yapılan kültür örnekleri daha sonra ekstraksiyon öncesi DNA zol’ e ayrılması için ön işleme tabi tutuldu.
DNA Parçalama(Lizis)Tamponunun Hazırlanışı
40 mM sodyum sitrat %1’lik triton X-100
100ml için;
1,1646 gr sodyum sitrat ,
99ml steril distile su,
1 ml Triton X-100
4ml kültür solusyonu 4 katlı gazlı bezden yeni bir graynera süzüldü. Üzerine 10ml ye kadar Ringer’s solusyonu eklendi. Karışım süspanse edilip, 400 g’ de 10 dk santrifüjlendi. Süpernatan döküldü. Bu işlemler 2 kere tekrarlandı. Son uygulamadan sonra grayner içerisinde 1 ml kadar sıvı bırakıldı. Pellet ile süspanse edilip 1,5 luk kuru ependorfa
35
aktarıldı. Ependorflar 10.000 g de 2 dk santrifüj edildi, süpernatan döküldü üzerine 1-1,5 ml kadar 40 mM sodyum sitrat %1 lik triton X-100 ile muamele 30 sn bekletildi. Tüpler 500 g’ de 5 dk santrifüj edildi, ,süpernatan döküldü, 1ml DNA zol eklenerek 10 dk manuel olarak karıştırıldı ve ekstraksiyon işlemine tabi tutulana kadar + 4⁰C’de muhafaza edildi.
3.3.3. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)
3.3.4. Ekstraksiyon
TE Buffer Hazırlanışı
10 mM Tris HCl için 315.12 mg,
200 ml distile su,
1mM, 58.4 mg EDTA,
pH=8.0
Otoklavda steril edilerek buz dolabında saklanmıştır.
%100’ lük Etanol
Etil alkol (Absolute) 100ml
Buzdolabında +4º C’de saklanmıştır.
36
%75’ lik Etanol
Etil alkol (Absolute) 75 ml
Steril distile su 25 ml
Buzdolabında +4º C’de saklanmıştır.
Örneklerden DNA eldesi için DNA-zol ekstraksiyon yöntemi kulanılmıştır. Bu yönteme göre;
1. DNA zol deki kültür materyeli 10.000 g’de +4˚C’de, 10 dk santrifüj edildi.
2. Üst kısımda biriken tabakadan 500µl kadar toplandı ve başka ependorfa aktarıldı. Ependorfa DNA zol ile ½ oranında %’100 lük etanol eklenerek manuel olarak 8-10 kere karıştırıldı. DNA’nın kapak tarafına çökmesi için 1-3 dk kadar ters çevrilip bekletildi.
3. DNA görür halde ise pipet ucu yardımıyla başka bir ependorfa aktarıldı.
DNA görür halde değilse üst kısımda oluşan bulutlu tabakayı toplanarak başka ependorfa aktarıldı.
4. 5000g’ de 5 dk +4˚C’de derecede santrifuj edildi.
5. Üzerine -20˚C den %75’ lik etanol eklenerek manuel olarak 3-6 kere karıştırıldı. 1 dk DNA dibe çökmesi için tüp dik olarak bekletildi, 1000 g‘de +4˚C’de 2 dk santrifüj edildi. Bu basamak 2 defa tekrarlandı.
6. Süpernatan döküldü etanolün tamamen uzaklaşması için 500 g’de 5-10 dk vakum santrifüjünde örnekler santrifüj edildi.
7. 100 µl TE buffer( pH:8) eklendi.
8. Tüm DNA örnekleri, - 20 0 C’de saklandı.
